Đang tải... (xem toàn văn)
Realtime PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong phản ứng realtime PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...). Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis).
KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TÓM TẮT Real-time PCR kỹ thuật PCR mà kết nhân DNA đích ống nghiệm, thành hàng tỷ sao, hiển thị sau chu kỳ nhiệt phản ứng, đặc điểm nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp thao tác sau để phát sản phẩm nhân (điện di sản phẩm PCR gel agarose lai với đoạn dò đặc hiệu màng, giếng, …) KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Real-time PCR cải biên phương pháp PCR dựa chức 5’-3’ polymerase Taq DNA polymerase Holland cộng công bố năm 1991 Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ) Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA Trong phản ứng, có diện sản phẩm DNA mạch đôi trình nhân tác nhân liên kết với DNA mạch đôi SYBR Green liên kết với sản phẩm vừa tạo phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ (so với trạng thái tự dung dịch) Loại tác nhân huỳnh quang sử dụng cho trình tự đích phí thấp; độ đặc hiệu sản phẩm phải kiểm tra chặt chẽ thông qua bước phân tích bổ sung sau phản ứng nhân kết thúc – phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis) Hình Phương pháp real-time PCR với tác nhân phát huỳnh quang liên kết với mạch đôi DNA (EvaGreen) Tác tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu đa dạng FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, …, sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau: (1) Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần mạch khuôn hai mồi (primer) Các mồi cho phép nhân trình tự đích phản ứng PCR Mẫu dò phía đầu có mang nhóm hùynh quang đầu 3’ mẫu dò phía đuôi mang nhóm huỳnh quang đầu 5’ Khi mẫu dò bắt cặp trình tự DNA, nhóm hùynh quang “cho” (donor dye) nhóm “nhận” (acceptor dye) mẫu dò gây hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Hiệu ứng ghi nhận có bắt cặp mẫu dò 5’ mẫu dò 3’ lên trình tự tạo thành trình PCR Hình Phương pháp real-time PCR với mẫu dò lai (2) Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) với ví dụ thông dụng TaqMan probe (còn gọi kỹ thuật 5’ nuclease) Mẫu dò đánh dấu đầu 5’ nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), đầu 3’ nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye) Nhóm “dập” ngăn phát huỳnh quang nhóm “phát” mẫu dò trạng thái nguyên vẹn Trong trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease Taq polymerase cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến không chịu tác động nhóm “dập” Lúc nhóm “phát” phát tín hiệu huỳnh quang thiết bị tự động ghi nhận Hình Phương pháp real-time PCR với mẫu dò TaqMan (3) Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) điển “Molecular beacon”: bao gồm trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm hai trình tự lặp lại đảo ngược Các nhóm “phát” (reporter) “dập” (quencher) gắn vào hai đầu mút mẫu dò Do đó, phát huỳnh quang không xảy mẫu dò dạng tự (cấu hình “kẹp tóc”) dung dịch Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, duỗi dài khiến hai nhóm “phát” “dập” tách xa Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang phát ghi nhận Hình Phương pháp real-time với mẫu dò “kẹp tóc” (molecular beacon probe) Trong trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích nhân phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang phát đầu dò máy luân nhiệt real-time PCR thu nhận xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang mẫu vựơt qua đường tín hiệu huỳnh quang (base line) phản ứng mẫu xem dương tính người ta lấy thời điểm vượt qua (biểu qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle Threshhold) để so sánh với đường cong chuẩn (standard curve) biết để suy nồng độ trình tự DNA đích mẫu thử nghiệm ban đầu Đường cong chuẩn xây dựng từ chu kỳ ngưỡng mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích biết trước nồng độ Định lượng nucleic acid ứng dụng mạnh phương pháp Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, kỹ thuật real-time PCR ứng dụng rộng rãi để phát định lượng tác nhân gây bệnh người virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán theo dõi điều trị Nhiều kit thương mại hóa sử dụng mẫu dò thủy giải (Roche COBAS Taqman HBV test, Artus RealArt HBV PCR), mẫu dò lai (Roche Diagnostics), mẫu dò dạng “kẹp tóc” (molecular beacon) (RealArt kit – Cobett Research), HCV Quantitation ASR (Abbott) VẤN ĐỀ KỸ THUẬT CƠ BẢN CỦA REAL-TIME PCR Biểu đồ nhân real-time PCR Hình Đường biểu diễn nhân ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sang kích thích vào chu kì nhiệt Đường (baseline): định nghĩa số chu kỳ PCR tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần chưa đạt ngưỡng nhận biết thiết bị Theo mặc định, đường xác lập khoảng chu kỳ đến 15 thay đổi Ngưỡng (threshold): giá trị huỳnh quang xác lập cách tùy ý, dựa đường Một tín hiệu huỳnh quang phát ngưỡng xem tín hiệu đặc hiệu, sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng Ngưỡng thiết lập theo thí nghiệm thường cắt tất đường tín hiệu đặc hiệu pha nhân cấp số mũ (exponential phase) Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): định nghĩa số chu kỳ PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn ngưỡng Nói khác đi, số chu kỳ PCR tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu Đây nguyên lý real-time PCR yếu tố định tính xác lặp lại kết Số trình tự mục tiêu mẫu ban đầu cao số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát nhỏ, nghĩa giá trị Ct thấp Đường chuẩn real-time PCR Một đường chuẩn xây dựng với nồng độ (pha loãng đến 10 lần) trình tự DNA chứng biết giá trị Ct tương ứng Để định lượng trình tự mục tiêu ban đầu có mẫu, người ta đo giá trị Ct mẫu; giá trị lắp vào đường chuẩn cho nồng độ trình tự mục tiêu có mẫu ban đầu Đây phương pháp thường sử dụng để định lượng hàm lượng vật liệu di truyền tác nhân gây bệnh diện bệnh phẩm Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ số lượng DNA đích chu kỳ ngưỡng tương ứng Trong biểu đồ này, E2, E4, E6, E8 ống phản ứng chứa mẫu chuẩn biết trước nồng độ, B4, B5 ống phản ứng chứa mẫu thử cần xác định nồng độ Đường chuẩn (standard curve): thể mối quan hệ chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn Trên đường chuẩn này, trục tung Y Ct, trục hoành X số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn Do mẫu chuẩn thường pha cách theo hệ số pha loãng 10 nên số lượng DNA đích mẫu chuẩn biểu thị log10 số lượng Do vậy, trị số 2, 4, 6, trục X tương ứng với số lượng đích 102, 104, 106, 108 ống phản ứng Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ xác thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải đạt ≥ 0.99 có nghĩa đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao Hiệu suất phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR ảnh hưởng đến chu kỳ ngưỡng Một PCR đạt hiệu suất lý tưởng, sau chu kì nhiệt, cường độ huỳnh quang ống phản ứng phải tăng gấp đôi, hiệu suất nhân 100% Hiệu suất PCR thực tế chấp nhận khoảng 90%-110% Một loạt mẫu chuẩn với nồng độ khác nhân điều kiện hiệu suất thấp tạo đường chuẩn với hệ số góc khác với nhân điều kiện hiệu suất cao Trong hình 7, hai mẫu (X Y) nhân hai điều kiện hiệu suất thấp cao cho giá trị Ct khác với nồng độ mạch khuôn giống Trong ví dụ này, điều kiện hiệu suất cao (đường màu xanh nước biển) cho giá trị Ct trễ nồng độ mạch đích cao, thể độ nhạy tốt mẫu nồng độ thấp Hiệu suất PCR phụ thuộc vào kĩ thuật thực hiện, loại hóa chất (master mix) sử dụng chất lượng mẫu sau tách chiết Hình 7: Biến thiên giá trị Ct với hiệu suất PCR khác Đường màu xanh nước biển có hiệu suất 100% (slope -3.3) Đường màu xanh có hiệu suất 78% (slope -4) ỨNG DỤNG CỦA REAL-TIME PCR Kỹ thuật real-time PCR ứng dụng rộng rãi để phát định lượng tác nhân gây bệnh người virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán theo dõi điều trị Phương pháp real-time PCR với chất phát huỳnh quang SYBR Green phát TB: Trong bệnh phẩm sử dụng cặp mồi thiết kế để nhân vùng gene IS6110 IS6110 trình tự gắn chèn đặc trưng cho chủng vi khuẩn lao (Mycobacterium complex) diện với số lượng lớn DNA gene Mycobacterium xem đối tượng thích hợp để phát vi khuẩn lao Mẫu xét nghiệm kết luận dương tính kết phân tích “đường cong nóng chảy” cho thấy Tm sản phẩm PCR thu tương ứng với Tm vùng gene IS6110 nhân Kit HBV định lượng xây dựng dựa kỹ thuật real-time PCR, sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho DNA HBV đánh dấu với tác nhân phát huỳnh quang Primer (mồi) mẫu dò (probe) Taqman thiết kế vùng gene S HBV Ở mẫu HBV dương tính, cường độ tín hiệu huỳnh quang tăng dần trình nhân ghi nhận theo thời gian phản ánh số lượng trình tự DNA tạo Song song với mẫu cần định lượng, phổ nồng độ biết trình tự mục tiêu dùng để xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn sở cho việc định lượng DNA HBV mẫu bệnh Kết định lượng đọc máy real-time PCR Real-time PCR dùng phát HCV, genotype HCV, phát H.pylori, chẩn đoán sớm HIV trẻ em, xác định type virus sốt xuất huyết Dengue, phát thai nhi nhiễm Rubella… Những năm trở lại đây, kỹ thuật real-time PCR ứng dụng nghiên cứu thủy sản nhiều định lượng Taura Syndrome Virus (Tang cộng sự, 2003), phát triển độ đặc hiệu độ nhạy việc xác định Taura Syndrome Virus Yellow Head Virus (Mouillesseaux cộng sự, 2003), định tính định lượng IHHNV WSSV tôm (Dhar cộng sự, 2001), định lượng Streptococcus agalactiae cá (Ke cộng sự, 2000)… TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., & Patel H.R.H 2005 Basic principles of real-time quantitative PCR Expert Rev Mol Diagn., 5:1-11 [2] Bustin S.A., & Nolan T 2004 Pitfalls of quantitative real-time ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction Joiurnal of Biomolecular Techniques, 15:155-166 [3] Hunt M Real time PCR Microbiology and Immunology On-line [4] Schweitzer B., & Kingsmore S 2001 Combining nucleic acid amplification and detection Current Opinion in Biotechnology, 12: 21-27 Realtime PCR hay kỹ thuật Real time PCR gì? PCR phản ứng khuếch đại DNA (polymerase chain reaction) Trong kỹ thuật PCR, sau khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm số bước để đọc kết xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn hay không kỹ thuật điện di (sử dụng máy điện di), sử dụng thí nghiệm lai với mẫu dò đặc hiệu để xem sản phẩm khuếch đại có chứa sản phẩm mong muốn hay không Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn phân tích sau khuếch đại gọi kỹ thuật PCR cổ điển việc sử dụng máy PCR, hay gọi máy luân nhiệt Realtime PCR (Real time PCR) kỹ thuật PCR mà kết khuếch đại DNA đích hiển thị sau chu kỳ phản ứng PCR, mà gọi real-time: thời gian thực, đặc điểm mà với kỹ thuật Realtime PCR, người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp thí nghiệm để đọc sản phẩm khuếch đại Với kỹ thuật real-time PCR sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm máy realtime pcr, sản phẩm cuối phản ứng hiển thị sau phản ứng khuếch đại hoàn tất Vì nói Realtime PCR kỹ thuật nhân DNA đích ống nghiệm thành hàng tỷ dựa vào chu kỳ nhiệt kết khuếch đại ống phản ứng hiển thị lúc với phản ứng khuếch đại xảy để người làm nghiệm thấy Các vấn đề kỹ thuật Realtime PCR: Biểu đồ khuếch đại Realtime PCR Bạn cần tìm hiểu đường (baseline), ngưỡng (threshold), chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct) Ngoài bạn cần tìm hiểu thêm đường chuẩn (standard curve) hệ số tương quan (R) Biểu đồ khuếch đại phản ứng Realtime PCR Đường (baseline): số chu kỳ phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần chưa đạt ngưỡng nhận biết thiết bị Mặc định, đường xác lập khoảng từ chu kỳ đến chu kỳ 15 thay đổi Ngưỡng (threshold): giá trị huỳnh quang xác lập cách tùy ý, dựa đường Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): định nghĩa số chu kỳ PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn ngưỡng Nói khác đi, số chu kỳ phản ứng realtime PCR tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu Đường chuẩn phản ứng Realtime PCR Đường chuẩn phản ứng realtime pcr Đường chuẩn xây dựng với nồng độ (pha loãng đến 10 lần) trình tự DNA chứng biết giá trị Ct tương ứng Đường chuẩn (standard curve): thể mối quan hệ chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ xác thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải đạt ≥ 0.90 có nghĩa đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao Hiệu suất phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR ảnh hưởng đến chu kỳ ngưỡng Để cho kết xác nhất, bạn nên sử dụng máy realtime PCR chất lượng tốt Bài viết liên quan Phương pháp bảo quản hoa tươi lâu Hiện nay, kỹ thuật bảo quản hoa tươi cắt cành sau thu hoạch Việt Nam mang tính truyền thống gặp nhiều hạn chế nên chất lượng chưa cao, nhiều… Vậy, cần hiểu threshold :D Real Time PCR dùng để định lượng với độ xác cao Do đó, việc đo tín hiệu huỳnh quang (là giá trị đại diện nồng độ DNA mạch kép phản ứng) phải tiến hành thật chuẩn Để làm điều cần thiết phải có hệ đệm thiết kế để ổn định điều kiện Trong hệ đệm (do nhà sản xuất cung cấp) có chất làm đối chứng (Passive reference) Khi đo tín hiệu huỳnh quang reporter, máy dựa tín hiệu Passive reference Giá trị thương số lấy Cường độ tín hiệu huỳnh quang reporter chia cho cường độ tín hiệu huỳnh quang Passive reference ký hiệu Rn Threshold định nghĩa độ lêch chuẩn trung bình giá trị Rn chu kỳ đầu PCR Để hiểu hoàn toàn cách tính toán, cách xử lý Real time khó Nên hiểu theo quan điểm nhà sinh học, với tư cách người sử dụng công nghệ Ý nghĩa Threshold Threshold cycle: - Threshold điểm bắt đầu phát tín hiệu huỳnh quang - Ổn định: Trong chu kỳ đầu phản ứng PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang thay đổi lên xuống thực chất "nhiễu" Threshold cycle Baseline phải đặt cho máy Real Time "không thèm chấp" tín hiệu nhiễu - Xác định giá trị Ct cho đồng nghĩa với việc tìm điều kiện phù hợp nhất, đắn để đo cường độ huỳnh quang ghe người ta nói real time PCR sử dụng SYBR Green I có độ nhạy cao real time PCR sử dụng Taqman probe, molecular beacons điều có không ? (theo nghĩ lý thuyết thực nghiệm ntn, bạn có so sánh thử chưa) À, không thay EtBr SYBR Green nhuộm DNA nhỉ, thấy có người làm mà So sánh khập khiễng mục tiêu assay khác Tagman Probe (Hydrolysis Probe) ứng dụng chủ yếu để xác định đột biến: SNP, Allelic Discrimination SYBR Green I ứng dụng để làm định lượng Có thể tính đến số lượng copy template có mẫu làm đường chuẩn Về độ nhạy SYBR Green I khỏi nói Cực kỳ xác Nếu bạn làm thí nghiệm mà thấy củ chuối cần xem lại kỹ thực nghiệm bạn độ thành phần phản ứng Dĩ nhiên, assay sử dụng probe Realtime ứng dụng làm định lượng ngược lại, chí SYBR dùng để xác định đột biến Tuy nhiên, chưa nghĩ đến việc có lại so sánh chúng với nhau, so sánh điểm ? Ví dụ: So sánh tốc độ máy cày xe đua công thức Rõ ràng máy cày loại xe giới, có động cơ, dùng xăng giống xe đua Bây giờ, quay lại vấn đề mà bạn quan tâm: Độ nhạy (số copy tối thiểu template mà phản ứng phát hiện) - Với SYBR Green I: Độ nhạy không phụ thuộc vào SYBR mà phụ thuộc vào yếu tố khác phản ứng PCR thông thường: Mồi, nhiệt độ bắt cặp, độ sách mẫu, chất lượng buffer, enzyme - Với Hybridization probe & Hydrolysis probe: Cũng Độ nhạy phản ứng không phụ thuộc vào probe Nếu primers làm tốt chức có sản phẩm PCR, việc probe có làm việc sản phẩm PCR hay không chuyện khác Vấn đề thứ hai độ xác (specificity) phản ứng Realtime: Tôi nghĩ cần so sánh chỗ để làm thí nghiệm so sánh Ví dụ: So sánh khả phát đột biến Hybridization probe, Hydrolysis probe SYBR Green I (Ngay trường hợp cụ thể này, việc so sánh loại probe với SYBR green khập khiễng cách thưc tiến hành thí nghiệm khác nhau) Nếu hiểu độ nhạy theo nghĩa khả phát huỳnh quang dựa có mặt số lượng copy DNA mach kép (hoặc nồng độ - tùy bạn), tạm ký hiệu X, SYBR Green I, số lượng probe liên kết với mạch đích, tạm ký hiệu Y, assay dùng probe, có điểm này: - Việc tăng lượng X hay Y đơn giản cách tăng số chu kỳ PCR - Khả phát huỳnh quang SYBR Green I cao Tôi làm thí nghiệm mà đỉnh (pick) Primer Dimer cao gần pick sản phẩm Liệu có phải homosapiens nghĩ độ nhạy assay dùng SYBR Green I cao assay khác theo hướng không ? -Hiện biết có hệ thống Realtime LightCycler Roche ABI Prism Applied Biosystem Có thể nhiều loại khác không biết, bạn biết bổ xung Hệ thống LightCycler có số ưu điểm so với ABI Prism: - Sử dụng phận gia nhiệt luồng khí nóng => nhanh so với gia nhiệt block máy PCR thường ABI Prism dùng - Có thể áp dụng Hibridization probe assay, ABI Prism không Đây ưu điểm cực lớn - Sử dụng ống mao quản (capilary) để chạy mẫu, có nắp đóng kín => giảm nguy nhiễm - Allelic Discrimination phân biệt theo pick => rõ ràng Tự động tính toán Ct => đỡ mệt Trước có chạy demo ABI Prism thấy có điểm đáng lưu ý: - Khả nhiễm cao sử dụng plate để mix mẫu - Kết Allelic Discrimination đánh giá theo vùng nên tương đối mệt lúc phân tích làm cho người ta không cảm thấy thật thoải mái kết luận - Bắt buộc phải dùng Hydrolysis probe nên lúc thiết kế thí nghiệm nhiều bị ràng buộc Hybridization probe khác hẳn - Tính toán, thay đổi