Đang tải... (xem toàn văn)
việc thu nhận trực tiếp các protein kháng nguyên từ L. monocytogenes gặp nhiều trở ngại do hiệu suất thấp, khó tinh sạch và không an toàn khi phải tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh. Do đó, kháng nguyên tái tổ hợp được biểu hiện bởi các hệ thống vi khuẩn phổ biến và an toàn hơn như B. subtilis và E. coli cần được nghiên cứu thay thế
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN LÊ TUẤN ANH TẠO KHÁNG NGUYÊN LISTERIOLYSIN O CỦA LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG BACILLUS SUBTILIS VÀ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số chuyên ngành: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN ĐỨC HOÀNG TPHCM, tháng năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh thầy cô thỉnh giảng tận tình truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt năm học Em xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn chân thành đến GS TS Trần Linh Thước, người truyền cho em lửa đam mê nghiên cứu khoa học Thầy gương sáng cho chúng em noi theo đường học tập nghiên cứu Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Đức Hoàng TS Phan Thị Phượng Trang, người thầy tận tâm hướng dẫn, định hướng truyền đạt cho em kinh nghiệm nghiên cứu vô quý báu, đồng thời hỗ trợ em trình học tập, nghiên cứu tạo điều kiện cho em phát huy tốt lực Cảm ơn thầy cô tất thành em đạt ngày hôm Cảm ơn anh, chị, bạn em làm việc Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học hỗ trợ, động viên suốt trình làm thí nghiệm, đồng thời chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu vui buồn công việc Cảm ơn thầy cô, anh chị tập thể cán PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Bộ môn Sinh hóa Bộ môn Vi sinh hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho em trình nghiên cứu Cảm ơn em Huy Hùng, Lê Lan bên cạnh anh, quan tâm chia sẻ vui buồn sống Và hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ba Mẹ gia đình, người bên cạnh con, yêu thương chỗ dựa vững cho bước đường mà chọn TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Nguyễn Lê Tuấn Anh Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Bệnh Listeriosis 1.1.3 Các phương pháp phát L monocytogenes 1.2 Protein Listeriolysin O (LLO) 1.2.1 Cấu trúc 1.2.2 Chức 10 1.3 Hệ thống biểu B subtilis 11 1.3.1 Chủng biểu 12 1.3.2 Vector biểu 14 1.4 Đáp ứng miễn dịch chủ động động vật thí nghiệm 16 1.4.1 Cơ chế đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể 16 1.4.2 Các phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chủ động phổ biến 18 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 21 2.1.1 Vật liệu sinh học 21 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 27 2.2 Phƣơng pháp 29 Trang i Mục lục 2.2.1 Tạo dòng vector biểu Listeriolysin O (LLO) B subtilis 29 2.2.1.1 Tạo vector pHT322 cho phép biểu protein LLO không dung hợp với đuôi tinh chế His-tag 29 2.2.1.2 Tạo vector pHT358 cho phép biểu protein LLO dung hợp với đuôi tinh chế His-tag 32 2.2.2 Tạo chủng B subtilis mang vector pHT358 kiểm tra khả biểu protein dung hợp 35 2.2.3 Khảo sát thông số nuôi cấy cảm ứng ảnh hưởng đến khả biểu protein dung hợp chủng B subtilis tái tổ hợp 36 2.2.3.1 Nhiệt độ 36 2.2.3.2 Nồng độ IPTG 37 2.2.3.3 Thời gian cảm ứng 38 2.2.4 Nuôi cấy cảm ứng biểu protein dung hợp sử dụng hệ thống lên men lít 38 2.2.5 Tinh chế protein 39 2.2.5.1 Tinh chế protein dung hợp LysSN-6xHis-TEVsite-LLO 39 2.2.5.2 Cắt loại