Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford Trong phương pháp xác định hàm lượng protein phương pháp có độ nhạy cao, xác định tới 1µg, hoá chất đơn giản tốn thời gian Một ưu điểm lớn phương pháp bị cản trở hoá chất sử dụng nghiên cứu protein, amoniumsufate  Nguyên tắc: Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid chưa kết nối với protein thuốc nhuộm dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại 465 nm kết hợp với protein thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương hấp thu cực đại mức cực đại bước sóng 595 nm Độ hấp thu bước sóng 596 nm có liên hệ cách trực tiếp với nồng độ protein Để xác định protein mẫu, ta xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn biết nồng độ Sau cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu xuất sau phút bền tới 1giờ Tiến hành đo dung dịch máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta ODx, độ hấp thụ tỷ lệ với lượng protein mẫu Thực đối chứng với HCl (OD o) Lấy giá trị ∆OD = ODX – ODO Lượng protein mẫu dung dịch đo xác định cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị ∆OD trục tung, từ suy giá trị nồng độ protein tương ứng trục hoành  Hóa chất − Dung dịch albumine 0.1% − Nước cất − Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử 100 ml sau o Coomassie Brilliant Blue: 0.001g o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g o Phosphoric acid: 85% Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue hoà tan ethnol chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid chỉnh tới 100 ml nước cất Lắc giữ lạnh 4oC  Dựng đường chuẩn albumine Pha loãng dung dịch albumine thành nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/ml Bảng 3.1 Dựng đường chuẩn albumine Ống nghiệm Đối 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 2 2 2 2 2 chứng Nồng độ (µg/ml) Dung dịch albumin chuẩn (µl) Nước cất (µl) Thuốc thử Bradford (ml) Ống số tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất Tất ống sau pha nồng độ, để khoảng 20 phút Tiến hành đo mật độ quang dung dịch bước sóng 595 nm  Dựng đường chuẩn Định lượng protein mẫu thí nghiệm Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào ml thuốc thử Bradford Đem đo mật độ quang bước sóng 595 nm Từ suy hàm lượng protein có mẫu thí nghiệm Mẫu pha loãng cho mật độ quang đo khoảng đường chuẩn Kết tính toán: Từ phương trình đường chuẩn mật độ quang mẫu khoả sát ta suy hàm lượng protein mẫu X (µg/ml) có m (g) nguyên liệu Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Vậy lượng protein có gam nguyên liệu là: Hàm lượng protein (mg/g) = X 1000 m Hình 3.2 Đường chuẩn albumine Xác định hoạt tính enzyme protease phương pháp Amano  Nguyên tắc: Dùng protein “casein” làm chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein enzyme protease sở định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân tác dụng enzyme  Hoá chất: − HCL 0.1 M − Ma2CO3 0.4 M − Dung dịch Trichloracetic 0.4 M − Tyrosin tinh khiết Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục − NaOH 0.1 M − Thuốc thử Folin − H3PO4 1/30 M − Đệm phosphate (pH 7) 0.1 M  Dụng cụ thiết bị − Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc − Bể ổn nhiệt − Máy đo quang phổ UV – Vis − Máy đo pH  Xây dựng đường chuẩn tyrosine Bảng 3.2 Đường chuẩn tyrosine Ống số Đối 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch HCl (µl) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 Nồng độ (µg/ml) Dung dịch tyrosine chuẩn (µl) Thuốc thử Folin (ml) chứng Pha dung dịch tyrosine nồng độ khác : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µgtyrosine / mlHCl bảng 3.3.2 Thêm ml dung dịch Na 2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine nồng độ khác thêm ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 37 ± 0,50C 20 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm Ghi nhận kết As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90 As100 Đối với ống đối chứng dùng ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 660 nm ghi nhận kết As o Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Trị số mật độ quang ống từ đến sau trừ trị số ống đối chứng giá trị ∆ OD1 đến ∆ OD9 Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên ∆ OD theo nồng độ protein Đồ thị gọi đường chuẩn tyrosine  Xác định hoạt tính enzyme protease Hoạt tính enzyme khảo sát nhiệt độ 370C pH = Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ 37 ± 0,50C 10 – 15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dịch chiết enzyme thô vào lắc Đem ủ hỗn hợp 37 ± 0,50C Cho vào ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme Để ổn định dung dịch 25 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc Thêm ml thuốc thử Folin Trộn đều, để yên 37 ± 0,50C 20 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thu bước sóng 660 nm (ghi nhận kết Am) Mẫu đối chứng : lấy ml nước cất thay cho ml dung dịch enzyme tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ A0 Hàm lượng tyrosine giải phóng protease thủy phân tính cách lấy Am – A0 lấy kết so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tínhprotease theo tính toán sau : Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 100 µg tyrosine ml dịch lọc điều kiện thí nghiệm Ký hiệu là: U Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – A0).F.1/100.n.V m Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục F = [10/ ∆ As10 + 20/ ∆ As20 + 30/ ∆ As30 + 40/ ∆ As40 + 50/ ∆ As50 + 60/ ∆ As60 + 70/ ∆ As70 + 80/ ∆ As80 + 90/ ∆ As90+100/∆As100]/10 − Am : độ hấp thu mẫu − A0 : Độ hấp thu ống đối chứng − F : Hệ số tương quan hàm lượng tyrosine độ hấp thu bước sóng 660 nm đường chuẩn − n : Hệ số pha loãng enzyme − 1/100 : Hệ số chuyển đổi − V : Thể tích dung dịch enzyme − m : khối lượng chế phẩm enzyme thô Tính toán hoạt tính riêng (HTR) enzyme protease: từ kết hàm lượng protein (mg/ml) hoạt tính enzyme protease (U/ml) tính hoạt tính riêng enzyme HTR (U/mg) = Số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme Đường chuẩn tyrosine