TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6402:2007 ISO 6785:2001 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA – PHÁT HIỆN SALMONELLA Milk and milk products – Detection of Salmonella Lời nói đầu TCVN 6402:2007 thay TCVN 6402:1998; TCVN 6402:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 6785:2007/IDF 93:2001; TCVN 6402:2007 Ban Kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA – PHÁT HIỆN SALMONELLA Milk and milk products – Detection of Salmonella Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát Salmonella sữa sản phẩm sữa Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6263:2007 (ISO 8261:2001), Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn chung chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng định nghĩa sau đây: 3.1 Salmonella (Salmonella) Các vi sinh vật hình thành khuẩn lạc điển hình mơi trường đặc chọn lọc có đặc tính sinh hóa huyết phù hợp với mô tả tiêu chuẩn 3.2 Phát salmonella (detection of Salmonella) Việc phát có mặt hay khơng loại vi sinh vật khối lượng hay thể tích cụ thể, tiến hành thử theo tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Khái quát Việc phát Salmonella cần thực bốn giai đoạn liên tục (xem Phụ lục A) 4.2 Tiền tăng sinh môi trường lỏng không chọn lọc Cấy phần mẫu thử vào môi trường tiền tăng sinh thích hợp ủ ấm 37ºC từ 16 h đến 20 h 4.3 Tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc Cấy dịch cấy thu 4.2 vào môi trường Rappaport-Vasiliadis cải tiến magiê clorua/xanh malachit môi trường selenit/xystin Ủ môi trường Rappaport-Vasiliadis cải tiến clorua/xanh malachit nồi cách thủy tủ ấm (6.4) đặt 41,5 ºC 24 h 24 h Ủ môi trường selenit/xystin tủ ấm (6.3) đặt 37 ºC 24 h 24 h 4.4 Cấy ria lên đĩa nhận dạng Cấy dịch cấy thu (4.3) hai môi trường đặc chọn lọc (thạch lục sáng/đỏ phenol môi trường đặc chọn lọc thích hợp) CHÚ THÍCH Mơi trường thích hợp cho phép nhận chủng Salmonella lên men lactoza Ủ môi trường thạch lục sáng/đỏ phenol tủ ấm (6.3) đặt 37 ºC kiểm tra sau 20 h đến 24 h, cần, sau 40 h đến 48 h kiểm tra lại có mặt khuẩn lạc mà từ đặc tính chúng coi Salmonella giả định Ủ môi trường đặc chọn lọc thứ hai nhiệt độ thích hợp kiểm tra sau khoảng thời gian thích hợp có mặt khuẩn lạc mà từ đặc tính chúng coi Salmonella giả định 4.5 Khẳng định Cấy truyền khuẩn lạc coi Salmonella (4.4) khẳng định qua thử nghiệm sinh hóa huyết học Môi trường nuôi cấy, thuốc thử huyết Để tăng độ tái lập kết quả, nên sử dụng thành phần khơ, mơi trường hồn chỉnh khơ để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn nhà sản xuất Chỉ sử dụng loại thuốc thử công nhận loại tinh khiết phân tích, trừ có qui định khác Các giá trị pH đề cập qui nhiệt độ 25 ºC Nếu cần, điều chỉnh cách thêm axit clohydric [c(HCl) = mol/l] dung dịch natri hydroxit [c(NaOH) = mol/l] Nếu môi trường nuôi cấy thuốc thử chưa sử dụng phải bảo quản chỗ tối nhiệt độ từ 0ºC đến + 5ºC không tháng điều kiện không làm biển đổi thành phần chúng, trừ có qui định khác 5.1 Nước Sử dụng nước cất nước khử khoáng nước có chất lượng tương đương Nước khơng chứa chất ức chế phát triển vi sinh vật điều kiện thử nghiệm qui định tiêu chuẩn 5.2 Môi trường nuôi cấy 5.2.1 Môi trường tiền tăng sinh: nước đệm pepton 5.2.1.1 Thành phần Pepton 10,0 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g Dinatri hydrooctophosphat ngậm 12 phân tử nước (Na 2HPO4.12H2O) 9,0 g Kali dihydrooctophosphat (KH 2PO4) 1,5 g Nước 000 ml 5.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,1 Chuyển 225 ml mơi trường vào bình tam giác 500 ml (6.8) (hoặc theo bội số 225 ml vào bình có dung tích thích hợp) Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) đặt 121 ºC Làm nguội đến nhiệt độ phịng 5.2.2 Mơi trường tăng sinh chọn lọc thứ nhất: môi trường Rappaport-Vasiliadis cải tiến magiê clorua/xanh malachit (canh thang RVS) 5.2.2.1 Dung dịch A 5.2.2.1.1 Thành phần Dịch thủy phân đậu tương enzym 5,0 g Natri clorua (NaCl) 8,0 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,4 g Dikali hydro phosphat (K2HPO4) 0,2 g Nước 000 ml 5.2.