bỏ đuôi dung hợp thu nhận protein LLO tinh 39 2.2.6 Gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO chuột thu nhận huyết 41 2.2.6.1 Gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO chuột 41 2.2.6.2 Kiểm tra kháng huyết chuột sau gây đáp ứng miễn dịch 43 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 Tạo dòng vector cho phép biểu protein LLO B subtilis 45 3.1.1 Tạo vector pHT322 45 3.1.2 Tạo vector pHT358 47 3.2 Tạo chủng B subtilis mang vector pHT358 kiểm tra khả biểu protein dung hợp 49 3.3 Khảo sát thông số nuôi cấy cảm ứng ảnh hƣởng đến khả biểu protein LLO dung hợp chủng B subtilis tái tổ hợp 50 3.3.1 Nhiệt độ nuôi cấy 50 Trang ii Mục lục 3.3.2 Nồng độ IPTG 52 3.3.3 Thời gian cảm ứng 53 3.4 lít Nuôi cấy cảm ứng biểu protein dung hợp hệ thống lên men 55 3.5 Tinh chế protein LLO 56 3.5.1 Tinh chế protein dung hợp LysSN-6xHis-TEVsite-LLO 56 3.5.2 Cắt loại bỏ đuôi dung hợp thu nhận protein LLO tinh 57 3.6 Gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO chuột thu nhận kháng huyết 59 3.6.1 Gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO chuột 59 3.6.2 Kiểm tra khả phản ứng kháng huyết chuột với protein LLO tái tổ hợp 61 3.6.3 Kiểm tra khả phản ứng kháng huyết chuột với dịch nuôi cấy vi khuẩn L monocytogenes 62 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 3.1 Kết luận 65 3.2 Đề nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 71 Trang iii Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số chủng B subtilis đột biến bất hoạt protease sử dụng lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp 13 Bảng 1.2: Vị trí tiêm thể tích tiêm thông dụng (ml) việc gây đáp ứng miễn dịch chủ động động vật thí nghiệm 20 Bảng 2.1: Trình tự mồi oligonucleotide cho phản ứng PCR dùng đề tài 22 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu TEV protease 40 Bảng 3.1: Kết đo OD600 dịch nuôi cấy B subtilis tái tổ hợp tương ứng với thời điểm lấy mẫu khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng lên biểu protein mục tiêu 54 Bảng 3.2: Giá trị OD450 trung bình thử nghiệm ELISA kiểm tra khả phản ứng kháng huyết chuột với dịch nuôi cấy L monocytogenes 63 Bảng 5.1: Kết theo dõi OD600 dịch nuôi cấy B subtilis tái tổ hợp hệ thống lên men lít theo thời gian 75 Bảng 5.2: Giá trị OD450 trung bình thử nghiệm ELISA kiểm tra khả phản ứng kháng huyết chuột với protein LLO tái tổ hợp 75 Trang iv Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn L monocytogenes Hình 1.2: Cấu trúc phân tử protein LLO Hình 1.3: Sơ đồ plasmid pHT01 16 Hình 1.4: Sơ đồ promoter Pgrac 16 Hình 1.5: Con đường hoạt hóa tế bào lympho B đáp ứng miễn dịch dịch thể 18 Hình 2.1: Sơ đồ vector pHT264 21 Hình 2.2: Các thang chuẩn sử dụng đề tài 26 Hình 2.3: Sơ đồ vector pHT322 29 Hình 2.4: Sơ đồ vị trí mồi cho phản ứng PCR thu gene hly 30 Hình 2.5: Sơ đồ vị trí mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pHT322 31 Hình 2.6: Tóm tắt quy trình tạo dòng vector pHT322 32 Hình 2.7: Sơ đồ vector pHT358 33 Hình 2.8: Sơ đồ vị trí mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pHT358 34 Hình 2.9: Tóm tắt quy trình tạo dòng vector pHT358 35 Hình 2.10: Tóm tắt quy trình thu nhận protein LLO tinh sau cắt loại bỏ đuôi dung hợp 41 Hình 3.1: Kết điện di DNA gel agarose 1% (A) Sản phẩm PCR thu gene hly; (B) Sản phẩm cắt mở vòng plasmid pHT264 45 Hình 3.2: Kết sàng lọc chủng E coli OmniMAX mang vector pHT322 phản ứng PCR khuẩn lạc 46 Hình 3.3: Kết điện di