giá trị Ct => thêm bước loằng ngoằng không thực cần thiết Lưu ý: Hệ thống LightCycler tự điều chỉnh Ct bạn thích Nếu cần so sánh đó, so sánh đáng giá mà nên làm để mua hệ thống phù hợp cho Lab Những so sánh tự mò mẫm chăc lâu hiểu hay dở Rất may sếp dẫn Cảm ơn sếp :D Vụ dùng SYBR Green I để xác định đột biến có thật, giống máy cày ý :D Để lục lại tài liệu, đọc lại tí post sau Lưu ý lại lần nữa: Tôi không giáo hết, thảo luận, có sai sửa OK hực xét độ nhạy, nên đặt điều kiện chuẩn cho pứ PCR thông thường mà nói, điều kiện không ảnh hưởng nhiều đến độ nhạy (đó theo làm thực nghiệm mà rút !) Bài minh họa cho việc sử dụng melting curve để xác định Tm đoạn sp PCR Dĩ nhiên SYBR dùng để đo lệch độ phát huỳnh quang sp có đột biến Nhưng mà doncry làm để xác định độ chênh lệch nucleotide vấn đề Không tin hỏi thử anh Aigu xem Dựa vào Tm để xác định độ dài amplicon melting curve điều gần không tưởng chênh lệch nu Về lý thuyết, đột biến điểm xác định SBGR Green làm thay đổi nhiệt độ nóng chảy sản phẩm độ C Tuy nhiên, thực tế điều khôgn tưởng Vấn đề sv_ngheo không phân biệt "Xác định đột biến điểm" "Xác định đột biến" Nếu dùng SYBR GREEN phát đột biến đoạn báo viết Việc sử dụng SYBR GREEN để làm điều có ưu so với sử dụng PCR thông thường ? Liệu sv_nghèo có vui lòng nói cho người rõ ? 8) Về nguyên tắc chung, xác định đột biến đoạn trở nên dễ dàng thằng cha SNP nhiều lần Vì đơn giản Tm dạng ko đột biến cao Tm dạng đoạn SYBR ghê gớm cả, nôm na EtBr loại tốt thôi, quan trọng phải ép ngựa chạy theo ý ta Loại dye cài xen khó chịu, có DNA sợi kép rồi, phát huỳnh quang ầm ầm Như người biết, trình PCR chuyện unspecific product chuyện thường ngày huyện SYBR thấy có người đến hót ầm lên “Có khách, có khách” thằng kẻ trộm đón chào ! Vì để xác định đột biến đoạn nôm na theo hướng vầy: Design lấy đôi primer bao lấy vị trí đoạn, đặc hiệu ổn Sau setup phản ứng PCR bình thường, có thêm SYBR Cho mẫu vào real-time PCR machine -nhớ chọn melting curve Ở bước Mcurve thấy độ đổ dốc amplicon đột biến không đột biến khác Khác bi nhiêu tùy đoạn dài hay ngắn Nhưng nói chung 10 nu đừng hi vọng Tốt nên chuyển sang dùng pp khác Mà pp khác vô khối, mà người phát minh chúng tài ! Kể PCR thông thường phát tài ! Nếu PCR bình thường, người ta phải thiết kế primer nằm vị trí đột biết Nếu xảy đột biến primer không bám vào sản phẩm Còn Realtime khác Như sv_ngheo nói cặp mồi bao lấy vị trí đột biến Trong trường hợp này, dù mẫu đột biến hay kiểu dại luôn có sản phẩm, phân tích Melting Peaks thấy Tm hai sản phẩm khác (1) Rõ ràng, việc kết luận dựa có hay sản phẩm PCR không an toàn, đặc biệt ứng dụng thực tế, mà nơi làm phản ứng PCR không trang bị Lab Sinh học phân tử thống người làm pư PCR lại cán nghiên cứu Sản phẩm pư không xuất phụ thuộc nhiều vào yếu tố khác không riêng DNA template bị đoạn (2) Việc kết luận dựa Melting Curves Analysis nói xác đến 100% Tất yếu tố ảnh hưởng đến (1) tác dụng với Realtime việc đưa kết luận Điểm khác biệt thứ khiến cho Realtime trở nên ưu việt PCR thông thường rất nhiều, Realtime kết luận mẫu phản ứng đồng hợp tử hay dị hợp tử dựa phân tích Melting curve Dĩ nhiên, chiến đấu end point với vũ khí điện di gel agarose làm điều Ngoài ra, vài ưu lặt vặt khác thời gian, công sức nên kể Đặc biệt: SYBR GREEN I không đắt So với PCR thường Realtime PCR có khả định lương tốt có độ nhạy (và độ đặc hiệu) cao hơn, lại cần thiết bị đại hóa chất tiêu hao đắt tiền