Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY BIOREACTOR TRONG CNSH THỰC VẬT MỞ ĐẦU Kỹ thuật nuôi cấy mô đời mở cách mạng nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy môi trường thạch khó đáp ứng nhu cầu giống trồng cung cấp thị trường, giá thành lại cao; việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên tủ cấy thực tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm Chính cần phải có hệ thống nuôi cấy tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian số lượng nhiều Năm 1981, Takayama Misawa đề xuất hệ thống nuôi cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên vào với tên gọi Bioreactor [2] Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ba loại nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc nuôi cấy Bioreactor, tất dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh quan.[21] Và hệ thống Bioreactor thường dùng nhiều, chủ yếu để nuôi cấy huyền phù tế bào sản xuất hoạt chất thứ cấp nhiều đối tượng nghiên cứu khác [22][2][18], có xu hướng dùng Bioreactor để nuôi cấy rễ lông tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp, so với nuôi cấy huyền phù nuôi cấy rể có ưu bị biến đổi di truyền chứa nhiều sản phẩm cần thu nhận Nhưng thực từ năm 60, Giáo sư Gamborg đưa ý tưởng ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật fermenter, vào năm thiết bị nuôi cấy tương đương hệ thống nuôi cấy lên men Bằng thiết bị nhà khoa học điều khiển xác định tăng trưởng tế bào Sau bắt đầu nuôi cấy tế bào môi trường lỏng cho nhà khoa học biết tế bào thực vật khác với tế bào nấm men, bảo quản điều kiện giống tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà không xảy sinh trưởng đồng thời theo cách tế bào nấm men Nuôi cấy kỹ thuật này, việc nghiên cứu thu nhận sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng sinh hoá môi trường lỏng tỏ hiệu [4] Trong năm sau vào năm 1970, công ty Thuốc Nhật Bản quan tâm đến vấn đề này, họ tiến hành sản xuất sinh khối thuốc để làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc điếu; công ty nuôi cấy tank fermenter 20 lít [15] Về sau, để khắc phục nhược điểm hệ thống cho ngập chìm mẫu hoàn toàn, Harris Mason cải tiến thành hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary immersion system- TIS) hệ thống nuôi cấy nghiêng hệ thống nuôi cấy Rocker vào năm 1983; lâu sau, vào năm 1985 Tesserat Vandercook thiết kế hệ thống nuôi cấy tự động APCS, hệ thống thây môi trường sử dụng thời gian dài mà không cần cấy chuyền Nuôi cấy Bioreactor GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với số lượng lớn tế bào, phôi soma hay đơn vị phát sinh quan (củ, chồi,…), sản xuất hoạt chất trao đổi thứ cấp cách sử dụng tế bào thực vật Mỗi hệ thống có ưu nhược điểm riêng tất mang lại số thành công bước đầu việc tạo số sản phẩm Trong năm gần đây, hệ thống phổ biến rộng, công ty đa quốc gia nghiên cứu phòng nghiệm hệ thống ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhân giống trồng, y học… đạt số kết định Một công ty tai Đức, Diversa, trang bị đến năm hệ thống Bioreactor có dung tích đến 75.000 L để nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, chi tiết cụ thể hệ thống Bioreactor không tiết lộ, theo hình ảnh trưng bày cho thấy hệ thống họ có hình dáng trông giống hệ thống lên men vi khuẩn bình thường Công ty nuôi cấy tế bào Echinacea purpurea quy mô lớn để sản xuất hợp chất có hoạt tính miễn dịch sinh học polysaccharide.[15] MỘT SỐ HỆ THỐNG BIOREACTOR 2.1 Cấu tạo chung Bioreactor hệ thống có cấu tạo tương đối giống với hệ thống fermentor nuôi cấy vi sinh vật Cấu trúc bên Bioreactor chứa thành phần điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (trong số thiết bị thay sục khí nén từ lên)… Nguyên tắc hoạt động thiết bị phụ thuộc vào công nghệ sản xuất Về sau, để tăng khả ứng dụng hệ thống nuôi cấy, người ta đưa số mô hình cải tiến hệ thống ngập chìm tạm thời (TIS) Hệ thống hoạt động nguyên tắc ngập chìm không hoàn toàn, mà điều chỉnh thời gian ngập tự động 2.2 Phân loại Hệ thống Bioreactor có nhiều kiểu, giới hạn viết đưa hai hệ thống nuôi cấy sử dụng phổ biến nghiên cứu sản xuất hệ thống Bioreactor kiểu Air-lift hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 2.2.1 Bioreactor cánh khuấy Đây kiểu Bioreactor đơn giản, thiết kế với phận sủi bột khí phí đáy bình, có tác dụng khuấy trộn môi trường cung cấp oxygen lượng oxygen cung cấp ảnh hưởng đến phát triển đối tượng Theo Hiroyuki Honda, callus nho phát triển tốt dòng khí cung cấp 80 ml/phút, góp phần làm tăng lượng anthocyanin nuôi cấy [11] Loại khắc phục hai nhược điểm Bioreactor có cánh khuấy là: ốn lượng cho khuấy trộn môi trường gây lực xé rách tế bào nhờ dòng GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ lên Sự hòa trộn dòng khí vào pha lỏng trở nên hiệu có lưu trú bong bóng khí môi trường [2] Theo nghiên cứu Paek cộng (2003) đối tượng lâm nghiệp cho thấy, để tạo bọt khí nhỏ mịn, dòng khí phải thổi qua màng lọc với lỗ có kích thước nhỏ 0.01 – 0.1 mm Chính nhờ nhỏ mịn bong bóng khí làm giảm đáng kể cọ xát cho tế bào nên tế bào bị tổn thương, tế bào có độ nhạy cảm cao [17] Ưu điểm hệ thống có khả nhân sinh khối nhanh, nuôi ngập chìm di chuyển tự môi trường làm cho hiệu ứng ưu bị biến chồi phát triển tương đối đồng Hệ thống phù hợp cho trình nhân sinh khối tế bào nhân sinh khối rễ khả chịu ngập chìm môi trường, thực tế người ta sử dụng hệ thống vào sản xuất giống hay sinh khối nuôi củ hoa Lily, hoa thu Hải đường hay nhân sâm phân viện sinh học Đà Lạt [2].Chính khả thúc đẩy ứng dụng hệ thống Bioreactor vào nhân giống nhân nhanh sinh khối để thu chất hoạt hóa sinh học Tuy nhiên, Hệ thống Bioreactor Air-lift lộ khuyết điểm trình nuôi cấy dể bị tượng thủy tinh thể hay tượng street tế bào mẫu nuôi cấy cho ngập chìm hoàn toàn liên tục hệ thống khó áp dụng cách đồng loạt cho nhiều giống khác Một vấn đề lớn nuôi cấy môi trường lỏng dể bị nhiểm vi sinh vật nấm,vi khuẩn, côn trùng…Đó nguyên nhân mà người ta có cải tiến thiết bị nuôi cấy lỏng có cung cấp không khí từ bên [2] 2.2.2 Hệ thống nuối cấy ngập chìm tạm thời Hệ thống ngập chìm tạm thời gọi tắc