DNA gel agarose 1% (A) Sản phẩm PCR thu gene mã hóa đuôi dung hợp LysSN-6xHis-TEVsite; (B) Sản phẩm cắt mở vòng pHT322 48 Hình 3.4: Kết sàng lọc chủng E coli OmniMAX mang vector pHT358 phản ứng PCR khuẩn lạc 49 Trang v Danh mục hình Hình 3.5: Kết SDS-PAGE kiểm tra khả biểu protein dung hợp mục tiêu chủng B subtilis mang vector pHT358 50 Hình 3.6: Kết SDS-PAGE khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên biểu dạng tan protein dung hợp mục tiêu B subtilis tái tổ hợp 51 Hình 3.7: Kết SDS-PAGE khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG lên biểu protein dung hợp mục tiêu chủng B subtilis mang vector pHT358 52 Hình 3.8: Kết SDS-PAGE khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng lên biểu protein dung hợp mục tiêu chủng B subtilis mang vector pHT358 53 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn đường cong tăng trưởng chủng B subtilis tái tổ hợp nuôi cấy cảm ứng biểu hệ thống lên men lít 55 Hình 3.10: Kết SDS-PAGE kiểm tra việc tinh chế protein dung hợp 56 Hình 3.11: Kết SDS-PAGE kiểm tra phản ứng cắt protein dung hợp TEV protease thu nhận protein LLO tinh 58 Hình 3.12: Kết ELISA đánh giá hiệu gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO chuột 60 Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn khả phản ứng kháng huyết chuột với kháng nguyên LLO tái tổ hợp 61 Hình 3.14: Kết kiểm tra khả phản ứng kháng huyết chuột với dịch nuôi cấy L monocytogenes 63 Hình 5.1: Kết giải trình tự plasmid pHT322 mồi xuôi ON653 nằm đoạn gene hly đầu 5’ 71 Hình 5.2: Kết giải trình tự plasmid pHT322 mồi xuôi hly_F_seq nằm đoạn gene hly 72 Hình 5.3: Kết giải trình tự plasmid pHT322 mồi ngược ON314 nằm đoạn gene hly đầu 3’ 73 Hình 5.4: Kết giải trình tự plasmid pHT358 74 Trang vi Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ab Antibody Amp Ampicillin B subtilis Bacillus subtilis bp base pair CDC Cholesterol Dependent Cytolysin Cm Chloramphenycol DNA Deoxyribose Nucleic Acide dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate DTT Dithiothreitol E coli Escherichia coli ELISA Enzyme Linked ImunoSorbent Assay EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acide EGTA Ethylene Glycol Tetra-acetic Acide EBW Equilibrate-Binding-Wash buffer GRAS Generally Regarded As Safe His Histidine hly Đoạn gene mã hóa protein LLO IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa kilo Dalton Trang vii Danh mục chữ viết tắt L monocytogenes Listeria monocytogenes LB Môi trường Luria-Bertani LLO Listeriolysin O LysSN Vùng đầu N protein LysS M Marker MCS MultiCloning Site PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PFO Perfringolysin O PMSF Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SD Shine Dalgarno TAE Tris – Acetate - EDTA TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine TEV Tobacco Etch Virus TEVsite Vùng trình tự nhận biết TEV protease TMH Transmembrane Hairpin Trang viii Kết - Biện luận Như vậy, kháng huyết chuột thu nhận sau trình gây đáp ứng miễn dịch chủ động protein LLO tái tổ hợp biểu B subtilis có khả phản ứng với dịch nuôi cấy vi khuẩn L monocytogenes Tuy nhiên, cần thêm thí nghiệm để kiểm tra thêm khả phản ứng chéo kháng huyết chuột thu với dịch tiết loài vi khuẩn khác tự nhiên, loài thuộc chi Listeria Trang 64 Phần KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Kết luận – Đề nghị 4.1 Kết luận Đề tài đạt kết phù hợp với mục tiêu đề ban đầu Cụ thể kết sau: - Tạo dòng thành