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng đến khoảng 70 ºC Chuẩn bị dung dịch A ngày chuẩn bị mơi trường RVS hồn chỉnh 5.2.2.2 Dung dịch B 5.2.2.2.1 Thành phần Magiê clorua ngậm phân tử nước (MgCl2.6H2O) Nước 400,0 g 000 ml 5.2.2.2.2 Chuẩn bị Hịa tan magiê clorua nước Vì magiê clorua loại muối hút ẩm, nên tốt hịa tan tồn lượng MgCl2.6H2O từ hộp đựng vừa mở nắp Ví dụ, cho 250 g MgCl 2.6H2O vào 625 ml nước, để có dung dịch 795 ml với nồng độ MgCl2.6H2O khoảng 0,3 g/ml Dung dịch B bảo quản chai thủy tinh màu nâu, kín khí, nhiệt độ phịng năm 5.2.2.3 Dung dịch C 5.2.2.3.1 Thành phần Malachit xanh oxalat Nước 0,4 g 100 ml 5.2.2.3.2 Chuẩn bị Hòa tan malachit xanh oxalat nước Dung dịch C bảo quản chai thủy tinh màu nâu tháng 5.2.2.4 Mơi trường hồn chỉnh 5.2.2.4.1 Thành phần Dung dịch A (5.2.2.1) 000 ml Dung dịch B (5.2.2.2) 100 ml Dung dịch C (5.2.2.3) 10 ml 5.2.2.4.2 Chuẩn bị Cho 100 ml dung dịch B 10 ml dung dịch C vào 000 ml dung dịch A Chỉnh pH cho sau khử trùng 5,2 ± 0,1, cần Phân phối 10 ml dung dịch thu vào ống nghiệm (6.9) bình vơ trùng (6.8) có dung tích thích hợp, để thu phần cần thiết cho phép thử Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) đặt 115 ºC Bảo quản môi trường chuẩn bị tủ lạnh ºC ± ºC 5.2.3 Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ hai: môi trường selenit/xystin CẢNH BÁO Phải đặc biệt thận trọng sử dụng dung dịch selenit độc tính tiềm ẩn chúng Trong tình khơng hút miệng 5.2.3.1 Môi trường 5.2.3.1.1 Thành phần Trypton 5,0 g Lactoza 4,0 g Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân từ nước (Na2HPO4.12H2O) Natri hydro selenit Nước 10,0 g 4,0 g 000 ml 5.2.3.1.2 Chuẩn bị Hòa tan ba thành phần nước cách đun sôi phút Sau để nguội cho thêm natri hydro selenit Chỉnh pH để sau khử trùng pH 7,0 ± 0,1, cần không khử trùng 5.2.3.2 Dung dịch L-Xystin 5.2.3.2.1 Thành phần L-Xystin 0,1 g Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = mol/l 15 ml Nước vô trùng ≈ 85 ml 5.2.3.2.2 Chuẩn bị Cho thành phần vào bình cầu vơ trùng định mức vạch 100 ml Pha lỗng nước vô trùng đến vạch mức Không khử trùng 5.2.3.3 Mơi trường hồn chỉnh 5.2.3.3.1 Thành phần Mơi trường (5.2.3.1) 000 ml Dung dịch L-Xystin (5.2.3.2) 10 ml 5.2.3.3.2 Chuẩn bị Cho dung dịch L-Xystin cách vô trùng vào môi trường Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,1, cần Phân phối môi trường cách vơ trùng vào bình vơ trùng có dung tích thích hợp để có phần cần thiết cho thử nghiệm Mơi trường sử dụng khu xuất kết tủa đỏ 5.2.4 Môi trường đặc chọn lọc thứ nhất: Thạch lục sáng/đỏ phenol (Edel Kampelmacher) 5.2.4.1 Môi trường 5.2.4.1.1 Thành phần Cao thịt bò 5,0 g Pepton 10,0 g Cao men 3,0 g Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4) 1,0 g Natr dihydrophosphat (NaH2PO4) 0,6 g Thạch Từ 12 g đến 18 g a) Nước 900 ml a) Tùy thuộc vào sức đơng thạch 5.2.4.1.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH, cần, cho sau khử trùng 7,0 ± 0,1 Chuyển môi trường vào ống nghiệm (6.9) bình tam giác (6.8) có dung tích thích hợp Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) đặt 121 ºC 5.2.4.2 Dung dịch đường/đỏ phenol 5.2.4.2.1 Thành phần Lactoza 10,0 g Sucroza 10,0 g Đỏ phenol 0,09 g Nước ≈ 80 ml 5.2.4.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần khoảng 50 ml nước đựng bình cầu định mức vạch 100 ml Pha lỗng nước đến vạch Làm nóng dung dịch 20 phút nồi cách thủy (6.5) để 70 ºC Làm nguội nồi cách thủy (6.5) khác để 55 ºC Sử dụng dung dịch sau làm nguội 5.2.4.3 Dung dịch lục sáng 5.2.4.3.1 Thành phần Lục sáng (xem yêu cầu phụ lục B) Nước Khoảng 0,5 g 100 ml 5.2.4.3.2 Chuẩn bị Hòa tan lục sáng nước Bảo quản dung dịch ngày nơi tối để tự khử trùng 5.2.4.4 Mơi trường hồn chỉnh 5.2.4.4.1 Thành phần Môi trường (5.2.4.1) 900 ml Dung dịch đường/đỏ phenol (5.2.4.2) 100 ml Dung