TIS, nghiên cứu cải tiền vào năm 1985 Và sử dụng nhiều nghiên cứu [23] Ở nước ta, bước đầu Phân viện Sinh học Đà Lạt chế tạo hệ thống nuôi cấy thành công việc nhân giống nhanh loài hoa African violet Kết cho thấy GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật hệ thống TIS cho hiệu nhân chồi tăng sinh khối chồi hoa African violet cao so với phương pháp nhân giống truyền thống Cụ thể số chồi tăng 4,61 lần sinh khối tăng 23,17 lần [2] 2.2.2.1 Nguyên tắc cấu tạo Ngoài hệ thống nuôi cấy nghiêng, Rocker hệ thống nuôi cấy tự động APCS thị trường số hệ thống thương mại hóa như: Hệ thống RITA, hệ thống bình đôi BIT hệ thống Plantima Vì thực hệ thống dùng để nghiên cứu nước ta Tất hệ thống tuân theo điều kiện tránh ngập liên tục, thay đổi môi trường, điều khiển tự động hạn chế nhiểm Về cấu tạo hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời gồm phận máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy ngược lại, hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn van điều khiển, màng lọc, bình nuôi cấy thường nhựa polycarbonate hay thủy tinh 2.2.2.1.1 Hệ thống RITA Hệ thống RITA (Hình 1) công trình Teisson Alvard vào năm 1995 Một bình chứa L gồm có hai phần, phần chứa mẫu cấy phần chứa môi trường Một áp suất khí dương cung cấp vào ngăn đẩy chất lỏng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy ngập chìm môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức trì Trong suốt thời gian ngập, không khí sục vào môi trường lỏng, môi trường chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau thoát bên nhờ ngõ phía đầu hệ thống Và hệ thống thể tích môi trường dinh dưỡng giữ suốt trình nuôi cấy mà không cần phải thay Hiện nay, có nhiều hãng sản xuất hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask Cuba khảo sát nghiên cứu nhiều đối tượng khác Một hệ thống xuất gần hệ thống Plantima® GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật công ty Atech, Ðài Loan Hệ thống tiến hành khảo sát nhiều đối tượng chuối, hoa Lan… Hình 1: Pha 1:Mô không ngập môi trường Pha 2: Hiện tượng ngập hoạt hóa, van mở cho khí qua màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy Pha 3: Sự trao đổi khí hệ thống Pha 4: Chu kỳ kết thúc, van đóng lại môi trường môi trường lỏng rút xuống ngăn 2.2.2.1.2 Hệ thống bình sinh đôi BIT Hệ thống bình sinh đôi BIT (Hình 2) thiết kế Escalona cộng (1998) dự định nhân giống số lượng lớn qua đường phát sinh phôi soma Ðối với nhân giống theo đường phát sinh quan kích thước mẫu cấy đòi hỏi hệ thống tích lớn rẻ Con đường dễ dàng để đạt trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ định nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 mL - 10 L hệ thống ống dẫn, điều khiển tạo áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu ngược lại Hệ thống BIT® thiết kế đáp ứng với yêu cầu 2.2.2.1.3 Hệ thống Plantima Hệ thống thiết kế tổng thể tương tự hệ thống RITA nhiên có thay đổi cải tiến số chi tiết hệ thống bơm vị trí màng lọc Hệ thống sản xuất cung cấp Công ty A-tech Bioscientific đảo Ðài Loan Hệ thống tiến hành khảo sát nhiều đối tượng chuối, hoa Lan…Cấu tạo phương pháp vận hành (Hình 3, Hình 4): GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Hình 3: Các phận Plantima Hình 4: Hệ thống điều khiển chu kỳ ngập 2.2.2.2 Ưu khuyết điểm hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời a Ưu điểm - Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System) có tác động tích cực lên tất giai đoạn từ nhân nhanh chồi phát sinh phôi soma nhiều đối tượng trồng khác Như khả phát sinh chồi phôi soma không bị biến dị với tần số cao - Sự sinh trưởng hệ số nhân nhanh chồi nuôi cấy hệ thống ngập chìm tạm thời cao so với nuôi cấy hệ thống thông thường môi trường rắn hay hệ thống bioreactor thông thường - Cây tái sinh phôi soma thu hệ thống có chất lượng tốt - Nuôi hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trình hoá vườn ươm Điều chứng minh thông qua việc trồng trực tiếp đất củ khoai tây bi phôi soma cà phê - Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời kết hợp thành công ưu điểm hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí hệ thống nuôi cấy lỏng giúp tránh tượng bất lợi thiếu thông thoáng môi trường lỏng ngập liên tục hay hệ thống kín môi trường rắn, giúp gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng - Hạn chế tượng thủy tinh thể so, ưu điểm lớn hệ thống so với hệ thống Bioreactor thông thường - Hệ thống tiết kiệm công lao động, không gian phòng nuôi cấy giảm số lượng chai lọ nên giảm chi phí sản xuất, hệ thống cho hiệu suất sinh học cao Mô hình thích hợp cho việc mở rộng quy mô phục vụ cho sản xuất thương mại - Một ưu điểm khác hệ thống việc giảm hoạt tính chất độc ngoại bào hay chất ức chế sinh trưởng tiết môi trường thời gian nuôi cấy GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật b Khuyết điểm - Hiện chưa khảo sát mật độ nuôi cấy [32] - Thời gian ngập tối ưu phải khảo sát xác định xác cho giai đoạn nuôi cấy loại thời gian lần cấy chuyền hệ thống bổ sung môi trường - Phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho giai đoạn nuôi cấy - Một ưu điểm khác hệ thống việc giảm hoạt tính chất độc ngoại bào hay chất ức chế sinh trưởng tiết môi trường thời gian nuôi cấy - Giá thành thiết bị nuôi cấy ngập chìm tạm thời nước ta đắt chưa tự chế tạo nước - Những thông số kỹ thuật hệ thống cần khảo sát kỹ lưỡng tối ưu hóa giai đoạn nuôi cấy loại 2.2.2.3 Ảnh hưởng hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng nuôi cấy Theo nghiên cứu Escalona cộng (1999), cho thấy nuôi cấy chồi hệ thống TIS nhỏ nuôi cấy lỏng [9] Những cụm chồi phát triển từ chồi bên Bioreactor thường có hình cầu chồi có xu hướng phát triển toả tròn xung quanh tâm Do đó, số chồi có kích thước không lớn cần kéo dài hệ thống trước cho rể ống nghiệm Ngược lại, chồi có thân dài nhiều nuôi cấy hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy thạch [24] Chồi nuôi cấy hệ thống dài nặng chồi nuôi cấy môi trường bán rắn Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên phát triển chồi kết việc sử dụng bình chứa dung tích lớn [4] 2.3 Các yếu tố thông số ảnh hưởng đến trình nuối cấy Khác với nuôi cấy bề mặt thạch thông số kỹ thuật hay yếu tố ảnh hưởng dinh dưỡng, pH, độ vô trùng; nuôi cấy hệ thống Bioreactor có thêm thông số không khí, oxygen hòa tan, khuấy trộn có thêm yếu tố ngập chìm Ở đối tượng cụ thể mà thông số kỹ thuật điều chỉnh cho tối ưu 2.3.1 Không khí Trong không khí thành phần loại gồm Nitrogen (78%), Oxygen (21%) Cacbon dioxide (0,036%) Lượng không khí bình phụ thuộc vào thể tích độ GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật thoáng khí bình Hệ thống Bioreactor, hai yếu tố quan trọng môi trường độ thoáng khí.