Từ ta dễ dàng phân biệt ứng dụng hai kỹ thuật bạn Buồng ủ nhiệt làm kim loại dẫn nhiệt cao, đặt thiết bị peltier có cấu tạo mảnh kim loại đặc biệt đặt áp vào nhau, mảnh nối với cực nguồn điện điều chỉnh tự động để chiều dòng điện qua thiết bị thay đổi theo chiều hay theo chiều ngược lại Chính đổi chiều dòng điện làm cho mảnh kim loại thiết bị peltier nóng lên mặt lạnh mặt khác bị đảo ngược lại nhiệt độ, nghĩa mặt nóng bị lạnh mặt lạnh bị nóng lên Như chu kì nhiệt mà người sử dụng nhập vào vi xử lí máy sử dụng để điều khiển chiều cường độ dòng điện qua mảnh kim loại thiết bị peltier, làm cho buồng ủ nhiệt lên xuống nhiệt độ theo chu kì nhập vào Real-time PCR cải biến PCR thồng thống Vì độ đặc hiệu khác biệt PCR Real-time PCR, mà độ đặc hiệu primer việc tối ưu hóa quy trình định Real-time PCR có ưu điểm so với PCR truyền thống là: Độ nhạy cao hơn, sử dụng để định lượng tuyệt đối dựa tín hiệu huỳnh quang chạy với đường chuẩn, PCR truyền thống định lượng cách tương đối dựa vào cường độ sáng band điện di real-time PCR giúp rút ngắn thời gian làm thí nghiệm so với PCR truyền thống trải qua bước phân tích sau PCR PCR phát trình tự quan tâm dựa vào việc phát sản phẩm khuếch đại gel điện di Vậy độ đặc hiệu dựa vào bắt cặp đặc hiệu cặp mồi cộng thêm với xác định kích thước sản phẩm khuếch đại gel điện di Tuy nhiên, kích thước sản phẩm PCR xác định gel điện di, đặc biệt điện di agarose hay điện di acrilamide nhỏ có độ phân giải không cao Ngược lại, Độ đặc hiệu Realtime PCR khác, đặc hiệu cặp mồi cộng thêm độ đặc hiệu trình tự probe nằm hai mồi Xác suất để đoạn ADN khác nhân lên cặp mồi lại bắt cặp bổ sung với trình tự probe nhỏ nhiều, điều làm cho Realtime PCR có độ đặc hiệu cao (ngay sản phẩm PCR khuếch đại nhầm có kích thước với sản phẩm quan tâm tín hiệu phát ra!) Ngoài ra, Realtime PCR giúp xác định Tm sản phẩm PCR yếu tố làm cho đặc hiệu so với PCR truyền thống bạn Tóm lại, Realtime PCR đặc hiệu PCR truyền thống Real time PCR sử dụng nhiều y tế, bạn mà viêm gan B, bạn bác sỹ gợi ý làm định lượng HBV-DNA thực chất trình định lượng số đoạn AND virut viêm gan B có máu bệnh nhân ngày trước họ thường dùng hóa chất SybrGreeb cho rẻ, hóa chất độ xác đặc hiệu không cao sử dụng nhiều mồi (probe) Hiện ngừoi ta sử dụng hóa chất taqman có ưu điểm độ nhậy cao định lượng từ copy (đoạn ADN) mẫu lại đắt Biểu đồ chuẩn có trục hòanh số lượng DNA ban đầu bạn cho vào phản ứng chuẩn (thường gọi tắt standard), trục tung giá trị Ct thu từ phản ứng chuẩn Đường thẳng xuất biểu đồ gọi đường chuẩn Biểu đồ khuyếch đại thể nhân phản ứng real-time PCR Trục hòanh số chu kỳ PCR, trục tung thường cường độ hùynh quang thu từ ống phản ứng [...]... này làm cho Realtime PCR có độ đặc hiệu cao hơn (ngay cả sản phẩm PCR được khuếch đại nhầm có cùng kích thước với sản phẩm quan tâm thì cũng không có tín hiệu phát ra!) Ngoài ra, Realtime PCR còn có thể giúp chúng ta xác định được Tm của sản phẩm PCR cũng là yếu tố làm cho nó đặc hiệu hơn so với PCR truyền thống bạn ạ Tóm lại, Realtime PCR có thể sẽ đặc hiệu hơn PCR truyền thống Real time PCR hiện giờ... đã nhập vào Real- time PCR là một cải biến của PCR thồng thống Vì vậy về độ đặc hiệu không có sự khác biệt giữa PCR và Real- time PCR, mà độ đặc hiệu do chính primer và việc tối ưu hóa quy trình quyết định Real- time PCR có ưu điểm hơn so với PCR truyền thống là: Độ nhạy cao hơn, có thể sử dụng để định lượng tuyệt đối dựa