dịch lục sáng (5.2.4.3) ml 5.2.4.4.2 Chuẩn bị Cho dung dịch lục sáng (5.2.4.3) cách vô trùng vào dung dịch đường/đỏ phenol (5.2.4.2) làm nguội nồi cách thủy (6.5) đến 55 ºC Cho dung dịch vào môi trường bản, làm nóng trước nồi cách thủy đến 55 ºC trộn Trong trình trộn, nhiệt độ nồi cách thủy cần giữ 50ºC đến 55 ºC 5.2.4.4.3 Chuẩn bị đĩa thạch Với lượng thích hợp đĩa petri lớn (6.12) cho vào đĩa khoảng 40 ml mơi trường hồn chỉnh vừa với chuẩn bị (5.2.4.4) Nếu khơng có sẵn đĩa lớn cho đĩa nhỏ (6.12) đĩa khoảng 15 ml môi trường Để cho đông đặc Nếu đĩa thạch chuẩn bị trước bảo quản không h nhiệt độ phịng khơng q tuần nhiệt độ từ ºC đến + ºC Ngay trước sử dụng, làm khô đĩa thạch cẩn thận (tốt mở nắp đĩa lật úp mặt thạch xuống dưới) tủ sấy (6.2) đặt 50 ºC đặt tủ thơng khí tốt (6.2) bề mặt thạch khô 5.2.5 Môi trường đặc chọn lọc thứ hai Việc chọn mơi trường thứ hai phịng thử nghiệm chọn 5.2.6 Thạch dinh dưỡng 5.2.6.1 Thành phần Cao thịt 3,0 g Pepton 5,0 g Thạch Từ 12 g đến 18 g b) Nước 000 ml b) Tùy thuộc vào sức đông thạch 5.2.6.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trường khơ mơi trường hồn chỉnh khơ nước, cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,1, cần Chuyển môi trường vào ống nghiệm (6.9) chai (6.8) có dung tích thích hợp Khử trùng mơi trường 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) đặt nhiệt độ 121 ºC 5.2.6.3 Chuẩn bị đĩa thạch Chuyển khoảng 15 ml môi trường tan chảy vào đĩa Petri (6.12) vô trùng tiến hành theo 5.2.4.4.3 5.2.7 Thạch đường/sắt III (thạch TSI) 5.2.7.1 Thành phần Cao thịt 3,0 g Cao men 3,0 g Pepton Natri clorua 20,0 g 5,0 g Lactoza 10,0 g Sucroza 10,0 g Glucoza 1,0 g Sắt (II) xitrat 0,3 g Natri thiosunfat 0,3 g Đỏ phenol 0,024 g Thạch Từ 12 g đến 18 g c) Nước 000ml c) Tùy thuộc vào sức đơng thạch 5.2.7.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trừng pH 7,4 ± 0,1, cần Phân phối môi trường theo lượng 10 ml vào ống nghiệm (6.9) có đường kính từ 17 mm đến 18 mm Khử trùng môi trường 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 ºC Để ống nghiệm tư nghiêng để có chiều sâu cột thạch 2,5 cm mặt phẳng nghiêng dài cm đến cm 5.2.8 Thạch urê (Christensen) 5.2.8.1 Môi trường 5.2.8.1.1 Thành phần Pepton 1,0 g Glucoza 1,0 g Natri clorua 5,0 g Kali dihydrooctophosphat (KH2PO4) 2,0 g Đỏ phenol 0,012 g Thạch Từ 12 g đến 18 g d) Nước 000 ml d) Tùy thuộc vào sức đơng thạch 5.2.8.1.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần khơ hồn chỉnh khơ nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 6,8 ± 01, cần Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 ºC 5.2.8.2 Dung dịch urê 5.2.8.2.1 Thành phần Urê Nước vừa đủ 400 g 000 ml 5.2.8.2.2 Chuẩn bị Hòa tan Urê nước Khử trùng qua lọc kiểm tra lại độ vô trùng (Đối với chi tiết kỹ thuật khử trùng qua lọc, tham khảo thêm sách kỹ thuật vi sinh vật) 5.2.8.3 Mơi trường hồn chỉnh 5.2.8.3.1 Thành phần Môi trường (5.2.8.1) Dung dịch Urê (5.2.8.2) 950 ml 50 ml 5.2.8.3.2 Chuẩn bị Trong điều kiện vô trùng, cho dung dịch Urê vào mơi trường trước làm tan chảy làm nguội nồi cách thủy (6.5) đến 45 ºC Phân phối mơi trường hồn chỉnh theo lượng 10 ml vào ống nghiệm vô trùng (6.9) Đặt ống nghiệm tư nghiêng 5.2.9 Môi trường L-Lystin decacboxyl 5.2.9.1 Thành phần L-Lystin monohydroclorua 5,0 g Cao men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía Nước 0,015 g 000 ml 5.2.9.