[3] Trong trình hô hấp thực vật sử dụng O2 thải CO2, trình quang hợp ngược lại Trong pha tối, nồng độ CO2 tăng lên nuôi cấy, điều kiện quang tự dưỡng chiếm ưu nồng độ giảm pha sáng Nồng độ CO2 cao có nhiều tác động có lợi kéo dài chồi phát triển Theobroma cacao [4] Theo Woltering (1990), chứng minh nồng độ CO2 10.000 ppm có ích cho hoa Hồng hoa Đồng tiền việc giảm lão hoá Tuy nhiên, trình nuôi cấy In vitro chế thải bình nuôi cấy chất khí ethylen(C2H4), ethanol(C2H5OH), acetaldehyde hydrocacbon Và theo nghiên cứu De Proft cộng (1985), điều kiện nuôi cấy In vitro thành phần môi trường khí khác phát triển cung khác nhau, cụ thể là việc hàm lượng CO2 giảm hàm lượng ethylene tăng Trong nuôi cấy dùng hệ thống Bioreactor cung cấp hay thải chất khí tính đến công nghệ thiết bị nuôi cấy, điều có ý nghĩa lớn đến trình mẫu cấy Lấy trường hợp củ khoai tây nuôi cấy Bioreactor air-lift, nuôi cấy chìm liên tục trình cảm ứng tạo củ bị ức chế củ phát triển sau chồi kéo dài tiếp xúc với pha khí phần Bioreactor [4] Các biện pháp tăng cường thêm lượng O2, điều khiển lượng hormone điều kiện thẩm thấu hiệu khó giải thích tượng Nhưng thay hình thức nuôi cấy pha, môi trường có bổ sung 9% sucrose để cảm ứng tạo củ tạo củ từ chồi phát triển, vượt lên môi trường, tiếp xúc với pha khí phía Ngoài ra, thoáng khí ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp, kết khảo nghiệm nhà nghiên cứu nhiều hệ thống nuôi cấy khác cho thấy thông thoáng nhiều chồi Hồ Điệp sinh trưởng phát triển tốt Điều cho thấy tầm quan trọng pha khí Bioreactor phát triển thực vật [2] Một nghiên cứu vào khảo sát ảnh hưởng thông thoáng đến phát triển nuôi cấy huyền phù Catharanthus roseus hệ thống Bioreactor airlift P K Hegarty cộng cho thấy, khối lượng khô sau nuôi cấy tăng lên nhiều hàm lượng chất mang hoạt chất thứ cấp cao Vì nuôi cấy sinh trưởng phát triển không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy mà phụ thuộc vào thành phần không khí hệ thống nuôi cấy 2.3.2 Oxygen hòa tan Một chức Bioreactor tăng cường khả vận chuyển oxygen từ pha khí sang pha lỏng Do oxygen hoà tan phần nước (0.25 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật mmol.l-1 250C, atm) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho phát triển mô thực vật, lượng lớn oxygen cần khuếch tán vào môi trường nuôi cấy Ngoài ra, mức độ đảo trộn yếu tố cần quan tâm oxygen hòa tan môi trường cần nhanh chóng mô tế bào hấp thu Tóm lại, đế đáp ứng tốt nhu cầu oxygen cho phát triển mô tế bào lượng oxygen hòa tan dung dịch nuôi cấy phải lớn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ) Trong trường hợp lượng oxygen hòa tan vào môi trường nhỏ (DO2 htcđ), lượng ATP tế bào bị giảm sút, từ ảnh hưởng tiêu cực đến phát sinh hình thái trao đổi chất tế bào Tuy nhiên, thực tế người ta vào giá trị (DO2 htcđ) để thiết kế Bioreactor giá trị yếu tố quan tâm hàng đầu tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn [2] Theo nghiên cứu Thanh N T, Yu K W, Hahn E J Paek K Y(2005), cho thấy nồng độ Oxygen 40% phù hợp cho việc sản xuất sinh khối sản xuất Ginsenoside tốt nhất, tăng lên 50% lại không thích hợp cho qua trình nuôi cấy tế bào tích luỹ sản phẩm Ginsenoside [25] 2.3.3 Sự đảo trộn Chỉ gặp thiết bị Bioreactor dạng Air-lift Thông số đảo trộn yếu tố quan trọng khác phản ảnh mức độ đồng việc phân phối chất dinh dưỡng mẫu cấy toàn không gian nuôi cấy Việc đảo trộn thực hình thức sục khí, khuấy trộn học kết hợp hai hình thức Nó vừa làm tăng khả tiếp xúc mẫu cấy với không khí vừa biện pháp để cung cấp vào bình nuôi cấy Ở số trường hợp nuôi cấy mẫu Bioreactor nguồn oxygen thường không đến với sinh khối Bioreactor dẫn đến hậu nhiều khối mô bị lão hóa, rể có nhiều nhánh nên nhiều rễ đan xen vào có khả cản lại nguồn cung cấp khí dinh dưỡng cho rể nằm phía trong; trường hợp gặp nuôi cấy nhân sinh khối rể Vì mà khả thành công để làm nguồn cho sản xuất chất có hoạt chất sinh học phụ thuộc vào việc thiết kế hệ thống Bioreactor phù hợp Tuy nhiên, cần lưu ý thực trình khuấy trộn mức vừa phải để vừa kích thích mô, tế bào vừa không làm tổn thương mô tế bào Sự đảo trộn nuôi cấy chưa nghiên cứu nhiều, công bố mảng nuôi cấy tế bào thu nhận sản phảm thứ cấp Đối với thiết bị nuôi cấy cải tiến đảo trộn thường ứng dụng thiết bị mẫu không bị ngập chìm hoàn toàn vào môi trường nuôi cấy 2.3.4 pH pH thông số vật lý ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển thực vật [2] Theo số tác giả, thay đổi độ pH môi trường trình nuôi cấy GVHD: Huỳnh Văn Kiệt SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật liên quan đến cân muối amonium môi trường Mức chịu đựng thực vật pH môi trường vào khoảng 5,5 đến 6,5; độ pH ảnh hưởng đến hoạt động nguyên tố đa vi lượng môi trường nuôi cấy Dưới 5,5 khả hoạt động P, K, Ca, Mg Mo giảm nhanh, 6,5 Fe Mn trở nên bất hoạt môi trường pH tăng cao diển kết tủa Ca3(PO4) [6] Theo Lazzeri P A cộng (1987), pH hạ xuống 5,0 mô thực vật bị ức chế cách rõ rệt [12] 2.3.5 Chất dinh dưỡng 2.3.5.1 Nguồn Cacbon Nuôi cấy Bioreactor giống nuôi cấy hệ thống cần thiết phải bổ sung thêm nguồn cacbon vào môi trường, tùy thuộc mục đích nuôi cấy mà bổ sung thêm vào nồng độ liều lượng định Sucrose glucose nồng độ -4 % phù hợp cho nguồn cacbon 2.3.5.2 Dinh dưỡng khoáng Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác cần cho đời sống thực vật cung cấp dạng đa lượng vi lượng Các nguyên tố đa lượng thường sử dụng với nồng độ lớn (khoảng 0,5 mmol/l), nguyên tố vi lượng sử dụng với lượng nhỏ (khoảng 0,05 