Đang tải... (xem toàn văn)
Trong chương trình học của ngành chăn nuôi thú y thì vi sinh vật là môn quan trọng bởi qua nó ta hiểu biết về vi khuẩn, virus từ đó xác định chính xác bệnh trên vật nuôi. trong đó e. coli và sal là những loài vi khuẩn thường gặp gây bệnh trên nhiều vật nuôi, để phát hiện và điều trị bệnh do e. coli hoặc sal gây nên ta cần hiểu rõ đặc tính sinh hóa, sinh trường của chúng.
Thời gian: từ 18/01/2016 đến 21/01/2016 Địa điểm: phòng 119 khu thí nghiệm Đối tượng thí nghiệm: vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Salmonella (Sal.) Kết cần đạt: - Xác định vi khuẩn E coli Sal chủng thí nghiệm tiêu - sinh hóa vi khuẩn Hiểu biết cách làm đọc kết kháng sinh đồ Các ý trước vào phòng thí nghiệm: - Phải mặt áo blouse vào phòng thí nghiệm Trước, sau tiến hành thí nghiệm cần rửa tay cồn 70 để sát - trùng Trong trình thí nghiệm cần tuân thủ quy định phòng thí nghiệm Sau thí nghiệm cần vệ sinh phòng thí nghiệm trước Ngày 18/01/2016 1/ Tiến hành nuôi cấy thí nghiệm vi khuẩn E coli Sal 1.1/ Chuẩn bị: 1.1.1/ Dụng cụ thiết bị - Tăm vô trùng Que cấy thẳng, que cấy vòng trùng Đèn cồn Ống nghiệm trùng, đĩa petri Óng nghiệm để chứa môi trướng vận chuyển Cồn, khăn giấy, giá để ống nghiệm, microwave, micropipet 1.1.2/ Nguyên vật liệu: - Cồn - Môi trường vận chuyển NA ¼ - Môi trường tiền tăng sinh (BPW Buffered Peptone Water) cho Sal.monella - Môi trường tăng sinh (Rappaport ) cho Salmonella - Môi trường chuyên biệt cho E coli: EMB (Eosin Methylene Blue), MC (Mac Conkey) - Môi trường chuyên biệt cho Sal.monella: BGA (Brilliant Green Agar); XLD (Xylose lysine deoxycholate agar) - Các môi trường để kiểm tra sinh hóa: KIA (Kligler Iron Agar), Indole, MR_VP, Nutrient Broth, Ci (Simon Citrate Agar) - Thuốc thử hóa chất kiểm tra sinh hóa: kovac’s, methyl red KOH 40%, α napthol, giấy tẩm ure - Môi trường giữ trống NA (Nutrient Agar) 1.2/ Lấy mẫu: 1.2.1: Chuẩn bị môi trường vận chuyển: - Môi trường cần chuẩn bị để chứa mẫu môi trường NA 1/4 Môi trường cho vào microwave cho tan, sau chia vào ống nghiệm - có nắp đậy Đem ống nghiệm chứa môi trường trùng 121 oC/ 15 phút Sau trùng cần phải bảo quản lạnh liên tục để tránh nấm mốc phát triển làm hỏng môi trường 1.2.2: Lấy mẫu: - Cần chuẩn bị thấm nước, tăm vô trùng, ống nghiệm chứa môi - trường vận chuyển chuẩn bị để chứa mẫu bảo quản thùng đá Trước lấy mẫu cần vệ sinh vùng xung quanh hậu môn vật cần lấy - mẫu trách mẫu tạp Lấy tăm vô trùng cho vào hậu môn vật cho ngập phần gòn để lấy mẫu phân (chú ý: cho tăm vào cần phải ý theo co bóp - vòng hậu môn vật tránh gây tổn thương vật gây tạp mẫu) Mở ống nghiệm chứa môi trường hơ miệng ống nghiệm lửa đèn - cồn Cho tăm lấy mẫu vào (ngập môi trường) Hơ phần cán tăm (nơi tiếp xúc tay) bẻ bớt dài ống - nghiệm, hơ miệng ống nghiệm sau đậy nắp lại Luôn bảo quẩn lạnh mẫu trước nuôi cấy mẫu 1.3/ Tiến hành thí nghiệm: 1.3.1/ Nuôi cấy phân lập E coli Ngày 18/01/2016 1.3.1.1/ Chuẩn bị trước nuôi cấy: - Mẫu phân gà, phân chó chứa môi trường - vận chuyển Mẫu vi khuẩn E coli - chuẩn bị sẵn Đĩa petri chứa môi trường chuyên biệt để nuôi cấy E coli: + đĩa chứa môi