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 6,8 ± 0,1 Phân phối môi trường theo lượng ml sang ống nuôi cấy (6.9) Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 ºC 5.3 Thuốc thử 5.3.1 Dung dịch muối 5.3.1.1 Thành phần Natri clorua Nước 5.3.1.2 Chuẩn bị 8,5 g 000 ml Hòa tan natri clorua nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho khử trùng pH 7,0 ± 0,1 Phân phối lượng dung dịch sang ống nghiệm (6.9) bình tam giác (6.8) cho chúng chứa khoảng từ 90 ml đến 100 ml sau khử trùng Khử trùng môi trường 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 ºC 5.3.2 Thuốc thử để phát ß-galactosidaza 5.3.2.1 Toluen 5.3.2.2 Dung dịch đệm 5.3.2.2.1 Thành phần Natri dihydro phosphat (NaH2PO4) 6,9 g Dung dịch natri hydroxit 10 mol/l ≈ ml e) Nước ≈ 50 ml e) tùy thuộc vào thể tích cần thiết để điều chỉnh pH 5.3.2.2.2 Chuẩn bị Hòa tan natri dihydro phosphat khoảng 45 ml nước đựng bình định mức vạch 50 ml Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,1 dung dịch natri hydroxit Pha loãng nước đến vạch 5.3.2.3 Dung dịch ONPG 5.3.2.3.1 Thành phần o-Nitrophenyl ß-D-galactopyranosid (ONPG) Nước 0,08 mg 15 ml 5.3.2.3.2 Chuẩn bị Hòa tan ONPG nước ủ trước đến 50 ºC Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phịng 5.3.2.4 Thuốc thử hồn chỉnh 5.3.2.4.1 Thành phần Dung dịch đệm (5.3.2.2) Dung dịch ONPG (5.3.2.3) ml 15 ml 5.3.2.4.2 Chuẩn bị Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG 5.3.3 Thuốc thử phản ứng Voges – Proskeuer (VP) 5.3.3.1 Môi trương VP 5.3.3.1.1 Thành phần Pepton 7,0 g Glucoza 5,0 g Dikali hydro phosphat (K2HPO4) 5,0 g Nước 000 ml 5.3.3.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đung nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 6,9 ± 0,1, cần Chuyển lượng ml môi trường VP thu sang ống nghiệm (6.9) Khử trùng môi trường 20 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 ºC 5.3.3.2 Dung dịch creatin (N-amlidinosarcosin) 5.3.3.2.1 Thành phần Creatin ngậm phân tử nước Nước 5.3.3.2.2 Chuẩn bị Hòa tan creatin ngậm phân tử nước vào nước 5.3.3.3 Dung dịch 1-naphtol etanol 5.3.3.3.1 Thành phần 0,5 g 100 ml 1-naphtol Etanol, 96% (theo thể tích) 6g 100 ml 5.3.3.3.2 Chuẩn bị Hịa tan 1-naphtol etanol 5.3.3.4 Dung dịch kali hydroxit 5.3.3.4.1 Thành phần Kali hydroxit Nước 40 g 100 ml 5.3.3.4.2 Chuẩn bị Hòa tan kali hydroxit nước 5.3.4 Thuốc thử phản ứng indol 5.3.4.1 Môi trường trypton/tryptophan 5.3.4.1.1 Thành phần Tripton 10 g Natri clorua 5g DL-tryptophan 1g Nước 1000 ml 5.3.4.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước sôi 100ºC nồi cách thủy (6.5) Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,5 ± 0,1 Phân phối lượng ml môi trường thu sang ống nghiệm (6.9) Khử trùng môi trường 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 ºC 5.3.4.2 Thuốc thử Kovacs 5.3.4.2.1 Thành phần 4-Dimetylaminobenzaldehyt 5g Axit clohydric, p = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml 25 ml 2-Metylbutan-2-ol 75 ml 5.3.4.2.2 Chuẩn bị Trộn thành phần 5.3.5 Thạch dinh dưỡng thể nửa đặc 5.3.5.1 Thành phần Cao thịt 3,0 g Pepton 5,0 g Thạch Từ g đến g f) Nước 000 ml f) Tuỳ thuộc vào sức đơng thạch 5.3.5.2 Chuẩn bị Hồ tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,1, cần Chuyển môi trường thu sang bình tam giác (6.8) có dung tích thích hợp Khử trùng môi trường 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) nhiệt độ 121 °C 5.3.5.3 Chuẩn bị đĩa thạch Cho môi trường chuẩn bị theo lượng 15 ml vào đĩa Petri vô trùng nhỏ (6.12) Không sấy khô đĩa thạch 5.4 Huyết Một vài dạng huyết ngưng kết có chứa kháng thể kháng nguyên O có bán sẵn thị trường, nghĩa kháng huyết có chứa nhiều nhóm “O” (được coi kháng huyết O đơn giá đa giá), huyết kháng Vi kháng huyết có chứa kháng thể một vài nhân tố H (gọi kháng huyết H đơn giá đa giá) Cần thử trước lần để đảm bảo kháng huyết đem sử dụng đủ điều kiện phát dạng huyết Salmonella Để hỗ trợ cho việc này, dùng kháng huyết hãng cung cấp công nhận (thí dụ quan Nhà nước thích hợp) Thiết bị, dụng cụ Có thể dùng dụng cụ sử dụng lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần có qui định phù hợp Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm vi sinh thơng thường cụ thể là: 6.1 Thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực), trì nhiệt độ 121 °C ± °C 115 °C ± °C 6.2 Tủ sấy, có khả hoạt động 50 °C ± °C, thơng gió đối lưu, tủ thơng gió laminar 6.3 Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 °C ± °C 6.4 Nồi cách thuỷ tủ ấm, có khả hoạt