mmol/l) [5] Nuôi cấy hệ thống Bioreactor, nhà khoa học thường sử dụng loại môi trường khác SH, MS, B5, Nisch… môi trường sử dụng nhiều môi trường MS môi trường giàu khoáng, thích hợp cho nhiều đối tượng khác Trong số nghiên cứu hình thành củ nuôi cấy củ hoa Lily Bioreactor thu kết sau 16 tuần nuôi cấy muối amonium, nitrate, phosphat sử dụng hết, ion K+, Mg2+, Ca2+, Na+, Cl- lượng đáng kể môi trường Tuy nhiên điều đặc biệt đường sucrose lúc lại tác nhân ức chế tăng trưởng thay nguồn dinh dưỡng Theo Y.E Choi, nồng độ NH4NO3 nuôi cấy Panax ginseng để thu sinh khối giai đoạn khác nhau, giai đoạn phát sinh callus nồng độ để cảm ứng callus khoảng 60mM; đó, nồng độ cấy chuyền 40mM; dùng trình tăng sinh khối nồng độ chuẩn 20 mM [26] 2.3.5.3 Chất điều hoà sinh trưởng Tái sinh chồi in vitro trình nhân giống đòi hỏi nguồn cung cấp chất điều hòa sinh trưởng môi trường nuôi cấy Những chất điều hòa sinh trưởng thường dùng chất thuộc nhóm auxin cytokinin riêng lẻ hay dùng chung với tỉ lệ đa dạng phụ thuộc vào loài loại mô dùng để nuôi cấy [4] Theo Dương Tấn Nhựt cộng (2005), nuôi cấy tái sinh callus rể bất định nhân sâm nồng độ NAA dùng 3mg/l [8] Theo A.M Shohael cộng sự, nuôi cấy phôi callus hệ thống Air-lift Eleutherococcus sessiliflorus, nồng độ 2,4 D phải dùng mg l－1, GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 10 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật kết nghiên cứu cho thấy việc nuôi cấy nồng độ mang lại lượng sinh khối cao việc tích tụ hợp chất eleutherosides sản xuất từ callus Eleutherococcus sessiliflorus tương đối nhiều[7] 2.3.5.4.Vitamin Thực vật tự tổng hợp Vitamin chúng sử dụng chất xúc tác trình trao đổi chất khác Khi tế bào mô thực vật sinh trưởng điều kiện in vitro, số Vitamin thay tổng hợp thường không đủ lượng, phải bổ sung thêm từ bên vào, đặc biệt Vitamin thuộc nhóm B [5] Theo Masanaru Misawa (1994), Vitamin Thiamine (B1) có ý nghĩa quan trọng, thường thích hợp nhiều loại tế bào thực vật số trường hợp chất kích thích phát triển thực vật.[15] Và chất cần môi trường nuôi cấy, B1 bị nhiệt phân khử trùng môi trường nuôi cấy tế bào tổng hợp lại chúng thành phân tửu B1 ban đầu [5] Trong số môi trường nuôi cấy môi trường MS xem môi trường tốt nuôi cấy mô thành phần B1 môi trường có loại Vitamin khác với liều lượng thích hợp cho phát triển thực vật 2.3.6 Thời gian ngập chìm mẫu Yếu tố lưu ý hệ thống Bioreactor ngập chìm tạm thời (TIS) Đây yếu tố để hệ thống TIS coi khắc phục nhược điểm hệ thống Bioreactor Air-lift Nó tạo nên hiệu có kết hợp vấn đề thoáng khí tiếp xúc theo chu kỳ mô thực vật môi trường nuôi cấy [4] Và trình nuôi cấy chu kỳ tần số ngập chìm số chủ yếu Theo Etienne cộng (1997), thời gian ngập chìm dài (1giờ ngập chu kỳ giờ) tỏ hiệu cho hình thành củ Khoai tây bi, thời gian ngập chìm ngắn (1 phút ngập chu kỳ 12 giờ) lại phù hợp cho hình thành phôi soma Cà phê Cao su Còn theo nghiên cứu Harris Mason (1983) cho thấy, tần số ngập chìm cao (30 giây ngập chìm, 30 giây rút) hiệu nhân chồi Nho cao nuôi cấy hệ thống Bioreactor nghiêng lắc [28] Và tần số ngập chìm 22 phút chu kỳ tỷ lệ nhân chồi Cây chuối cao.[S Roels cộng sự] 2.3.7 Thể tích môi trường dinh dưỡng Theo Lorenzo cộng (1998), xác định thể tích môi trường 50 ml cho mẫu cấy tối ưu nhân chồi Saccharum ssp.trong hệ thống Bioreactor bình đôi BIT Khi tăng dần thể tích môi trường từ đến 50 ml/ mẫu cấy, hệ số nhấn chồi tăng từ 8,3 chồi lên 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy Vào năm 1999, hệ thống nuôi cấy tương tự nhóm tác giả Escalona cộng lại chứng minh thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa 200 ml/mẫu cấy 2.4 Sự phát triển thực vật Bioreactor GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 11 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật 2.4.1 Quá trình phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi soma áp dụng việc nhân giống trồng với số lượng lớn Bioreactor tự động phôi soma dể sử dụng chúng có kích thước tương đối nhỏ đồng kích cỡ, chúng không cần phải cắt thành mảnh nhỏ tách rời nuôi cấy môi trường tăng sinh Tính toàn thể tế bào thực vật, khả tạo phôi biểu kiểu hình sở để đưa giả thiết phân lập nuôi cấy tế bào thự vật môi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phôi đơn bội Quá trình phát sinh phôi soma thực cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường sử dụng 2,4 D) nước dừa ban đầu Sau đó, dùng nhiều xytokinin Myo-inositol giảm lượng nitrogen Khi cụm tiền phôi tạo thành phải hạ thấp lấy bớt nồng độ auxin môi trường Sau đó, trình tự giống trình tạo phôi giao tử (đơn bội) diển Quá trình phát sinh phôi soma quan sát lần chi họ Umbelliferae nuôi cấy môi trường lỏng Kể từ đó, trình công bố nhiều hạt trần hạt kín, bao gồm loài cảnh, rau lương thực thân gỗ Phôi soma thường nhỏ thích hợp cho quy trình nhân sinh khối, chúng phân tách, đưa vào khuấy trộn hệ thống tự động, sau cất trữ hay tạo trực tiếp [2] Sản lượng chất lượng phôi soma nhiều loài thực vật cải thiện nhờ vào hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Kết nghiên cứu Cabasson cộng (1997), so sánh trình phát triển phôi soma nhiều hệ thống nuôi cấy khác Phôi soma hình thành từ nuôi cấy huyền phù tế bào cấy vào môi trường thạch, lỏng lắc tạm thời, 60% phôi môi trường thạch phát triển sang giai đoạn mầm, có tượng mọng nước; mẫu hệ thống lỏng lắc ngăn cản hình thành mầm vỏ mô phân sinh phôi soma phát triển tiếp sau giai đoạn phôi cầu; hệ thống RITA, phát triển phôi soma kích thích 66% phôi phát triển mầm có hình thái tương tự phôi nhân.