công vector pHT322 pHT358 cho phép biểu protein LLO B subtilis Trong đó, pHT358 cho phép biểu protein mục tiêu dạng dung hợp với His-tag giúp thu nhận LLO qua bước tinh - Khảo sát điều kiện nuôi cấy cảm ứng ảnh hưởng đến biểu protein dung hợp đưa điều kiện tối ưu như: nhiệt độ nuôi cấy 30oC, nồng độ IPTG 0,5 mM thời điểm kết thúc cảm ứng tăng trưởng chủng bắt đầu vào pha cân - Biểu tinh chế thành công protein LLO - Gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO chuột thu nhận thành công kháng huyết Kháng huyết phản ứng đặc hiệu với protein LLO tái tổ hợp lẫn dịch tiết vi khuẩn L monocytogenes, phản ứng chéo với dịch tiết từ E coli B subtilis, chủng dùng để biểu protein LLO Các kết chứng tỏ protein LLO tái tổ hợp tạo đề tài có tiềm ứng dụng để sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu cho L monocytogenes tự nhiên Như vậy, việc tạo vector biểu xây dựng quy trình biểu thu nhận protein LLO tái tổ hợp B subtilis đem lại công cụ hiệu việc cung cấp kháng nguyên, nhằm phát triển phương pháp miễn dịch chẩn đoán nhanh L monocytogenes Từ đó, giải hạn chế việc thu nhận protein LLO trực tiếp từ loài vi khuẩn Trang 65 Kết luận – Đề nghị 4.2 Đề nghị Đề tài cung cấp vật liệu thông tin quan trọng cho việc sản xuất kháng thể đa dòng kháng LLO nhằm phát triển quy trình ELISA phát L monocytogenes thực phẩm bệnh phẩm Tuy nhiên, để đạt mục tiêu trên, cần tiếp tục thực thí nghiệm sau: Kiểm tra thêm khả phản ứng chéo kháng huyết chuột thu đề tài với dịch tiết loài vi khuẩn khác tự nhiên, thuộc không thuộc chi Listeria Gây đáp ứng miễn dịch kháng LLO thỏ nhằm thu lượng kháng huyết lớn Tinh chế kháng thể đa dòng từ huyết thỏ Kết hợp với kháng thể đa dòng đặc hiệu cho protein kháng nguyên khác InlA, P60 để xây dựng quy trình ELISA phổ rộng nhằm phát L monocytogenes thực phẩm bệnh phẩm Trang 66 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Trần Văn Hiếu, Nguyễn Văn Dung Trần Linh Thước (2007), “Phát triển quy trình sandwich ELISA phát nhanh Listeria monocytogenes”, TC Công nghệ sinh học, 5411–417 Tài liệu tham khảo tiếng Anh [2] Bavdek, A., Kostanjšek, R., Antonini, V., Lakey, J.H., Dalla Serra, M., Gilbert, R.J.C and Anderluh, G (2012), “pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability”, The FEBS journal, 279(1), 126–141 [3] Berche, P., Reich, K.A., Bonnichon, M., Beretti, J.L., Geoffroy, C., Raveneau, J., Cossart, P., Gaillard, J.L., Geslin, P and Kreis, H (1990), “Detection of antilisteriolysin O for serodiagnosis of human listeriosis”, Lancet, 335(8690), 624– 627 [4] Bourry, A., Cochard, T and Poutrel, B (1997), “Serological diagnosis of bovine, caprine, and ovine mastitis caused by Listeria monocytogenes by using an enzyme-linked immunosorbent assay”, Journal of clinical microbiology, 35(6), 1606–1608 [5] Bourry, A and Poutrel, B (1996), “Bovine mastitis caused by Listeria monocytogenes: kinetics of antibody responses in serum and milk after experimental infection”, Journal of dairy science, 79(12), 2189–2195 [6] Campero, C.M., Odeón, A.C., Cipolla, A.L., Moore, D.P., Poso, M.A and Odriozola, E (2002), “Demonstration of Listeria monocytogenes by immunohistochemistry in formalin-fixed brain tissues from natural cases of ovine and bovine encephalitis”, Journal of veterinary medicine B, Infectious diseases and veterinary public health, 49(8), 379–383 [7] Clark, R.G., Gill, J.M and Swanney, S (2004), “Listeria monocytogenes gastroenteritis in