động 41,5 °C ± °C 6.5 Các nồi cách thuỷ, có khả trì 37 °C ± °C, 45 °C ± °C, 55 °C ± °C, 70 °C ± °C nhiệt độ sơi 6.6 Que cấy vịng, platin/iridi niken/crom, đường kính khoảng mm 6.7 pH mét, đo xác đến ± 0,1 đơn vị pH nhiệt độ 25 °C 6.8 Chai bình cấy, làm kim loại khơng độc chất dẻo có nắp vặn 6.9 Ống nghiệm đựng dịch cấy, đường kính mm dài 160 mm, kích cỡ thích hợp khác 6.10 Ống đong 6.11 Pipet chia độ pipet tự động, có dung tích danh định 10 ml ml, có vạch chia tương ứng 0,5 ml 0,1 ml 6.12 Đĩa Petri, cỡ nhỏ (đường kính từ 90 mm đến 100 mm) và/hoặc cỡ lớn (đường kính 140 mm) Lấy mẫu Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Điều quan trọng mẫu thử gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị hư hỏng thay đổi trình bảo quản vận chuyển Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6263:2007 (ISO 8261:2001) Cách tiến hành 9.1 Yêu cầu an toàn Xem điều 12 9.2 Phần mẫu thử tiền tăng sinh 9.2.1 Khái quát Để chuẩn bị dung dịch ban đầu, cho 25 g mẫu thử (điều 8) vào 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1), tỷ lệ mẫu thử với mơi trường tiền tăng sinh quy định phương pháp Nếu phần mẫu thử khác với 25 g, sử dụng lượng môi trường tiền tăng sinh cần thiết để tạo độ pha lỗng 1/10 (khối lượng/thể tích) 9.2.2 Sữa nguyên liệu, sữa xử lý nhiệt sản phẩm sữa dạng lỏng Dùng pipet lấy 25 ml mẫu thử (điều 8) cho vào bình tam giác (6.8) chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) lắc 9.2.3 Sản phẩm sữa khô Chuẩn bị bình có nắp đậy (6.8) chứa 225 ml mơi trường tiền tăng sinh (5.2.1) Cân 25 g mẫu thử (điều 8) cách vô trùng đổ lên bề mặt chất lỏng đựng bình Đậy nắp bình, khơng lắc Để yên nhiệt độ phòng 60 phút ± 10 phút trước đem nuôi ấm Không cần chỉnh pH Nếu sau ủ ấm mà sữa bột chưa tan, dung tay để lắc bình để trộn lượng chứa bình khuấy dao trộn vô trùng 9.2.4 Lactoza Cân 25 g mẫu thử (điều 8) cách vơ trùng cho vào bình có nắp đậy chứa 225 ml mơi trường tiền tăng sinh (5.2.1) lắc tan 9.2.5 Casein, caseinat phomat Cân 25 g mẫu thử (điều 8) cách vô trùng cho vào cốc đựng vô trùng máy trộn tốc độ cao loại nhu động Thêm 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) nhiệt độ 45 °C Trộn mẫu thử phân tán (từ phút đến phút) Giữ nhiệt độ không 45 °C 9.2.6 Bơ Lắc mẫu thử (điều 8) làm tan chảy Dùng pipet để chuyển 25 ml phần mẫu thử ủ trước đến khoản 45 °C, cho vào bình tam giác (6.8) chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) lắc 9.2.7 Sản phẩm sữa đông lạnh (kể kem thực phẩm) Dùng pipet để chuyển 25 ml mẫu thử (điều 8) làm tan chảy ủ trước đến khoảng 37 ºC, cho vào bình (6.8) chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) lắc 9.2.8 Sữa lên men, sữa chua, bánh kem tráng miệng Cân 25 g mẫu thử (điều 8) cách vơ trùng cho vào bình có nắp đậy (6.8) chứa viên bi thủy tinh 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) lắc cho tan Để đơn giản việc kiểm tra, mẫu kiểm tra gồm nhiều phần mẫu thử 25 g lấy từ lô hàng sữa sản phẩm sữa qui định cần kiểm tra, chứng minh việc tạo thành mẫu chung (gộp chung phần mẫu thử) không làm ảnh hưởng đến kết sữa sản phẩm sữa gộp lại thành phần mẫu thử Ví dụ, kiểm tra 10 mẫu thử, mẫu 25 g kết hợp 10 mẫu với để tạo thành mẫu thử chung 250 g đem hòa tan khuếch tán 2,25 lít mơi trường tiền tăng sinh Hoặc cách khác, phần 0,1 ml môi trường tiền tăng sinh (môi trường RV) 10 ml môi trường tiền tăng sinh (selenit/xystin) từ 10 phần riêng rẽ kết hợp lại đem tăng sinh tương ứng 0,1 lít lít mơi trường chọn lọc Kiểm tra pH huyền phù chỉnh đến 6,8 ± 0,1 cần, trừ có qui định khác 9.3 Tăng sinh 9.3.1 Tiền tăng sinh khơng chọn lọc Ủ ấm bình tam giác chuẩn bị theo 9.2.2 đến 9.2.8 tủ ấm (6.3) đặt 37 ºC 16 đến 20 9.3.2 Tăng sinh chọn lọc 9.3.2.1 Cho 0,1 ml dịch cấy thu 9.3.1 vào ống cấy (6.9) có chứa 10 ml mơi trường RVS (5.2.2) Chuyển 10 ml dịch cấy thu 9.3.1 vào bình tam giác (6.8) có chứa 100 ml mơi trường selenit/xystin (5.2.3) 9.3.2.2 Ủ môi trường