[4] 2.4.2 Sự nhân chồi Hệ thống ngập chìm có tác dụng thức đẩy việc nhân chồi nuôi cấy hệ thống lỏng, kết sinh trưởng chồi thu tốt đối tường Pinus radiata thay cấy chuyền tháng môi trường rắn Trong hệ thống Bioreactor, chồi tăng trưởnglieen tục, cho phép thu hoạch chồi sau tháng khoảng thời gian 18 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 12 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật tháng mà không cần cấy chuyền Điều quan trọng chồi thu hệ thống nuôi cấy ngập chìm co chất lượng tốt dài so với chồi thu môi trường rắn [4] Theo Tisserat Vandercook (1985), nuôi cấy hệ thống ngập chìm tạm thời APCS phát triển đỉnh chồi Potinera nhanh môi trường rắn Cả hai thống số tươi khô tăng gấp lần KẾT QUẢ 3.1 Kết ứng dụng hệ thống Bioreactor nhân sinh khối tế bào 3.1.1 Nhân sinh khối callus Trong năm gần đây, việc ứng dụng nuôi cấy nhân sinh khối callus ý nhiều để sản xuất hoạt chất thứ cấp, không trung tâm nghiên cứu mà công ty sản xuất dược phẩm nhiều ưu điểm chúng Khi nuôi cấy callus hệ thống Bioreactor để thu nhận sản phẩm thứ cấp hiệu suất mang lại cao Hiện có số sản phẩm quan trọng sản xuất từ hệ thống Alkaloid: morphinan alkaloid, berberine, tropane alkaloid, cardinolides; hợp chất kháng ung thư: camptothecin, homoharringtonine, podophyllotoxin, vinca alkaloid, taxol, saponin… Và cung có số thành công việc sử dụng Bioreactor nuôi cấy huyền phù tế bào thông đỏ, dừa cạn, sam Triều Tiên, lan gấm…với thể tích bình nuôi cấy từ vài chục lít đến vài chục nghìn lít [2] Saurabh C cộng (2001), nuôi cấy hệ thống Bioreactor 3L, sinh khối hợp chất podophyllotoxin thu từ nuôi cấy huyền phù Podophyllum hexandrum 6,5 g/l 4,26 mg/l 22 ngày [19] 3.1.2 Nhân sinh khối rể Mặc dù tế bào chưa biệt hóa chủ yếu nghiên cứu, phương pháp nuôi cấy rễ quan khác quan tâm nhiều Khi nuôi cấy rể không cần sử dụng nguồn mẫu cấy rể ban đầu nhiều chúng có tốc độ tăng trưởng cao Vấn đề việc nuôi cấy rể Bioreactor nguồn cung cấp Oxygen không đến với sinh khối Bioreactor dẫn đến hậu nhiều khối mô lão hóa Vì rể có nhiều nhánh nên nhiều rể đan xen vào có khả cản lại nguồn cung cấp khí dinh dưỡng cho rể nằm phía Khả nuôi cấy rể thành công để làm nguồn cho việc sản xuất chất có hoạt tính sinh học phụ thuộc vào việc thiết kế hệ thống Bioreactor phù hợp, để đáp ứng yêu cầu nuôi cấy, việc theo dõi số vật lý hóa học Bioreactor không phần quang trọng [29] GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 13 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Hoạt chất thứ cấp nghiên cứu sản xuất nhiều nuôi cấy Bioreactor Gingsenoside, thành phần dược tính quan trọng nhân sâm, có đặc điểm có tính miễn dịch, chống mệt mỏi, điều hoà sinh lý có số tác dụng dược tính khác [27] Công ty Mitsui Petrochemical Industry Nhật Bản thành công việc sản xuất hợp chất shikonin mục đích thương mại từ Lithospermum erythrorhizon lúc đó, Nhật công ty khác Nitto Denko sản xuất sinh khối Panax ginseng tank 20 lit [15] Và công ty khác Meiji Seika, chứng minh đựơc quy tắc sản xuất tế bào Panax ginseng thể tích lớn K.Y Paek cộng (2000), nhận thấy hàm lượng saponin tăng sau 40 ngày nuôi cấy hệ thống Air-lift 20 L [14] Khi nghiên cứu phát triển sinh khối nuôi cấy huyền phù tế bào nuôi cấy rể bất định cấy nhân sâm hệ thống Bioreactor, L Langhansova cộng nhận thấy, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hàm lượng Gingsenoside cao nhiều so với nuôi cấy rể bất định Cụ thể nuôi cấy dịch huyền phù hàm lượng Gingsenoside chiếm 4,34 % hàm lượng chất khô, so với nuôi cấy rể bất định 1,45 % [13] 3.2 Kết ứng dụng hệ thống bioreactor vi nhân giống vô tính thực vật 3.2.1 Trên đối tượng hoa Lily Năm 2005, Phân viện Sinh học Đà lạt nghiên cứu thành công nuôi cấy hoa lily hệ thống nuôi cấy Bioreactor Kết sau đưa ứng dụng cho thấy, sản xuất hàng loạt củ giống hoa Lyli (cụ thể mẽ nuôi cấy tạo khoảng 10000 củ giống) điều cung cấp nguồn giống lớn cho sở trồng hoa, góp phần giảm giá thành củ giống GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 14 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Theo TS.Nhựt cộng (2005), củ Lily sau tuần nuôi cấy hệ thống Bioreactor hình cầu dung tích 3L với 300ml môi trường củ tăng trưởng mạnh mẽ với trọng lượng thu tăng vọt so với trọng lượng mẫu ban đầu( 107.03g so với 25g) Đặc biệt kích thước củ gia tăng nhanh ( đường kính củ 9.9 mm) Đây yếu tố phù hợp cho công tác nhân giống hoa Lily, kích thước củ định lớn đến thời gian củ đạt kích thước hoa chất lượng hoa thu phụ thuột nhiều vào kích thước củ mẹ Trong môi trường hệ thống nuôi cấy Bioreactor, mẫu nuôi cấy thỏa mản yêu cầu chung cho sinh trưởng dinh dưỡng độ thoáng khí Sự tiếp xúc trực tiếp dinh dưỡng lỏng giúp mẫu cấy hấp thu chất dinh dưỡng tốt thoáng khí lại giúp loại bỏ thành phần khí độc môi trường, cung cấp oxygen hòa tan cho mẫu hô hấp tăng trưởng Vì giới, hệ thống nuôi cấy ứng dụng thành công nhiều mục đích khác nhau( nuôi cấy chồi, củ, rễ…) quy mô công nghiệp Sau 14 tuần nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt Sự hóa nâu chết mẫu xảy làm giảm hiệu suất hệ thống nuôi cấy Ngoài ra, có lão hóa chết vảy bên củ có kích thước lớn phát triển quan củ bề mặt môi trường Có thể lúc này, dinh dưỡng cạn kiệt, củ bắt đầu hình thành quan quang hợp, trì sống củ Quan sát đóng mở khí khổng nuôi cấy in vitro cho thấy củ nuôi cấy hệ thống Bioreactor bị tượng thủy tinh thể so với nuối cấy lỏng tĩnh Như vậy, khẳng định hệ thống nuối cấy Bioreactor thực hiệu nuôi cấy tăng sinh khối củ lily in vitro với thời gian tuần nuôi cấy Điều ý nghĩa nhân giống thương mại hoa lily cung cấp số lượng lớn củ có kích thước lớn mà rút ngắn thời gian nuôi cấy, hạn chế to lớn nghành công nghiệp nuôi cấy mô [3] Theo S.K Kim cộng (2000), nuôi 20 tuần lưu giữ tuần nhà kính nhiệt độ 4oC đường kính tăng 5mm, đạt từ – cm sau tháng nuôi cấy củ hoa Lily hệ thống Air-lift 20L.