sheep”, New Zealand veterinary journal, 52(1), 46–47 [8] Deretic, V (2011), “Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes”, Immunological reviews, 240(1), 92–104 [9] Edelson, B.T (2012), “Dendritic cells in Listeria monocytogenes infection”, Advances in immunology, 11333–49 [10] Gholizadeh, Y., Poyart, C., Juvin, M., Beretti, J.L., Croize, J., Berche, P and Gaillard, J.L (1996), “Serodiagnosis of listeriosis based upon detection of antibodies against recombinant truncated forms of listeriolysin O.”, Journal of Clinical Microbiology, 34(6), 1391–1395 Trang 67 Tài liệu tham khảo [11] GRAY, M.L and STAFSETH, H.J (1948), “A new technique for isolating listerellae from the bovine brain”, Journal of bacteriology, 55(4), 471–476 [12] Hamon, M.A., Batsché, E., Régnault, B., Tham, T.N., Seveau, S., Muchardt, C and Cossart, P (2007), “Histone modifications induced by a family of bacterial toxins”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(33), 13467–13472 [13] Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F and Cossart, P (2012), “Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria”, Trends in microbiology, 20(8), 360–368 [14] Hein, I., Klein, D., Lehner, A., Bubert, A., Brandl, E and Wagner, M (2001), “Detection and quantification of the iap gene of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by a new real-time quantitative PCR assay”, Research in microbiology, 152(1), 37–46 [15] Kawamura, F and Doi, R.H (1984), “Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases”, Journal of bacteriology, 160(1), 442–444 [16] Kayal, S and Charbit, A (2006), “Listeriolysin O: a key protein of Listeria monocytogenes with multiple functions”, FEMS microbiology reviews, 30(4), 514–529 [17] Lee, S.J., Kim, D.M., Bae, K.H., Byun, S.M and Chung, J.H (2000), “Enhancement of secretion and extracellular stability of staphylokinase in Bacillus subtilis by wprA gene disruption”, Applied and environmental microbiology, 66(2), 476–480 [18] Lhopital, S., Marly, J., Pardon, P and Berche, P (1993), “Kinetics of antibody production against listeriolysin O in sheep with listeriosis.”, Journal of Clinical Microbiology, 31(6), 1537–1540 [19] Low, J.C., Davies, R.C and Donachie, W (1992), “Purification of listeriolysin O and development of an immunoassay for diagnosis of listeric infections in sheep”, Journal of clinical microbiology, 30(10), 2705–2708 [20] Nguyen, H.D., Nguyen, Q.A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C.S., Tran, L.T and Schumann, W (2005), “Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability”, Plasmid, 54(3), 241–248 [21] Nguyen, H.D and Schumann, W (2006), “Establishment of an experimental system allowing immobilization of proteins on the surface of Bacillus subtilis cells”, Journal of biotechnology, 122(4), 473–482 [22] Nogva, H.K., Rudi, K., Naterstad, K., Holck, A and Lillehaug, D (2000), “Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk”, Applied and environmental microbiology, 66(10), 4266–4271 [23] Phan, T.T.P., Nguyen, H.D and Schumann, W (2006), “Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Protein expression and purification, 46(2), 189–195 Trang 68 Tài liệu tham khảo [24] Pizarro-Cerdá, J and Cossart, P (2009), “Listeria monocytogenes membrane trafficking and lifestyle: the exception or the rule?”, Annual review of cell and developmental biology, 25649–670 [25] Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A