RVS cấy (9.3.2.1) nồi cách thủy tủ ấm (6.4) đặt 41,5 ºC 18 đến 24 Ủ môi trường selenit/xystin cấy (9.3.2.1) tủ ấm (6.3) đặt 37 ºC 18 đến 24 9.4 Cấy ria đọc kết 9.4.1 Dùng que cấy vịng (6.6) lấy đầy dịch cấy thu mơi trường RVS (9.3.2.2) (sau ủ ấm từ 18 đến 24 giờ) cấy ria lên bề mặt đĩa Petri lớn (6.12) chứa thạch lục sáng/đỏ phenol (5.2.4) cho thu khuẩn lạc phân lập tốt Nếu khơng có đĩa lớn sử dụng hai đĩa nhỏ, sử dụng que cấy vòng cấy đĩa liên tiếp Nên dùng phương pháp cấy ria sau sử dụng thạch lục sáng/đỏ phenol Sử dụng que cấy vòng (6.6) cho hai đĩa Lấy giọt nhỏ từ mép bề mặt chất lỏng Cấy lên hai đĩa theo Sơ đồ C.1 [a) b)] Sử dụng toàn đĩa, vạch ria cần cách mép đĩa khoảng 0,5 cm (Không đốt que cấy lửa không nhúng lại sau lần cấy ria thứ nhất, không làm chuyển sang đĩa thứ hai) Chỉ sử dụng đĩa lớn, phương pháp cấy ria cần theo sơ đồ C.1 a) Thực tương tự môi trường đặc chọn lọc thứ hai (5.2.5) sử dụng que cấy vịng đĩa Petri có kích cỡ thích hợp 9.4.2 Sử dụng dịch cấy thu môi trường selenit/xystin (9.3.2.2) sau ủ ấm từ 18 đến 24 giờ, lặp lại qui trình mơ tả 9.4.1 với hai mơi trường đặc chọn lọc 9.4.3 Ủ ấm đĩa (các đĩa lật úp) tủ ấm từ 20 đến 24 37 ºC 9.4.4 Sau ủ ấm tiếp môi trường RVS môi trường selenit/xystin 18 đến 24 giờ, lặp lại việc cấy qui trình ủ ấm qui định 9.4.1 đến 9.4.3 9.4.5 Sau lần ủ ấm (9.4.3 9.4.4) kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc Salmonella điển hình Nếu khuẩn lạc mọc yếu khơng có mặt khuẩn lạc Salmonella điển hình ủ ấm lại đĩa thêm 18 đến 24 tủ ấm (6.3) đặt 37 ºC kiểm tra lại đĩa có mặt khuẩn lạc Salmonella điển hình 9.4.6 Trên thạch lục sáng/đỏ phenol (5.2.4), khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng với vùng mơi trường bao quanh đỏ tươi CHÚ THÍCH Do việc nhận biết khuẩn lạc Salmonella đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm, vẻ ngồi chúng mơi trường nhận diện thay đổi tùy chủng tùy mẻ môi trường, nên phải chọn khuẩn lạc nghi ngờ khuẩn lạc điển hình để thử khẳng định 9.5 Khẳng định 9.5.1 Chọn khuẩn lạc để khẳng định Để khẳng định, lấy năm khuẩn lạc điển hình có nghi ngờ từ đĩa môi trường đặc chọn lọc (9.4.1), đĩa có năm khuẩn lạc điển hình nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc đem thử khẳng định 9.5.2 Ủ ấm Cấy ria khuẩn lạc chọn lọc lên bề mặt đĩa thạch dinh dưỡng (5.2.6) cho khuẩn lạc phân lập mọc tốt Ủ ấm đĩa từ 18 đến 24 tủ ấm (6.3) nhiệt độ 37 ºC Sau ủ ấm, chọn khuẩn lạc phân lập tốt khiết để khẳng định đặc tính sinh hóa huyết 9.5.3 Khẳng định đặc tính sinh hóa 9.5.3.1 Khái qt Dùng que cấy để cấy khuẩn lạc khiết (9.5.2) vào môi trường qui định 9.5.3.2 đến 9.5.3.7 9.5.3.2 Thạch đường/sắt III (5.2.7) Cấy ria lên bề mặt nghiêng thạch đâm sâu vào mặt thạch Ủ tủ ấm (6.3) 24 đặt nhiệt độ 37 ºC Diễn giải biến đổi môi trường sau: a) Cấy đâm sâu: màu vàng: glucoza dương tính (lên men glucoza) màu đỏ khơng đổi màu: glucoza âm tính (khơng lên men glucoza) màu đen: sinh sunfua hydro có bọt khí có vết nứt: sinh khí từ glucoza b) Bề mặt thạch nghiêng màu vàng: lactoza và/hoặc sucroza dương tính (có sử dụng lactoza và/hoặc xacaroza) màu đỏ khơng đổi màu: lactoza sucroza âm tính (khơng sử dụng lactoza xacaroza) Các Salmonella điển hình cho tính kiềm (màu đỏ) thạch nghiêng, có sinh khí có tính axit (màu vàng), cột thạch, với (khoảng 90% trường hợp) sinh sunfua hydro (làm đen thạch) Khi Salmonella có lactoza dương tính phân lập, mặt nghiêng thạch TSI có màu vàng Do đó, việc khẳng định sơ Salmonella không dựa vào kết thử thạch TSI 9.5.3.3 Thạch urê (5.2.8) Cấy ria lên bề mặt nghiêng thạch Ủ ấm 24 tủ ấm (6.3) nhiệt độ 37ºC Nếu phản ứng dương tính, việc phân giải urê giải phóng amoniac, làm đổi màu phenol đỏ sang màu hoa hồng sau di chuyển sang màu đỏ tím Phản ứng thường xảy sau đến 9.5.3.4 Môi trường L-Lysin decarboxyl (5.2.9) Cấy bề mặt môi trường lỏng Ủ ấm 24 tủ ấm (6.3) 37°C Màu đỏ tía xuất sau vi khuẩn sinh trưởng phản ứng dương tính Màu vàng