[20] 3.2.2 Trên đối tượng lan Hồ điệp Hiện nay, sau thành công đối tượng hoa Lily nhà khoa học Việt Nam bắt tay vào nghiên cứu “ Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời nhân giống lan hồ điệp lai (Phalaenopsis hybrid)” nhằm đáp ứng nhu cầu giống cho thị trường góp phần giảm giá thành giống nước ta Trong nghiên cứu này, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời sử dụng nhân giống thực vật sản xuất Đài Loan, Plantima sử dụng so sánh với phương pháp nuôi cấy thông thường GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 15 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật sử dụng phòng nuôi cấy mô Việt Nam nuôi cấy thạch, nuôi cấy lỏng, lỏng có lắc việc nhân nhanh Protocorm-like bodies – PLBs, tái sinh chồi từ PLBs nuôi cấy Hồ Điệp hoàn chỉnh Đối tượng thí nghiệm loài Lan Hồ Điệp lai Trên giai đoạn phát triển mẫu cây, tác giả tiến hành nuôi môi trường dinh dưỡng thích hợp để đưa thí nghiệm khảo sát việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy vào việc nhân giống lan Hồ điệp Kết thu được, trung bình bình Plantima có 2300 PLBs thu từ khoảng 100 PLBs ban đầu PLBs tạo thành có kích thước lớn, màu xanh nhạt hình thái bình thường tốt so với PLBs tạo thành môi trường đặc nuôi cấy lỏng Mặc dù vậy, tính vượt trội trung bình PLBs tạo thành từ PLBs ban đầu kết chưa thật thuyết phục (23,4 PLBs hệ thống TIS so với 18 16 PLBs hệ thống lỏng lắc môi trường thạch) Điều giải thích thông số chu kỳ ngập cài đặt thí nghiệm chưa tối ưu cho việc nhân nhanh PLBs, thời gian ngập tương đối ngắn phút 30 giây sau Ngoài mật độ mẫu cấy thể tích môi trường tác động lớn lên trình nhân PLBs, để đạt hiệu cao sử dụng hệ thống TIS trình nhân PLBs, cần khảo sát tối ưu hóa thông số mật độ, thể tích chu kỳ ngập chìm hệ thống TIS Bảng 1: Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy đến tạo thành PLBs sau tháng Hệ thống nuôi cấy Số PLBs Lỏng lắc 18,6 Thạch 16.4 TIS 23,4 Trên hệ thống TIS, từ PLBs ban đầu nhiều tái sinh cho lượng tái sinh vượt trội so với hệ thống lại Trong bình Plantima trung bình số tái sinh từ PLB ban đầu 18,75 so với 3,26 PLBs hộp nhựa tròn Thêm vào đó, sinh trưởng phát triển chồi tái sinh hệ thống TIS vượt trội chồi hộp nhựa tròn tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng Trong hệ thống TIS, môi trường không khí luôn có trao đổi bên bên bình thông qua hệ thống bơm màng lọc Do sinh trưởng môi trường thoáng khí tốt nên chồi Hồ Điệp tái sinh hệ thống TIS phát triển tốt so với hệ thống hộp nhựa tròn kín thông thường GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 16 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Kết cho thấy hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời khắc phục tượng bất lợi thiếu thông thoáng môi trường lỏng ngập liên tục hay hệ thống kín môi trường rắn, giúp gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng Sự nuôi cấy đồng hóa chất dinh dưỡng khuếch tán thúc đẩy tăng trưởng đồng chồi nuôi cấy Chồi nhân giống hệ thống phát triển nhanh hơn, suất cao hơn, phẩm chất tốt Kết hình thành rể sau cac chồi cho sử lý rể, hệ thống ngập chìm tạm thời hội tụ đủ điều kiện cần thiết ngập không lâu, thoáng khí tốt giúp không bị thủy tinh thể, tăng cường khả quang hợp nên phát triển đặn, thích hợp cho trình tạo rễ khỏe mạnh trước vườn ươm Tóm lại nuôi cấy hệ thống TIS giúp phát triển nhanh mạnh nuôi cấy hệ thống kín thông thường giúp rút ngắn thời gian để đạt kích thước để vườn ươm Tuy thành công bước đầu hệ thống cho thấy ưu điểm lớn so hệ thống nuôi cấy truyền thống, tạo hướng cho CNSH Thực vật nước ta nói chung lĩnh vực nhân giống trồng nói riêng 3.2.3.Trên đối tượng hoa Thu hải đường (THĐ) Nuôi cấy Thu hải đường thông qua đường nuôi cấy lát mỏng tế bào (TCL) khả nhân chồi nuôi cấy Bioreactor cao gấp 10 lần so với nuôi cấy môi trường thạch lần so với nuôi cấy lỏng tĩnh [16] Theo nghiên cứu TS Dương Tấn Nhựt cộng (2005), cho thấy sau nuôi cấy từ – tuần khả tăng sinh khối cụm chồi Thu hải đường hệ thống Bioreactor gấp 42 lần so với sinh khối mẫu cấy ban đầu Trong đó, với phương pháp nuôi cấy khác nuôi cấy agar, sinh khối tắng cao đạt lần; nuôi cấy lỏng tĩnh 6,5 lần; nuôi cấy lỏng lắc 23 lần Điều chứng tỏ khả to lớn hệ thống nuôi cấy Bioreactor việc nhân số lượng lớn sinh khối thực vật Cũng nghiên cứu này, kết đáng ghi nhận khác khả rể tốt cụm chồi thu sau tuần nuôi cấy tuần giãn chồi Điều giải thích mẫu cấy có tăng trưởng tốt hệ thống Bioreactor nên chuyển sang môi trường rể rễ dể dàng Cây sau rể khả sống sót tốt sinh trưởng phát triển bình thường sau tháng [1] GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 17 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật KẾT LUẬN Bioreactor sử dụng nuôi cấy mô tế bào cải tiến từ hệ thống Bioreactor nuôi cấy tế bào vi sinh Bioreactor với hệ thống cung cấy xả môi trường, hệ thống cấp thoát khí vô trùng thiết kế có khả tạo môi trường nuôi cấy vô trùng, kiểm soát yếu tố môi trường bên lắc, thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH… [33] Các ưu điểm Bioreactor đưa đến phát triển kỹ thuật thích hợp cho việc nhân giống quy mô lớn thực vật qua nuôi cấy phôi, mô tế bào Tuy nhiên, số loài thực vật không thích hợp với việc nuôi cấy môi trường lỏng Hiện tượng thủy tinh thể thường xuyên xảy với mô, chồi nuôi cấy môi trường lỏng chuyển chồi vườn ươm chúng dễ bị úa vàng bị nước độ ẩm bên thấp, từ dẫn đến tỷ lệ sống sót thấp Đối với việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy Bioreactor, vấn đề cần thiết hướng đến cải thiện điều kiện môi trường hóa lý, gia tăng trao đổi không khí, tăng cường ánh sáng lượng khí CO2 để kỹ thuật áp dụng tốt thực tế [29] Về hệ thống TIS, với điều kiện Việt Nam nay, giá thành hệ thống nuôi cấy TIS tương đối cao phải nhạp hệ thống nước Pháp, Cuba, Đài Loan muốn ứng dụng rộng rải hệ thống thiết phải nghiên cứu thiết kế nước để giảm giá thành Ngoài ra, thống số kỹ thuật hệ thống cần khảo sát kỹ lượng tối ưu hóa giai đoạn nuôi cấy loại cây, có điều kiện co khả ứng dụng hệ thốngnayf cách rộng rải sản xuất giống [32] Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời hệ thống tận dụng ưu điểm nuôi cấy lỏng nuôi cấy thạch mà hạn chế nhược điểm hai hệ thống GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 18 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật nuôi cấy giúp tạo môi trường nuôi cấy thoáng khí, khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót cao, giảm chi phí nhân công, tiết kiệm giảm chi phí môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường mẫu cấy không sử dụng thạch, hệ số nhân gia tăng nhiều lần so với nhân giống hệ thống nuôi cấy thông thường.