and Cossart, P (2012), “Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view”, Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 2(11), [26] Polekhina, G., Giddings, K.S., Tweten, R.K and Parker, M.W (2005), “Insights into the action of the superfamily of cholesterol-dependent cytolysins from studies of intermedilysin”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 600–605 [27] Poulsen, K.P and Czuprynski, C.J (2013), “Pathogenesis of listeriosis during pregnancy”, Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases, 1–10 [28] Ramaswamy, V., Cresence, V.M., Rejitha, J.S., Lekshmi, M.U., Dharsana, K.S., Prasad, S.P and Vijila, H.M (2007), “Listeria review of epidemiology and pathogenesis”, Journal of microbiology, immunology, and infection = Wei mian yu gan ran za zhi, 40(1), 4–13 [29] Roberts, A.J and Wiedmann, M (2003), “Pathogen, host and environmental factors contributing to the pathogenesis of listeriosis”, Cellular and molecular life sciences: CMLS, 60(5), 904–918 [30] Rossjohn, J., Feil, S.C., McKinstry, W.J., Tweten, R.K and Parker, M.W (1997), “Structure of a cholesterol-binding, thiol-activated cytolysin and a model of its membrane form”, Cell, 89(5), 685–692 [31] Rossmanith, P., Krassnig, M., Wagner, M and Hein, I (2006), “Detection of Listeria monocytogenes in food using a combined enrichment/real-time PCR method targeting the prfA gene”, Research in microbiology, 157(8), 763–771 [32] Saito, H., Shibata, T and Ando, T (1979), “Mapping of genes determining nonpermissiveness and host-specific restriction to bacteriophages in Bacillus subtilis Marburg”, Molecular & general genetics: MGG, 170(2), 117–122 [33] San-Miguel, T., Perez-Bermudez, P and Gavidia, I (2013), “Production of soluble eukaryotic recombinant proteins in E coli is favoured in early log-phase cultures induced at low temperature”, SpringerPlus, 2(1), [34] Schuerch, D.W., Wilson-Kubalek, E.M and Tweten, R.K (2005), “Molecular basis of listeriolysin O pH dependence”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(35), 12537–12542 [35] Simonen, M and Palva, I (1993), “Protein secretion in Bacillus species”, Microbiological reviews, 57(1), 109–137 [36] Tjalsma, H., Bolhuis, A., van Roosmalen, M.L., Wiegert, T., Schumann, W., Broekhuizen, C.P., Quax, W.J., Venema, G., Bron, S and van Dijl, J.M (1998), “Functional analysis of the secretory precursor processing machinery of Bacillus Trang 69 Tài liệu tham khảo subtilis: identification of a eubacterial homolog of archaeal and eukaryotic signal peptidases”, Genes & development, 12(15), 2318–2331 [37] Vadia, S., Arnett, E., Haghighat, A.-C., Wilson-Kubalek, E.M., Tweten, R.K and Seveau, S (2011), “The pore-forming toxin listeriolysin O mediates a novel entry pathway of L monocytogenes into human hepatocytes”, PLoS pathogens, 7(11), e1002356 [38] Walker, J.K and Morgan, J.H (1993), “Ovine ophthalmitis associated with Listeria monocytogenes”, The Veterinary record, 132(25), 636 [39] Witte, C.E., Archer, K.A., Rae, C.S., Sauer, J.-D., Woodward, J.J and Portnoy, D.A (2012), “Innate immune pathways triggered by Listeria monocytogenes and their role in the induction of cell-mediated immunity”, Advances in immunology, 113135–156 [40] Wong, S.L., Ye, R and Nathoo, S (1994), “Engineering and production of streptokinase in a Bacillus subtilis expression-secretion system”, Applied and environmental microbiology, 60(2), 517–523 [41] Wu, S.