phản ứng âm tính 9.5.3.5 Phản ứng β -galactosidaza (5.3.2) Hồ vòng que cấy đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm (6.9) có 0,25 ml dung dịch muối (5.3.1) Thêm giọt toluen (5.3.2.1) lắc ống Đặt ống nghiệm vào nồi cách thuỷ (6.5) nhiệt độ 37°C để yên vài phút Thêm 0,25 ml thuốc thử β-galactosidaza lắc Đặt lại ống nghiệm vào nồi cách thuỷ để 37°C để yên 24 Có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính Phản ứng thường xảy sau 20 phút 9.5.3.6 Phản ứng Voges-Proskeuer (VP) (5.3.3) Hồ vịng que cấy đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào hai ống nghiệm (6.9) ống nghiệm chứa 0,2 ml môi trường VP (5.3.3.1), ủ ống nhiệt độ phòng ống tủ ấm (6.3) nhiệt độ 37°C 24 Sau ủ ấm, thêm vào ống ống sau: giọt dung dịch creatin (5.3.3.2), giọt dung dịch 1-naphtol cồn (5.3.3.3), sau thêm giọt dung dịch kali hydroxit (5.3.3.4); lắc ống sau lần thêm loại thuốc thử Việc tạo thành màu hồng đến màu đỏ tươi vòng 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính Cần tuân thủ nghiêm ngặt trật tự Nếu, ví dụ: cho kali hydroxit vào trước dung dịch 1naphtol cồn pepton có mặt, kết cho dung dịch có màu hồng nhạt mà che khuất phản ứng dương tính 9.5.3.7 Phản ứng indol (5.3.4) Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa ml môi trường trypton/tryptophan (5.3.4.1) Ủ ấm 24 tủ ấm (6.3) nhiệt độ 37°C Sau ủ ấm, thêm ml thuốc thử Kovacs (5.3.4.2) Việc tạo thành vịng màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính Vịng màu nâu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính 9.5.3.8 Giải thích từ thử nghiệm sinh hố Giải thích kết theo Bảng Bảng – Giải thích kết Phép thử khẳng định Phản ứng âm tính dương tính Phần trăm chủng Salmonella cho thấy có phản ứng TSI glucoza (sinh axit) (9.5.3.2) + 100 TSI glucoza (sinh khí) (9.5.3.2) + 91,9 TSI lactoza (9.5.3.2) - 99,2 a TSI sucroza (9.5.3.2) - 99,5 TSI nidro sunfua (9.5.3.2) + 91,6 Phân giải urê (9.5.3.3) - 100 L-Lyxin decacboxyl (9.5.3.4) + 94,6 Phản ứng β-galactoxidaza (9.5.3.5) - 98,5 Phản ứng Voges – Proskauer(9.5.3.6) - 100 Phản ứng indol (9.5.3.7) - 98,9 a Các Salmonella enterical sub sp, arizonae diarizonae cho phản ứng lactoza dương tính âm tính ln ln cho phản ứng β-galactosidaza dương tính Các Salmonella nhóm II cho cho phản ứng lactoza âm tính cho phản ứng β-galactosidaza dương tính 9.5.4 Hệ thống chuẩn đốn thương mại Có thể sử dụng thử nhận dạng có bán sẵn thị trường để nhận dạng Salmonella 9.5.5 Khẳng định huyết 9.5.5.1 Khái quát Việc phát có mặt kháng nguyên Salmonella O-, Vi- H- tiến hành phản ứng ngưng kết phiến kính huyết thích hợp với khuẩn lạc khiết (9.5.2) sau loại trừ chủng tự ngưng kết (9.5.5.2) 9.5.5.2 Loại trừ chủng tự ngưng kết Cho giọt dung dịch muối (5.3.1) lên phiến kích rửa cẩn thận Dàn khuẩn lạc (9.5.2) cần thử nghiệm giọt dung dịch cho thu thể huyền phù đục đồng Lắc nhẹ phiến kính 30 giây đến 60 giây Quan sát kết đen, tốt nên dùng kính lúp Nếu vi khuẩn vón lại thành đơn vị nhiều có ngưng kết chủng coi tự ngưng kết Việc khẳng định huyết chủng tự ngưng kết theo qui trình 9.5.5.3, 9.5.5.4 9.5.5.5 thực 9.5.5.3 Kiểm tra kháng nguyên OSử dụng chủng khuẩn lạc khiết không tự ngưng kết (9.5.5.2) Tiến hành theo 9.5.5.2 cách lấy giọt kháng huyết O- (5.4) thay cho dung dịch muối (5.3.1) Sử dụng kháng huyết đa giá đơn giá 9.5.5.4 Kiểm tra kháng nguyên ViTiến hành theo 9.5.5.3, sử dụng giọt kháng huyết Vi- (5.4) thay cho dung dịch muối (5.3.1) 9.5.5.5 Kiểm tra kháng nguyên HCấy khuẩn lạc không tự ngưng kết khiết lên thạch dinh dưỡng thể nửa đặc (5.3.5) Ủ ấm môi trường tủ ấm (6.3) từ 18 đến 24 37°C Dùng dịch cấy để kiểm tra kháng nguyên H-, tiến hành theo 9.5.5.3, sử dụng giọt kháng huyết H- (5.4) thay cho dung dịch muối (5.3.1) 9.5.5.6 Giải thích phản ứng huyết Nếu xuất ngưng kết, phản ứng coi dương tính 9.5.6 Giải thích từ phản ứng sinh hoá huyết Bảng cho phép nội suy từ phép thử khẳng định (xem 9.5.3 9.5.5) tiến hành khuẩn