[31] GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 19 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Mai Xuân Phán, Phân Xuân Huyên, Đinh Văn Khiêm (2005), Nuôi cấy lắc nuôi cấy Bioreactor nhân giống hoa Thu hải đường (Begonia tuberous), Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(3): 363-372 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải (2006), Hệ thống nuôi cấy Bioreactor Công nghệ Sinh học Thực vật, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3): 265-283 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thụy Minh Hạnh, Nguyễn Thị Huyền Trâm, Phạm Quốc Tuấn, Nguyễn Trí Minh, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Bùi Văn Lệ, Nguyễn Minh Tuấn, Thái Xuân Du (2005), Bước đầu nghiên cứu khả sản xuất củ giống Lily (Lilium spp.) hệ thống Bioreactor, Báo cáo Khoa học: Những vấn đề nghiên cứu Khoa học sống Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ Sinh học Thực vật tập 1, NXB Nông nghiệp Huỳnh Văn Kiệt (2006), Giáo trình Công nghệ Tế bào Thực Vật, Trường Cao Đẳng LTTP Đà Nẵng Võ Thị Bạch Mai (2003), Thủy canh trồng, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng Anh A.M Shohael, D Chakrabarty, K.W Yu, E.J Hahn and K.Y Paek (2005), Application of bioreactor system for large-scale production of Eleutherococcus sessiliflorus somatic embryos in an air-lift bioreactor and production of eleutherosides, Research Center for the Development of Advanced Horticultural Technology, Chungbuk National University, Cheongju, South Korea D T Nhut, B N Huy , P T Phong , N T Hai , T C Luan (2005), Primary study on multiplication of adventitious roots of panax vietnamensis – a valuable material source for saponin isolation Escalona M., Lorenzo J.C., Gonzolez B., Daquinta M., Fundora Z., Borroto C.G., Espinosa D., Arias E., Aspiolea M.E., (1998), New system for in vitro propagation of pineapple , Pineapple New 5: 5-7 10 F Mavituna and S Buyukalaca, Somatic embryogenesis of pepper in bioreactors: a study of bioreactor type and oxygen-uptake rates, Applied Microbiology and Biotechnology J., Volume 46, Number / November, 1996, 327-333 11 Hiroyuki Honda, Kousuke Hiraoka, Eiji Nagamori, Mariko Omote, Yoshihito Kato, Setsuro Hiraoka and Takeshi Kobayashi (2003),Enhanced anthocyanin production from grape callus in GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 20 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật an Air-Lift type bioreactor using a viscous additive-supplemented medium, Scientia Horticulturae Volume 97, Issue 1, 41-48 12 Lazzeri P A., Hildebrand D E., Collin G B (1987), Soybean somatic embryogenesis: effect of nutritional, physical and chemical factors Plant cell Tiss Org Cult 10: 209-220 13 L Langhansova, P Marsik and T Vanek (2005), Production of saponins from Panax ginseng suspension and adventitious root cultures, Biologia Plantarum vol 49 (3), 463-465 14 K.-Y Paek (2000), Increase of saponin contents via elicitor treatments in bioreactor culture of ginseng (panax ginseng c.a meyer) adventitious roots, Springerlin J 15 Masanaru Misawa (1994), plant tissue culture: an alternative for production of useful metabolite, Agricultural services bulletin no 108 16 Nhut D T., Phan M X (2005), Thin cell layer technology and Bioreactor culture in rapid propagation of Begonia tuberous 17 Paek K.Y., Debasis C (2003), Micropropagation of Woody plant using Bioreactor, Micropropagation of Woody trees anf fruits J.: 735-756 18 R R Henke, K W Hughes, M J Constantin, and A Hollaender (eds.), Tissue culture of forestry and agriculture Plenum Press, New York 19 Saurabh C., Ashok K.L., Sant S.B and Virendra S (2001), Production of Podophyllotoxin by Plant Cell Cultures of Podophyllum hexandrum in Bioreactor, sprigerlin J 20 S.K Kim, J.S Lee, K.H Huang, B.J Ahn (2000), Utilization of embryogenic cell cultures for the mass production of bulblets in oriental and easter lilies, ISHS Acta Horticulturae 625: XXVI International Horticultural Congress: Biotechnology in Horticultural Crop Improvement: Achievements, Opportunities and Limitations Springerlin J 21 Smart, N J., and M W Fowler 1984 An airlift column bioreactor suitable for large-scale cultivation of plant cell suspensions J Expt Bot 35:531–537 22 Styer, D J 1985 Bioreactor technology for plant propagation p 117–130 In: R R Henke, K W Hughes, M J Constantin, and A Hollaender (eds.), Tissue culture of forestry and agriculture Plenum Press, New York 23 Teisson C, Alvard D (1995), A new concept of plant in vitro aultivation liquid medium: temporary immersion In: Terzi M et al Current Issues in plant molecular and cellular Biology, 105-110 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 21 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật 24 Tisserat B., Vandercook C.E (1985), Development of an automated plant culture system Plant cell tiss org cult 5: 107-117 25 Thanh N T, Yu K W, Hahn E J Paek K Y(2005), High-density cultivation of panax ginseng cells in alloon type bioreactors: role of oxygen supply on biomass and ginsenoside production 26 Y.E Choi , J.H Jeong C.K Shin (2004), Hormone-independent embryogenic callus production from ginseng cotyledons using high concentrations of NH4NO3 and progress towards bioreactor production, Plant Cell, Tissue and Organ Culture J 72(3), 229-235 27 Zhang YH, Zhong JJ (1997) Hyper-production of ginseng saponin and polysaccharide by high-density cultivation of P notoginseng cells Enzyme Microb Tech 21: 59-63 28 Harris RE, Mason EB (1983), Two machines for in vitro propagation of plant in liquid media Can J plant Sci 63: 311-316 29 K.Y Paek, D Chakrabarty, E.J Hahn (2005), Application of Bioreactor systems for large scale production of horticultural and medicinal plant Plant cell, tissue and organ culture 81:287-300 30 Etienne H., Berthouly M (2002), Temporary immersion system in plant micropropagation Plant cell, Tissue and Organ culture 69: 215-231 Tài liệu Mạng 31 Bước đầu ứng dụng thành công hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời nhân giống Lan Hồ Điệp lai – Phalaenopsis hydrid Web: www.hcmbiotech.com.vn/reseach_detai.php?id=10 31 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (05-01-2007), Web: www.hcmbiotech.com.vn/reseach_detai.php?cateid=3&ID=45 33 Ứng dụng hệ thống Bioreactor sản xuất số lượng lớn