trên tín hiệu huỳnh quang khi chạy cùng với đường chuẩn, trong khi đó PCR truyền... chất chỉ là "nhiễu" Threshold cycle và Baseline phải được đặt sao cho máy Real Time "không thèm chấp" các tín hiệu nhiễu này - Xác định giá trị Ct sao cho đúng đồng nghĩa với việc tìm được điều kiện phù hợp nhất, đúng đắn nhất để đo cường độ huỳnh quang ghe người ta nói real time PCR sử dụng SYBR Green I có độ nhạy cao hơn real time PCR sử dụng Taqman probe, molecular beacons điều này có đúng không ?... dựa trên Melting Curves Analysis thì có thể nói chính xác đến 100% Tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến (1) đều không có tác dụng với Realtime trong việc đưa ra kết luận Điểm khác biệt cơ bản thứ 2 khiến cho Realtime trở nên ưu việt hơn PCR thông thường rất rất nhiều, đó là Realtime có thể kết luận mẫu phản ứng là đồng hợp tử hay dị hợp tử dựa trên phân tích Melting curve Dĩ nhiên, chiến đấu end point với... cùng với đường chuẩn, trong khi đó PCR truyền thống chỉ có thể định lượng một cách tương đối dựa vào cường độ sáng trên band điện di và real- time PCR giúp rút ngắn thời gian làm thí nghiệm hơn so với PCR truyền thống do không phải trải qua các bước phân tích sau PCR PCR phát hiện được một trình tự quan tâm dựa vào việc phát hiện được sản phẩm khuếch đại trên gel điện di Vậy độ đặc hiệu của nó dựa vào... thời gian, công sức cũng nên được kể ra Đặc biệt: SYBR GREEN I không hề đắt So với PCR thường thì Realtime PCR có khả năng định lương tốt hơn và có độ nhạy (và có thể cả độ đặc hiệu) cao hơn, nhưng lại cần thiết bị hiện đại hơn và hóa chất tiêu hao đắt tiền hơn Từ đó ta có thể dễ dàng phân biệt được ứng dụng của hai kỹ thuật này bạn ạ Buồng ủ nhiệt được làm bằng kim loại dẫn nhiệt cao, đặt trên 1 thiết... trình PCR chuyện unspecific product là chuyện thường ngày ở huyện SYBR cứ thấy có người đến là hót ầm lên “Có khách, có khách” lắm khi thằng kẻ trộm cũng được đón chào ! Vì vậy để xác định đột biến mất đoạn thì nôm na nó theo hướng như vầy: Design lấy đôi primer bao lấy vị trí mất đoạn, càng đặc hiệu càng ổn Sau đó setup một phản ứng PCR bình thường, có thêm SYBR trong đó Cho mẫu vào real- time PCR machine... ứng PCR thông thường: Mồi, nhiệt độ bắt cặp, độ sách của mẫu, chất lượng buffer, enzyme - Với Hybridization probe & Hydrolysis probe: Cũng như vậy Độ nhạy của phản ứng cũng không phụ thuộc vào probe Nếu primers làm tốt chức năng của nó thì sẽ có sản phẩm PCR, còn việc probe có làm việc trên cái sản phẩm PCR đó hay không thì là chuyện khác Vấn đề thứ hai là độ chính xác (specificity) của phản ứng Realtime:... khác Mà pp khác thì vô khối, sao mà những người phát minh ra chúng tài năng vậy không biết ! Kể cả PCR thông thường cũng phát hiện được mới tài ! Nếu là PCR bình thường, người ta phải thiết kế primer nằm trên vị trí đột biết Nếu xảy ra đột biến thì primer không bám được vào và sẽ không có sản phẩm Còn Realtime thì khác Như sv_ngheo đã nói là cặp mồi sẽ bao lấy vị trí đột biến Trong trường hợp này, dù... hiệu của cặp mồi cộng thêm với xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại trên gel điện di Tuy nhiên, kích thước của sản phẩm PCR xác định trên gel điện di, đặc biệt là điện di agarose hay điện di acrilamide bản nhỏ có độ phân giải không cao Ngược lại, Độ đặc hiệu của Realtime PCR thì khác, ngoài sự đặc hiệu của cặp mồi còn được cộng thêm độ đặc hiệu của trình tự probe nằm giữa hai mồi Xác suất để một