trường MC Hình 1: Môi trường EMB (trái) môi trường MC (phải) + đĩa chứa môi trường EMB Mỗi đĩa môi trường - chia làm phần Que cấy, đèn cồn, cồn, 1.3.1.2/ Phân lập mẫu phân để xác định vi khuẩn E coli : Mẫu sử dụng: mẫu phân gà mẫu phân chó Môi trường nuôi cấy chuẩn bị: + đĩa chứa môi trường MC + đĩa chứa môi trường EMB * Cấy mẫu phân vào môi trường: - Mỗi phần chia đĩa môi trường chứa mẫu phân, đĩa khác môi trường có code mẫu - Hơ nóng que cấy vòng, để nguội - Lấy ống nghiệm chứa mẫu phân, hơ miệng ống nghiệm, dùng kẹp hơ qua lửa đèn cồn gắp tăm phần Hình 2: Cách cấy mẫu đĩa petri - Rút tăm cho vào đĩa petri, dàn phần Sau để tăm trở lại ống nghiệm hơ phần đầu tăm lửa đèn cồn trước đẩy hết vào ống nghiệm (tránh gây tạp mẫu) Hơ miệng ống nghiệm qua lửa đèn cồn trước đậy ống nghiệm lại - Dùng que cấy vòng dàn đếu phần mẫu đĩa petri theo hình zigzag: - Cấy tương tự đĩa lại ý code mẫu đĩa phải giống - Đem đĩa môi trường cấy ủ 24h 37 oc Hình 3: Mẫu cấy MC EMB (2 đĩa bên trái cấy mẫu phân chó gà, đĩa bên phải cấy mẫu có sẵn) Ngày 19/01/2016 - Sau 24h ủ, đọc kết được: • Trên môi trường EMB mẫu phân gà, phân chó: màu môi trường không thay đổi, khuẩn lạc màu tím có ánh kim • Trên môi trường MC mẫu phân gà, phân chó: màu môi trường không thay đổi, khuẩn lạc màu hồng nhạt có mây xung quanh Hình 4: Hình đối chiếu sau nuôi cấy → chọn số khuẩn lạc đặc trưng để chuẩn bị kiểm tra độ E coli 1.3.1.3/ nuôi cấy vi khuẩn E coli với mẫu sẵn có: - Mẫu sử dụng: mẫu vi khuẩn E coli cô chuẩn bị sẵn (mẫu E28d, - E28d4) Môi trường nuôi cấy chuẩn bị: + đĩa chứa môi trường MC + đĩa chứa môi trường EMB * Cấy mẫu vào môi trường: - Hơ nóng que cấy vòng, để nguội Dùng que cấy chọn khuẩn lạc rời, đặc trưng đĩa petri - chứa mẫu Đưa que cấy chứa mẫu vào đĩa petri chứa môi trường cần nuôi cấy, dàn theo hình zigzag (làm tương tự môi Hình 5: Mẫu cấy MC EMB (2 đĩa bên trái cấy mẫu phân chó gà, trường đĩa bên phải cấy mẫu có sẵn) - Cấy tương tự đĩa lại ý code mẫu đĩa phải giống Đem ủ 24h 37oc Sau 24h ủ, đọc kết được: o Trên môi trường EMB mẫu E.28d, E28d4: màu môi trường không thay đổi, khuẩn lạc màu tím có ánh kim o Trên môi trường MC mẫu E.28d, E28d4: màu môi trường không thay đổi, khuẩn lạc màu hồng nhạt có mây → Chọn số khuẩn lạc đặc trưng để Hình 6: Hình đối chiếu sau nuôi cấy chuẩn bị kiểm tra độ E coli Ngày 19/01/2016 1.3.1.4/ Kiểm tra E coli thuần: - Chọn đĩa petri khử trùng: + Đĩa 1: Chứa môi trường MC + Đĩa 2: Chứa môi trường EMB + Đĩa 3: Chứa môi trường NA Chia đĩa 10 phần (số phần chia - số khuẩn lạc xem đặc trưng mẫu nuôi cấy) Đọc đĩa petri chứa môi trường - chuyên biệt vi khuẩn E coli để chọn khuẩn lạc có đặc điểm đặc trưng E coli (đánh dấu lại) Dùng que cấy vòng hơ qua lửa đèn cồn, - để nguội chọn khuẩn lạc đánh dấu, sau Hình 7: Đĩa petri chia o cấy vào môi trường o Ở môi trường MC: Gạch đường thẳng vào khoảng phần chia Ở môi trường EMB: Thao tác tương tự môi trường MC o Ở môi trường NA: Cấy theo hình zigzag phần chia - Hình 8; Đĩa petri cấy mẫu Chú ý: • Chỉ lấy khuẩn lạc lần cho môi trường phải có vị trí đánh dấu đĩa môi trường • Cấy vào phần chọn để chứa vi khuẩn cấy