-C., Yeung, J.C., Duan, Y., Ye, R., Szarka, S.J., Habibi, H.R and Wong, S.-L (2002), “Functional production and characterization of a fibrin-specific single-chain antibody fragment from Bacillus subtilis: effects of molecular chaperones and a wall-bound protease on antibody fragment production”, Applied and environmental microbiology, 68(7), 3261–3269 [42] Wu, X.C., Lee, W., Tran, L and Wong, S.L (1991), “Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases”, Journal of bacteriology, 173(16), 4952–4958 [43] Wu, X.C., Ng, S.C., Near, R.I and Wong, S.L (1993), “Efficient production of a functional single-chain antidigoxin antibody via an engineered Bacillus subtilis expression-secretion system”, Bio/technology (Nature Publishing Company), 11(1), 71–76 [44] Yang, M.Y., Ferrari, E and Henner, D.J (1984), “Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitroderived deletion mutation”, Journal of bacteriology, 160(1), 15–21 [45] Ye, R., Kim, J.H., Kim, B.G., Szarka, S., Sihota, E and Wong, S.L (1999), “High-level secretory production of intact, biologically active staphylokinase from Bacillus subtilis”, Biotechnology and bioengineering, 62(1), 87–96 [46] Zhang, Y., Olsen, D.R., Nguyen, K.B., Olson, P.S., Rhodes, E.T and Mascarenhas, D (1998), “Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli”, Protein expression and purification, 12(2), 159–165 Trang 70 Phần PHỤ LỤC Phụ lục Hình 5.1: Kết giải trình tự plasmid pHT322 mồi xuôi ON653 nằm đoạn gene hly đầu 5’ Trang 71 Phụ lục Hình 5.2: Kết giải trình tự plasmid pHT322 mồi xuôi hly_F_seq nằm đoạn gene hly Trang 72 Phụ lục Hình 5.3: Kết giải trình tự plasmid pHT322 mồi ngược ON314 nằm đoạn gene hly đầu 3’ Trang 73 Phụ lục Hình 5.4: Kết giải trình tự plasmid pHT358 Trang 74 Phụ lục Bảng 5.1: Kết theo dõi OD600 dịch nuôi cấy B subtilis tái tổ hợp hệ thống lên men lít theo thời gian Thời gian OD600 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10 h 0,2 0,4 0,8 1,5 2.5 3,2 4,0 4,5 5,0 5,2 5,2 Bảng 5.2: Giá trị OD450 thử nghiệm ELISA kiểm tra khả phản ứng kháng huyết chuột với protein LLO tái tổ hợp Chuột tiêm LLO Nồng độ LLO Độ pha loãng huyết 10 μg/ml μg/ml 2,5 μg/ml Chuột (-) μg/ml 10 μg/ml 1/10.000 0.96 ± 0,01 0.94 ± 0,01 0.84 ± 0,01 0.64 ± 0,00 0.05 ± 0,02 1/20.000 0.65 ± 0,00 0.64 ± 0,01 0.53 ± 0,02 0.41 ± 0,00 0.05 ± 0,00 1/40.000 0.39 ± 0,00 0.38 ± 0,01 0.31 ± 0,00 0.23 ± 0,00 0.05 ± 0,00 1/80.000 0.23 ± 0,01 0.22 ± 0,01 0.19 ± 0,00 0.15 ± 0,00 0.05 ± 0,00 1/120.000 0.17 ± 0,00 0.16 ± 0,00 0.14 ± 0,00 0.11 ± 0,00 0.05 ± 0,00 Trang 75 [...]... protein này còn được sử dụng để sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu, từ đó ứng dụng những kháng thể này cho việc phát hiện sự hiện diện của L monocytogenes trong thực phẩm Tuy nhiên, việc thu nhận trực tiếp các protein kháng nguyên từ L monocytogenes gặp nhiều trở ngại do hiệu suất thấp, khó tinh sạch và không an toàn khi phải tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh Do đó, kháng nguyên tái tổ hợp được biểu hiện bởi... loại kháng nguyên protein hoặc không phải protein và thường không được dùng chung với tá chất Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lượng kháng nguyên lớn hơn và phải được cung cấp liên tục nên không được sử dụng rộng rãi như phương pháp tiêm Phương pháp cho uống Đây là phương pháp phổ biến đối với các kháng nguyên không có bản chất protein như polysaccharide, lipid