dược liệu hoa cảnh (10/11/2006) GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 22 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Mục lục Trang MỞ ĐẦU MỘT SỐ HỆ THỐNG BIOREACTOR 2.1 Cấu tạo chung 2.2 Phân loại 2.2.1 Bioreactor cánh khuấy 2.2.2 Hệ thống nuối cấy ngập chìm tạm thời 2.2.2.1 Nguyên tắc cấu tạo 2.2.2.1.1 Hệ thống RITA 2.2.2.1.2 Hệ thống bình sinh đôi BIT 2.2.2.1.3 Hệ thống Plantima 2.2.2.2 Ưu khuyết điểm hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời a Ưu điểm b Khuyết điểm 2.2.2.3 Ảnh hưởng hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng nuôi cấy 2.3 Các yếu tố thông số ảnh hưởng đến trình nuối cấy 2.3.1 Không khí 2.3.2 Oxygen hòa tan 2.3.3 Sự đảo trộn 2.3.4 pH 10 2.3.5 Chất dinh dưỡng 10 2.3.5.1 Nguồn Cacbon 10 2.3.5.2 Dinh dưỡng khoáng 10 2.3.5.3 Chất điều hoà sinh trưởng 11 2.3.5.4.Vitamin 11 2.3.6 Thời gian ngập chìm mẫu 12 2.3.7 Thể tích môi trường dinh dưỡng 12 2.4 Sự phát triển thực vật Bioreactor 12 2.4.1 Quá trình phát sinh phôi soma 12 2.4.2 Sự nhân chồi 13 KẾT QUẢ 13 3.1 Kết ứng dụng hệ thống Bioreactor nhân sinh khối tế bào 13 3.1.1 Nhân sinh khối callus 13 3.1.2 Nhân sinh khối rể 14 3.2 Kết ứng dụng hệ thống bioreactor vi nhân giống vô tính thực vật 15 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 23 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật 3.2.1 Trên đối tượng hoa Lily 15 3.2.2 Trên đối tượng lan Hồ điệp 16 3.2.3.Trên đối tượng hoa Thu hải đường (THĐ) 18 KẾT LUẬN 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 24 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn [...]... Mai Xuân Phán, Phân Xuân Huyên, Đinh Văn Khiêm (2005), Nuôi cấy lắc và nuôi cấy Bioreactor trong nhân giống cây hoa Thu hải đường (Begonia tuberous), Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(3): 363-372 2 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải (2006), Hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong Công nghệ Sinh học Thực vật, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3): 265-283 3 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn... năng sản xuất củ giống Lily (Lilium spp.) bằng hệ thống Bioreactor, Báo cáo Khoa học: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản của Khoa học sự sống 4 Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ Sinh học Thực vật tập 1, NXB Nông nghiệp 5 Huỳnh Văn Kiệt (2006), Giáo trình Công nghệ Tế bào Thực Vật, Trường Cao Đẳng LTTP Đà Nẵng 6 Võ Thị Bạch Mai (2003), Thủy canh cây trồng, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu... màng lọc Do được sinh trưởng trong môi trường thoáng khí tốt nên chồi Hồ Điệp tái sinh trong hệ thống TIS phát triển rất tốt so với trong hệ thống hộp nhựa tròn kín thông thường GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 16 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Kết quả cho thấy hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm... nhân sinh khối tế bào 13 3.1.1 Nhân sinh khối callus 13 3.1.2 Nhân sinh khối rể 14 3.2 Kết quả ứng dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống vô tính thực vật 15 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 23 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật 3.2.1 Trên đối tượng hoa Lily ... Tisserat và Vandercook (1985), thì nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời APCS sự phát triển của đỉnh chồi Potinera nhanh hơn trên môi trường rắn Cả hai thống số tươi và khô đều tăng gấp 4 lần 3 KẾT QUẢ 3.1 Kết quả của ứng dụng hệ thống Bioreactor trong nhân sinh khối tế bào 3.1.1 Nhân sinh khối callus Trong những năm gần đây, việc ứng dụng nuôi cấy nhân sinh khối callus đang được chú ý nhiều để... nước ta hiện nay Trong nghiên cứu này, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời sử dụng trong nhân giống thực vật sản xuất tại Đài Loan, Plantima được sử dụng và so sánh với phương pháp nuôi cấy thông thường GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 15 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật được sử dụng bởi các phòng... muốn ứng dụng rộng rải thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ở trong nước để giảm giá thành Ngoài ra, những thống số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lượng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới co khả năng ứng dụng hệ thốngnayf một cách rộng rải trong sản xuất cây giống [32] Hệ thống. .. trường rắn Trong hệ thống Bioreactor, chồi có thể tăng trưởnglieen tục, vì thế cho phép thu hoạch chồi sau mỗi tháng trong khoảng thời gian 18 GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 12 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật tháng mà không cần cấy chuyền Điều quan trọng là chồi thu được trong hệ thống nuôi... tái sinh từ một PLB ban đầu là 18,75 so với 3,26 PLBs trong hộp nhựa tròn Thêm vào đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn chồi trong hộp nhựa tròn về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá Trong hệ thống TIS, môi trường không khí luôn luôn có sự trao đổi giữa bên trong và bên ngoài bình thông qua hệ thống bơm và các màng lọc Do được sinh. .. www.hcmbiotech.com.vn/reseach_detai.php?id=10 31 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (05-01-2007), Web: www.hcmbiotech.com.vn/reseach_detai.php?cateid=3&ID=45 33 Ứng dụng hệ thống Bioreactor trong sản xuất số lượng lớn cây dược liệu và hoa cảnh (10/11/2006) GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 22 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật Mục lục ... Diversa, trang bị đến năm hệ thống Bioreactor có dung tích đến 75.000 L để nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, chi tiết cụ thể hệ thống Bioreactor không tiết lộ, theo hình ảnh trưng bày cho thấy... Application of bioreactor system for large-scale production of Eleutherococcus sessiliflorus somatic embryos in an air-lift bioreactor and production of eleutherosides, Research Center for the Development... Bioreactor chứa thành phần điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (trong số thiết bị thay sục khí nén từ lên)… Nguyên tắc hoạt