đường thẳng • Khi cấy ý không cấy gần vách chia phần, không chạm vào - tâm, thành đĩa Tiếp tục làm tương tự với khuẩn lạc chọn lại phần đĩa Đem đĩa cấy ủ 24h 37oc Sau 24h ủ, đọc kết đĩa chứa môi trường MC đĩa môi trường EMB, khuẩn lạc đĩa thuần, ta chọn khuẩn lạc có code mẫu (với code mẫu môi trường trước) môi trường NA để làm thí nghiệm sinh hóa E coli → Chọn khuẩn lạc Hình 9: Đĩa petri sau nuôi cấy môi trường NA để làm thí nghiệm sinh hóa Ngày 20/01/2016 231.3.1.5/ Kiểm tra sinh hóa E coli: - Chuẩn bị ống nghiệm (đã trùng) • Ống 1: Chứa 5môi trường môi trường KIA • Ống 2: Chứa 2ml môi trường Indole • Ống 3: Chứa 2ml môi trường MR_VP(kiểm tra MR) • • Ống 4: Chứa 2ml môi trường MR_VP (kiểm tra VP) Ống 5: Chứa 4ml môi trường Ci → Đem ống nghiệm có chứa môi trường trùng, môi trường KIA môi trường có thạch nghiêng vạ thạch đứng, môi trường Ci môi trường thạch nghiêng cần để nghiên ống nghiệm để đảm bảo môi trường để tiến hành thí nghiệm - Chuẩn bị hóa chất, thuốc thử để kiểm tra sinh hóa: kovac’s, methyl red, - KOH 40%, α napthol Que cấy thẳng, ống nhỏ giọt Vi khuẩn xác định môi trường NA thí nghiệm trước * Tiến hành thí nghiệm: - Ống nghiệm 1: chứa môi trường KIA + Lấy que cấy thẳng chon khuẩn lạc + Đưa que cấy vào ống nghiệm theo đường thẳng đến phần đọng nước thạch nghiêng, sau tiếp tục đưa vào phần Hình 10: Kết nuôi cấy môi trường KIA thạch đứng (theo đường thẳng, không chạm đáy ống nghiệm) + Rút que cấy khỏi phần thạch đứng theo đường thẳng, đến phần thạch nghiêng di chuyển que cấy theo hình zigzag ngược lên que cấy khỏi phần thạch nghiêng + Ủ 24h 37ºc Ống nghiệm 2: chứa môt trường Indole (lỏng) + Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường + Ủ 24h 37ºC Hình 11: Kết nuôi cấy môi trường Indole Ống nghiệm 3: chứa môi trường MR_VP Hình 12: Kết nuôi cấy môi trường MR_VP + Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường + Ủ 24h 37ºC Ống nghiệm 4: chứa môi trường MR_VP + Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường + Ủ 24h 37ºC Hình 13: Kết nuôi cấy môi trường MR_VP - Ống nghiệm 5: chứa môi trường CI + Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, di chuyển que cấy theo hình chư Z ống nghiệm + Ủ 24h 37ºC + Sau 24h ủ, môi trường không đổi màu Hình 14: Kết nuôi cấy môi trường Ci Ngày 21/01/2016 * Tiến hành thí nghiệm tiêu sinh lý: Ống nghiệm (KIA): đọc kết Hình 15: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường KIA Ống nghiệm (Tryphtone): dùng ống nhỏ giọt lấy giọt thuốc thử Kovac’s cho từ từ vào ống nghiệm (thuốc thử chạy dọc thành ống nghiệm Ống nghiệm (MR_VP Broth): dùng Hình 16: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường Indole 10 Hình 20: Kết kiểm tra sinh hóa E coli Kết luận : Mẫu phân chó có chứa vi khầu E coli 1.3.2/ Thí nghiệm nuôi cấy phân lập Sal.: Ngày 18/01/2016 1.3.2.1 Chuẩn bị trước thí nghiệm: - Mẫu phân gà Mẫu vi khuẩn Sal chuẩn bị sẵn cô Đĩa petri chứa môi trường chuyên biệt Sal.: • đĩa chứa môi trường BGA • đĩa chứa môi trường XLD → Mỗi đĩa chia làm phần - Môi trường tiền tăng sinh BPV (Buffered Peptone Water) Môi trường tăng sinh Rappaport Que cấy, đèn