lạc sử dụng (xem 9.5.2) Bảng – Giải thích từ phép thử khẳng định Các phản ứng sinh hoá Tự ngưng kết Các phản ứng huyết Phản ứng điển hình Khơng Phản ứng điển hình Khơng Tất phản ứng âm tính Phản ứng điển hình Có Khơng thử (xem 9.5.3.2) Phản ứng khơng điển hình Khơng Kháng ngun O-, Vi- Hdương tính Phản ứng khơng điển hình Khơng Tất phản ứng âm tính Giải thích Kháng nguyên O-, Vi- H- Các chủng coi dương tính Salmonella Có thể Salmonella Không coi Salmonella 9.5.7 Thử khẳng định cuối Các chủng coi Salmonella, Salmonella, (xem bảng 2) phải gửi đến trung tâm chuẩn Salmonella công nhận để khẳng định lần cuối Việc gửi mẫu phải kèm theo tất thông tin cần thiết liên quan đến chủng vi khuẩn 10 Dịch cấy để kiểm chứng Để kiểm tra khả đảm bảo môi trường tăng sinh nhận biết phát triển cấy dịch cấy đối chứng Salmonella vừa phân lập chủng Salmonella lấy từ Trung tâm nuối cấy vi khuẩn công nhận phải chuyển vào bình kiểm chứng chứa hai loại mơi trường tăng sinh (9.3.2) Tiến hành với bình kiểm chứng dịch cấy thử nghiệm để chứng minh dịch cấy kiểm chứng dương tính thu hồi 11 Biểu thị kết Theo kết giải thích, ghi lại có mặt hay khơng có mặt Salmonella mẫu thử xác định theo đơn vị khối lượng tính gam hay thể tích, tính mililít mẫu thử 12 Lưu ý an tồn 12.1 Qui trình qui định tiêu chuẩn tiến hành phịng thí nghiệm có điều kiện thích hợp đặt kiểm soát chuyên gia vi sinh vật 12.2 Các qui trình khơng tiến hành phịng thí nghiệm kiểm tra chất lượng, hay sản xuất chế biến thực phẩm, nơi có nguy nhiễm bẩn từ mơi trường 12.3 Phải thực đầy đủ lưu ý an toàn vi khuẩn học suốt thời gian tiến hành qui trình qui định tiêu chuẩn Phải đặc biệt ý tới việc khử trùng trang thiết bị sử dụng môi trường sau kiểm tra mẫu nghi ngờ trước loại bỏ hay tái sử dụng 12.3 Đặc biệt ý phòng thử nghiệm sử dụng dung dịch selenit tính độc tiềm tàng chúng Trong tình khơng dùng miệng để hút pipet CHÚ THÍCH Đối với lưu ý an tồn cụ thể, xem TCVN 6404 (ISO 7218), đặc biệt điều 3, điều điều 13 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: - thông tin cần thiết nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất điều kiện thao tác không qui định tiêu chuẩn này, xem tuỳ ý, với tình huống, bất thường ảnh hưởng đến kết - kết thử nghiệm thu độ lặp lại kiểm tra nêu kết cuối thu Phụ lục A (qui định) Sơ đồ cách tiến hành Phụ lục B (qui định) Yêu cầu lục sáng B.1 Đặc tính vi khuẩn học Hạn chế việc phân tán vi khuẩn Proteus lên môi trường thạch lục sáng/đỏ phenol (5.2.4) việc phát triển Salmonella không bị ức chế B.2 Phương pháp thử B.2.1 Môi trường Chuẩn bị đĩa thạch lục sáng/đỏ phenol theo 5.2.4 có nồng độ lục sáng khác phạm vi từ 4,5 mg/l đến mg/l B.2.2 Cách tiến hành Cấy khuẩn lạc khiết Proteus khuẩn lạc Salmonella khiết lên đĩa thạch có nồng độ lục sáng khác để đĩa tủ ấm (6.3) 37°C không 24 Nồng độ lục sáng thích hợp cho Salmonella phát triển thành khuẩn lạc màu hồng điển hình có đường kính từ mm đến mm, hạn chế việc phát triển Proteus, tức loại không mọc lan rộng Nên dùng nồng độ lục sáng để chuẩn bị dung dịch lục sáng (xem 5.2.4.3) Phụ lục C (tham khảo) Phương pháp ria cấy chuẩn lên đĩa thạch a) Đĩa thứ b) Đĩa thứ hai Chú giải Vạch Hình C.1 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật học thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Các nguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật  ... pháp ria cấy chuẩn lên đĩa thạch a) Đĩa thứ b) Đĩa thứ hai Chú giải Vạch Hình C.1 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6404 (ISO 7218),... 9.2.2 Sữa ngun liệu, sữa xử lý nhiệt sản phẩm sữa dạng lỏng Dùng pipet lấy 25 ml mẫu thử (điều 8) cho vào bình tam giác (6.8) chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh (5.2.1) lắc 9.2.3 Sản phẩm sữa. .. thử 25 g lấy từ lô hàng sữa sản phẩm sữa qui định cần kiểm tra, chứng minh việc tạo thành mẫu chung (gộp chung phần mẫu thử) không làm ảnh hưởng đến kết sữa sản phẩm sữa gộp lại thành phần mẫu