và các phức hợp hapten Các kháng nguyên. .. gọi là kháng thể đa dòng Đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể bao gồm đáp ứng sơ cấp và đáp ứng thứ cấp Khi một kháng nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể lần đầu tiên, những tế bào lympho B ở trạng thái nghỉ sẽ được hoạt hóa nhằm tiết ra các kháng thể đặc hiệu để loại bỏ chúng gọi là đáp ứng miễn dịch sơ cấp Khi kháng nguyên tương tự xâm nhập vào cơ thể lần thứ hai, những kháng thể đặc hiệu đã tồn tại từ đáp... bào chế tiết kháng thể (tế bào plasma) hoặc tế bào nhớ và đi vào tủy xương hoặc gan, tồn tại ở đó trong một khoảng thời gian dài và tiếp tục sản xuất kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại trừ Các tế bào này được tích lũy trong suốt đời sống của một cá thể khi tiếp xúc với nhiều loại tác nhân xâm nhiễm khác nhau từ môi trường Tập hợp tất cả kháng thể cùng nhận biết một kháng nguyên ở những... monocytogenes trong thực phẩm hoặc bệnh phẩm cần phải được đặt ra nghiên cứu nhằm ngăn ngừa và điều trị bệnh kịp thời Một phương pháp đang được chú ý hiện nay là chẩn đoán huyết thanh học nhằm phát hiện sự nhiễm khuẩn thông qua việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với các kháng nguyên của L monocytogenes trong huyết thanh động vật Một trong những kháng nguyên đó là Listeriolysin O hay LLO LLO là một protein. .. khả năng biểu hiện protein mục tiêu của chủng B subtilis tái tổ hợp như nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng - Biểu hiện và tinh chế protein LLO - Gây đáp ứng miễn dịch chủ động kháng LLO trên chuột và thu nhận kháng huyết thanh - Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng huyết thanh chuột thu được với protein LLO tái tổ hợp và dịch tiết của vi khuẩn L monocytogenes Từ đó đánh giá tiềm... này, nhóm tác giả đã sử dụng protein mục tiêu là p60 được mã hóa từ gene iap để phát hiện L monocytogenes và đạt được kết quả rất khả quan [1] 1.2 Protein Listeriolysin O (LLO) Protein LLO là một hemolysin quan trọng trong chu trình sống ký sinh nội bào của vi khuẩn L monocytogenes, giúp loài vi khuẩn này xâm nhập vào bên trong tế bào chủ, đồng thời tiếp tục xâm nhiễm từ tế bào này sang các tế bào... promoter; ColE1: ColE1 origin; AmpR: Gen kháng Ampicillin; LacI: gen lacI (lac repressor); CmR: Gen kháng Chloramphenycol Hình 1.4: Sơ đồ promoter Pgrac 1.4 Đáp ứng miễn dịch chủ động trên động vật thí nghiệm 1.4.1 Cơ chế đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể Kháng thể là các phân tử có bản chất glycoprotein do tế bào lympho B tiết ra nhằm nhận diện đặc hiệu những kháng nguyên lạ và vô hiệu hóa hoạt động của... nhóm nghiên cứu là cung cấp một lượng lớn các protein kháng nguyên của L monocytogenes như LLO hoặc InlA ở dạng tái tổ hợp và sản xuất các kháng thể đa dòng tương ứng, hướng đến việc phát triển các công cụ miễn dịch nhằm phát hiện sớm L monocytogenes Nằm trong định hướng đó, đề tài này đặt ra mục tiêu là bước đầu xây dựng quy trình biểu hiện và tinh chế protein LLO tái tổ hợp trong B subtilis, đồng... ứng miễn dịch trên chuột và kiểm tra hiệu quả phát hiện protein mục tiêu của kháng huyết thanh thu được, từ đó đánh giá tiềm năng ứng dụng của protein LLO tái tổ hợp trong việc sản xuất kháng thể đa dòng có thể phát hiện được L monocytogenes Chúng tôi chọn B subtilis làm chủng biểu hiện do chúng có nhiều ưu điểm đảm bảo sự biểu hiện thành công protein mục tiêu như: có hệ thống vector biểu hiện hiệu