cồn, cồn, túi nilon vô trùng, ống nghiệm, micropipette 1.3.2.2/ Phân lập mẫu phân để xác định vi khuẩn Sal.: - Do vi khuẩn Sal nhạy cảm với yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, bên thể động vật Nên sau lấy mẫu phân có vi khuẩn Sal chúng dễ chết -> không đủ số lượng cho trình nuôi cấy Vì trước - tiến hành nuôi cấy cần phục hồi tăng số lượng vi khuẩn lên Sau lấy mẫu phân phòng thí nghiệm (sử dụng mẫu dùng để nuôi cấy - E coli trước đó) Cho 9ml dung dịch môi trường tiền tăng sinh BPW vào túi nilon vô trùng → cho tăm chứa mẫu vào túi, khuấy nhẹ - Ủ 24h 37ºc Ngày 19/01/2016 Túi môi trường BPW chứa vi khuẩn đục - Giải thích: vi khuẩn phục hồi nên - môi trường bị đục Nuôi môi trường Rappaport để tăng số lượng vi khuẩn thí nghiệm Hình 21: Kết nuôi cấy Sal môi trường BPW + Cho 9ml dung dịch môi trường tăng sinh Rappaport vào túi nilon vô trùng + Dùng micropipette rút 1ml dung dịch nuôi cấy trước môi trường BPW cho vào túi nilon chứa môi trường Rappaport - Ủ 24h 37ºC Ngày 20/01/2016 Túi chứa môi trường đục vi khuẩn tăng lên số lượng Hình 22: Kết nuôi cấy Sal môi trường tăng sinh rappaport (Chú ý: nuôi cấy không cho tay vào túi nilon, cần hơ thành miệng bình môi trường qua lửa đèn cồn trước đổ môi trường vào túi) Ngày 21/01/2016 - Cấy vào môi trường chuyên biệt cho Sal.: môi trường XLD, môi trường BGA Ủ 24h 37oC Ngày 22/01/2016 - Sau 24h ủ, đọc kết quả: + Trong đĩa môi trường XLD: môi trường từ màu cam chuyển sang màu đỏ, khuẩn lạc vàng, vi khuẩn E coli + Trong đĩa môi trường BGA: môi trường từ màu vàng xanh chuyển sang màu vàng, khuẩn lạc vàng, vi khuẩn E coli Hình 23: Kết nuôi cấy môi trường BGA (trái) XLD (phải) → Kết luận: mẫu phân gà vi khuẩn Sal., có vi khuẩn E coli 1.3.2.3/ Nuôi cấy vi khuẩn Sal với mẫu sẵn có: Ngày 18/01/2016 - Mẫu sử dụng: mẫu vi khuẩn Sal cô chuẩn bị sẵn (mẫu Sal.139, - Sal.102a, Sal.148a2, Sal.148a21) Môi trường nuôi cấy chuẩn bị: + đĩa chứa môi trường BGA + đĩa chứa môi trường XLD * Cấy mẫu vào môi trường: - Hơ nóng Dùng que cấy vòng, để nguội que cấy chọn khuẩn lạc rời, đặc trưng - đĩa Đưa que petri chứa mẫu cấy chứa mẫu vào đĩa petri chứa môi trường cần nuôi cấy, dàn theo hình zigzag, đường cấy dày thưa dần đường cấy - Cấy 4Hình 24: Đĩa petri cấy mẫu(làm tương tự môi trường) tương tự đĩa lại ý code mẫu - đĩa phải Đem ủ giống 24h 37oC Ngày 19/01/2016 - Sau 24h ủ, đọc kết được: o Trên môi trường XLD mẫu Sal.102a, Sal.148a21, Sal.139, Sal.148a2: môi trường từ màu cam chuyển sang màu hồng đỏ, khuẩn lạc tròn có tâm đen rìa trắng, lồi bề mặt môi trường o Trên môi trường BGA mẫu Sal.102a, Sal.148a21, Sal.139, Sal.148a2: môi trường từ màu vàng xanh chuyển sang màu đỏ, khuẩn lạc tròn, có màu hồng sữa → Chọn số khuẩn lạc đặc trưng để chuẩn bị kiểm tra độ Sal Hình 25: Kết nuôi cấy Sal Ngày 19/01/2016 1.3.2.4/ Kiểm tra độ Sal.: - Chọn đĩa petri khử trùng: + Đĩa 1: chứa môi trường XLD + Đĩa 2: chứa môi trường BGA + Đĩa 3: chứa môi trường NA - Chia đĩa 10 phần (số phần chia số khuẩn lạc chọn - mẫu nuôi cấy) Đọc đĩa petri chứa môi trường chuyên biệt (XLD BGA) vi khuẩn Sal để chọn khuẩn lạc có đặc điểm đặc trưng Sal - (đánh dấu lại) Dùng que cấy vòng hơ qua lửa đèn cồn, để nguội chọn khuẩn lạc đánh dấu, sau cấy vào môi trường o Ở môi trường XLD: gạch đường thẳng vào khoảng o o • phần chia Ở môi trường BGA: thao tác tương tự môi trường MC Ở môi trường NA: cấy theo hình zigzag phần chia Chú ý: Hình 26: Đĩa petri cấy mẫu o Chỉ lấy khuẩn lạc lần cho mẫu phải có vị trí o đánh dấu đĩa môi trường Cấy vào phần chọn để chứa vi khuẩn cấy đường thẳng o Khi cấy ý không cấy đè lên vách chia phần, không chạm - vào tâm, thành đĩa) Tiếp tục làm tương tự với khuẩn lạc chọn lại phần đĩa Đem đĩa cấy ủ 24h 37oc Sau 24h ủ, đọc kết đĩa chứa môi trường XLD đĩa môi trường BGA, khuẩn lạc đĩa thuần, ta chọn khuẩn lạc có code mẫu (với code mẫu môi trường trước) môi trường NA để làm thí nghiệm sinh hóa Sal Hình 27: Đĩa petri sau nuôi cấy → Chọn khuẩn lạc môi trường NA để làm thí nghiệm sinh hóa Ngày 20/10/2016 1.3.2.5/ Kiểm tra sinh hóa Sal - Chuẩn bị ống nghiệm (đã trùng) o Ống 1: chứa môi trường KIA/TSI o Ống 2: chứa môi trường Indole o Ống 3: chứa môi trường MR_VP o Ống 4: chứa môi trường NB o Ống 5: chứa môi trường CI → Đem ống nghiệm có chứa môi trường trùng - Chuẩn bị hóa chất, thuốc thử để kiểm tra sinh hóa: kovac’s, KOH 10%, α - napthol, giấy tẩm Ure Que cấy thẳng, ống nhỏ giọt Vi khuẩn xác định môi trường NA thí nghiệm • trước Tiến hành thí nghiệm: - Ống nghiệm 1: chứa môi trường KIA o Lấy que cấy thẳng chon khuẩn lạc o Đưa que cấy vào ống nghiệm theo đường thẳng đến phần đọng nước thạch nghiêng, sau tiếp tục đưa vào phần thạch đứng (theo đường thẳng, không chạm đáy ống nghiệm) o Rút que cấy khỏi phần thạch Hình 28: Kết nuôi cấy môi trường KIA đứng theo đường thẳng, đến phần thạch nghiêng di chuyển que cấy theo hình zigzag ngược lên que cấy khỏi phần thạch nghiêng o Ủ 24h 37ºc - Ống nghiệm 2: chứa môt trường Indole (lỏng) o Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường o Ủ 24h 37ºC Hình 29: Kết nuôi cấy môi trường Indole Ống nghiệm 3: chứa môi trường NB o Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường o Cho giấy tẩm ure vào môi trường o Ủ 24h 37ºC Hình 30: Kết nuôi cấy môi trường NB - Ống nghiệm 4: chứa môi trường MR_VP o Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi o o trường Ủ 24h 37ºC Sau 24h ủ, môi trường đục Hình 31: Kết nuôi cấy môi trường MR_VP - Ống nghiệm 5: chứa môi trường CI o Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường cho vào ống nghiệm, di chuyển que cấy theo hình chư Zigzag ống nghiệm o Ủ 24h 37ºC Hình 32: Kết nuôi cấy môi trường Ci Ngày 21/01/2016 * Tiến hành thí nghiệm tiêu sinh hóa: Ống nghiệm 1: Trên ống môi trường KIA phần thạch đứng từ màu đỏ chuyển sang vàng, glucose (+); phần thạch nghiêng có màu đỏ, lactose (-); xuất thêm màu đen thạch đứng đôi khiHình 33: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường KIA có thạch nghiêng, H2S (+); khối thạch bị đẩy lên, sinh (+) Ống nghiệm 2: sau 24h ủ, môi trường đục Dùng ống nhỏ giọt cho giọt thuốc thử Kovac’s từ từ vào ống nghiệm (thuốc thử chạy dọc thành ống nghiệm), bề mặt tiếp xúc có màu vàng xanh vi khuẩn khả sinh Indole Hình 34: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường Indole Ống nghiệm 3: sau 24h ủ, môi trường từ màu trắng chuyển sang màu hồng nhạt, ure (-) Hình 35: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường NB Ống nghiệm 4: sau 24h ủ, môi trường đục, tiếp tục cho giọt thuốc thử α napthol vào ống nghiệm lắc đều, cho tiếp giọt dung dịch KOH 40% vào ống nghiệm Không xuất màu đỏ nhạt môi trường, tức VP (-) Hình 36: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường MR_VP Ống nghiệm 5: sau 24h ủ, môi trường từ màu xanh chuyển sang màu xanh dương, Ci (+) Hình 37: Kết kiểm tra sinh hóa môi trường Ci * đọc kết Bảng 2: Các đặc điểm vi khuẩn Sal.: Môi trườn g Thuốc thử Lên Glucose Lên Lactose Sinh H2S Sinh KIA Indole Kovac’s Ure MR_VP Ci Phản ứng Voges Proskauer Hiện tượng men Vi khuẩn Sal Mẫu Mẫu 148a2 102a Môi trường từ màu đỏ + chuyển sang vàng màu men đen phần thạch đứng, phần thạch nghiêng có màu + đỏ, khối thạch bị đẩy lên + Trên mặt môi trường nơi Khả sinh tiếp xúc với thuốc thử indole chuyển sang màu vàng xanh Môi trường chuyển sang màu hồng nhạt Phát vsv tạo sản phẩm trung tính Môi trường có màu cafe sữa trình lên men glucose Môi trường chuyển từ màu xanh sang màu xanh + dương Hình 38: Kết kiểm tra sinh hóa Sal Kết luận : Mẫu phân chó có chứa vi khầu E coli + + + - - + 2/ Quan sát vi khuẩn E coli Sal qua kính hiển vi phương pháp nhuộm đơn (Do xác định vi khuẩn thuộc Gram âm từ thí nghiệm trước đó) 2.1/ Chuẩn bị 2.1.1 Thiết bị dụng cụ: - Kính hiển vi - Cốc thủy tinh chứa nước cất - Que cấy - Đèn cồn, bình tia chứa cồn, nước cất - Lame kính 2.1.2/ Nguyên vật liệu: - Đĩa petri chứa vi khuẩn cần quan sát Thuốc nhuộm: safranin, fuchsin 2.2/ Tiến hành nhuộm đơn: Bước 1: Làm vết bôi( trải trùng) - Nhỏ giọt nước vô trùng lên phiến kính, Dùng que cấy khử để nguội, lấy vi khuẩn từ môi trường NA hòa vào giọt nước phiến kính hòa trải mỏng mặt kính, Bước 2: Cố định mẫu: Hơ nhẹ phiến kính đèn cồn 3-4 lần cho khô bề mặt kính Mục đích: • • • Giết chết tế bào sống Gắn chặt tế bào sống vào phiến kính để rửa tế bào không bị trôi Làm cho tế bào dễ bắt màu Bước 3: Nhuộm màu Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn (Blue methylen 0,1% hay Fuchsin Ziecl) lên vết trải 30 giây Rửa nước, hơ lửa đèn cồn cho phiến kính khô (không để gần lửa tránh nóng) Quan sát kính hiển vi Đưa tiêu lên mâm kính Điều chỉnh ốc vi cấp ốc thứ cấp để quan sát rõ mẫu vật kính X10, sau chuyển sang vật kính X40, X100, nhỏ giọt dầu soi kính Chỉnh ốc vi cấp để có hình ảnh chuẩn 3/ T hự c Hình 39: vi khuẩn Sal mẫu 148a2 kính hiển vi kháng sinh đồ: 3.1/ chuẩn bị: 3.1.1/ Dụng cụ thiết bị - Que cấy, đèn cồn, bình tia chứa cồn, kẹp gắp, đĩa petri, ống nghiệm Que tăm vô trùng Thước đo mm, máy lắc 3.1.2/ Nguyên vật liệu - Đĩa petri chứa vi khuẩn gây E coli Sal môi trường NA Môi trường MHA (Muller Hinton Agar) Đĩa giấy tẩm kháng sinh (amoxicillin and clavulanic acid (Ac), gentamicin (Ge), neomycin (Ne), tetracycline (Te), nalidixic acid (Ng), ciprofloxacin (Ci), - trimethoprim sulfamethoxazoic (Bt)) Nước muối sinh lí 9o/oo ( pha 300ml nước cất 2,7g NaCl ) Ống đo độ đục chuẩn McFarland 0.5 3.2/ Tiến hành thí nghiệm: • Chọn khuẩn lạc từ môi trường NA nuôi cấy trước (chọn khuẩn lạc E coli, khuẩn lạc Sal.) • Dùng que cấy hơ qua lửa đèn cồn, để nguội lấy khuẩn lạc chọn hòa vào ống nghiệm chứa 2ml nước sinh lý, dùng máy Vortex lắc để đạt độ đục tương đương với ống so độ đục chuẩn McFarland 0.5 (thực với ống nghiệm chứa mẫu E coli Sal Phải ghi code mẫu lên ống nghiệm) • Lấy tăm vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi khuẩn pha loãng • Cho tăm chứa vi khuẩn trải đĩa petri chứa môi trường MHA, (từ xuống dưới, từ trái sang phải vòng quanh bên ngoài, chờ thạch khô) • Sau gắn giấy tẩm kháng sinh vào đĩa thạch (đĩa kháng sinh mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh) Phải đảm bảo đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch • Lật ngược đĩa cho vào tủ ấm với nhiệt độ 37 0C 24h • Sau 24h ủ, đọc kết quả: bề mặt đĩa petri xuất vòng tròn vi khuẩn phát triển (vòng vô khuẩn) xung quanh đĩa kháng sinh *Đo đường kính vòng vô trùng để xác định tính nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh đó, sau so với khuần đường kính vòng vô khuần Bảng 3: Độ nhạy cảm E coli Sal số loại kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn (mm) stt kháng sinh Nhạy cảm trung bình (mm) Vi khuẩn E coli Kết Ac 14 -17 21 Ge 13 -14 21 Kết luận Kết quả) Kết luận Nhạy 26 Nhạy Nhạy 20 Nhạy Kháng 15 Kháng Nhạy 17 Nhạy trung 37 Nhạy 27 33 Nhạy Nhạy Ne 16-19 14 Te 12-14 16 Ci 16-20 20 Nhạy 12 bình Kháng Kháng Ng Bt 14-18 11 – 15 Vi khuẩn Sal Hình 40: Các loại kháng sinh sử dụng để làm kháng sinh đồ Kết luận: - Những sinh loại Hình 41: kháng sinh đồ kháng nhạy với vi khuẩn E coli amoxicillin and clavulanic acid, gentamicin, tetracycline; kháng sinh vi khuẩn Sal nhạy cảm với kháng sinh ciprofloxacin, nalidixic acid trimethoprim sulfamethoxazoic, cán thú y tiếp tục sử dụng loại kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia - súc gia cầm E coli Sal gây Những loại kháng sinh bị vi khuẩn E coli đề kháng neomycin (Ne), nalidixic acid (Ng), trimethoprim sulfamethoxazoic (Bt)) [...]... nh y cảm của vi khuẩn với kháng sinh đó, sau đó so với các khuần đường kính vòng vô khuần Bảng 3: Độ nh y cảm của E coli và Sal đối với một số loại kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn (mm) stt kháng sinh Nh y cảm trung bình (mm) 1 2 3 4 5 6 7 Vi khuẩn E coli Kết quả Ac 14 -17 21 Ge 13 -14 21 Kết luận Kết quả) Kết luận Nh y 26 Nh y Nh y 20 Nh y Kháng 15 Kháng Nh y 17 Nh y trung 37 Nh y 27 33 Nh y Nh y. .. trường nuôi c y đã chuẩn bị: + 2 đĩa chứa môi trường BGA + 2 đĩa chứa môi trường XLD * C y mẫu vào môi trường: - Hơ nóng Dùng que c y vòng, để nguội que c y chọn 1 khuẩn lạc rời, đặc trưng - trên đĩa Đưa que petri chứa mẫu c y chứa mẫu vào đĩa petri chứa môi trường cần nuôi c y, dàn đều theo hình zigzag, đường c y 1 và 2 d y và thưa dần ở đường c y 3 - và C y 4Hình 24: Đĩa petri đã c y mẫu(làm tương... nuôi c y trên môi trường Indole Ống nghiệm 3: chứa môi trường NB o Dùng que c y l y khuẩn lạc trên môi trường cho vào ống nghiệm, khu y nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường o Cho gi y tẩm ure vào môi trường o Ủ trong 24h ở 37ºC Hình 30: Kết quả nuôi c y trên môi trường NB - Ống nghiệm 4: chứa môi trường MR_VP o Dùng que c y l y khuẩn lạc trên môi trường cho vào ống nghiệm, khu y nhẹ cho vi khuẩn vào môi... lạc vàng, đó là vi khuẩn E coli + Trong đĩa môi trường BGA: môi trường từ màu vàng xanh chuyển sang màu vàng, khuẩn lạc vàng, đó là vi khuẩn E coli Hình 23: Kết quả nuôi c y trên môi trường BGA (trái) và XLD (phải) → Kết luận: trong mẫu phân gà không có vi khuẩn Sal., nhưng có vi khuẩn E coli 1.3.2.3/ Nuôi c y vi khuẩn Sal với mẫu sẵn có: Ng y 18/01/2016 - Mẫu sử dụng: mẫu vi khuẩn Sal của cô đã chuẩn... nuôi c y Vì v y trước - khi tiến hành nuôi c y cần phục hồi và tăng số lượng vi khuẩn lên Sau khi l y mẫu phân về phòng thí nghiệm (sử dụng mẫu đã dùng để nuôi c y - E coli trước đó) Cho 9ml dung dịch môi trường tiền tăng sinh BPW vào túi nilon vô trùng → cho tăm bông chứa mẫu vào túi, khu y nhẹ - Ủ trong 24h ở 37ºc Ng y 19/01/2016 Túi môi trường BPW chứa vi khuẩn vẫn đục - Giải thích: do vi khuẩn phục... 12-14 16 Ci 16-20 20 Nh y 12 0 bình Kháng Kháng Ng Bt 14-18 11 – 15 Vi khuẩn Sal Hình 40: Các loại kháng sinh sử dụng để làm kháng sinh đồ Kết luận: - Những sinh loại Hình 41: kháng sinh đồ kháng nh y với vi khuẩn E coli là amoxicillin and clavulanic acid, gentamicin, tetracycline; ngoài các kháng sinh trên vi khuẩn Sal còn nh y cảm với các kháng sinh là ciprofloxacin, nalidixic acid và trimethoprim sulfamethoxazoic,... tăng sinh rappaport (Chú ý: khi nuôi c y không cho tay vào túi nilon, cần hơ thành miệng bình môi trường qua ngọn lửa đèn cồn trước khi đổ môi trường vào túi) Ng y 21/01/2016 - C y vào môi trường chuyên biệt cho Sal.: môi trường XLD, môi trường BGA Ủ trong 24h ở 37oC Ng y 22/01/2016 - Sau 24h ủ, đọc kết quả: + Trong đĩa môi trường XLD: môi trường từ màu cam chuyển sang màu đỏ, khuẩn lạc vàng, đó là vi. .. kính hiển vi hiện kháng sinh đồ: 3.1/ chuẩn bị: 3.1.1/ Dụng cụ và thiết bị - Que c y, đèn cồn, bình tia chứa cồn, kẹp gắp, đĩa petri, ống nghiệm Que tăm bông vô trùng Thước đo mm, m y lắc 3.1.2/ Nguyên vật liệu - Đĩa petri chứa vi khuẩn g y E coli và Sal trên môi trường NA Môi trường MHA (Muller Hinton Agar) Đĩa gi y tẩm kháng sinh (amoxicillin and clavulanic acid (Ac), gentamicin (Ge), neomycin (Ne),... 2/ Quan sát vi khuẩn E coli và Sal qua kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm đơn (Do đã xác định vi khuẩn thuộc Gram âm từ thí nghiệm trước đó) 2.1/ Chuẩn bị 2.1.1 Thiết bị và dụng cụ: - Kính hiển vi - Cốc th y tinh chứa nước cất - Que c y - Đèn cồn, bình tia chứa cồn, nước cất - Lame kính 2.1.2/ Nguyên vật liệu: - Đĩa petri chứa vi khuẩn cần quan sát Thuốc nhuộm: safranin, fuchsin 2.2/ Tiến hành nhuộm... mẫu và phải có cùng vị trí o đánh dấu trên 3 đĩa môi trường C y vào đúng phần đã chọn để chứa vi khuẩn và chỉ c y một đường thẳng duy nhất o Khi c y chú ý không được c y đè lên vách chia các phần, không chạm - vào tâm, thành ngoài của đĩa) Tiếp tục làm tương tự với các khuẩn lạc đã chọn còn lại trên các phần đĩa Đem đĩa đã c y đi ủ trong 24h ở 37oc Sau 24h ủ, đọc kết quả trên đĩa chứa môi trường XLD và