Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn PHN I C S DI TRUYN Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn M U LC S PHT TRIN CA DI TRUYN HC V K THUT DI TRUYN 1.1- LNH VC NGHIấN CU CA DI TRUYN V CễNG NGH DI TRUYN Thut ng di truyn (geneties) xut phỏt t gc latinh l gentikos (ngun gc) Di truyn hc l mt b mụn ca sinh hc, chuyờn i sõu nghiờn cu hai c tớnh c bn ca s sng l tớnh di truyn v tớnh bin d Tớnh di truyn biu hin s ging ca cỏc tớnh trng gia th h ny v th h khỏc c tớnh di truyn cho phộp th gii sinh vt bo ton nũi ging Tri qua nhiu th h ni tip nhng nhng c tớnh di truyn khụng b mt i, th h chỏu luụn cú nhng c im ging b m, ụng b Cỏc sinh gii sng iu kin mụi trng luụn cú nhng bin ng nh s thay i thi tit, nhit mụi trng, lng nc, lng thc n v s u tranh sinh tn gia cỏc loi thớch nghi vi iu kin sng, cỏc c th sng cng cú nhng thay i, lm xut hin nhng tớnh trng khỏc gia cỏc th h, ú l s bin d Bin d biu hin s sai khỏc ca th h chỏu so vi th h b m ng thi s sai khỏc ca mt cỏ th no ú so vi cỏc cỏ th khỏc cựng n Di truyn hc thc s tr thnh mt b mụn khoa hc c lp k t nhng nm 1900 - 35 nm sau ngy Mendel cụng b cụng trỡnh Cỏc thớ nghim lai thc vt T ú n nay, cựng vi s phỏt trin mnh m ca cỏc nghnh khoa hc khỏc nh vt lý, toỏn hc, húa hc, di truyn hc ó v ang khỏm phỏ rt nhiu quy lut v s tn ti v lu truyn s sng v tr thnh mt mi nhn nghiờn cu sinh hc Nhng thnh tu rc r ca di truyn hc ó em li nhng nhn thc mi v cu to v s hnh b mỏy di truyn ca c th sng Cựng vi s phỏt trin mnh m ca di truyn hc, mt lnh vc nghiờn cu mi ca di truyn hc i, ú l k thut di truyn hay cũn gi l cụng ngh gen hoc cụng ngh di truyn (genetic engineering) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -2- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Cú th núi, k thut di truyn l mt hp ca nhiu k thut nh húa hc, sinh hc phõn t, vi sinh vt hc, m ú, vai trũ hng u thuc v cỏc t v phng phỏp ca di truyn Cụng ngh di truyn s dng cỏc phng phỏp sinh hc phõn t tỏch DNA t mt c th sng v sau ú ct, ni cỏc gen trờn DNA Bng cỏch nh vy, ngi ta cú th loi b cỏc gen khụng mong mun v a vo cỏc gen mi c hiu theo ch ý la chn Cỏc thao tỏc ct, ni trờn DNA c thc hin bờn ngoi c th sng cỏc ng nghim (in vitro) Phõn t DNA mi c to dng sau cỏc thao tỏc ct, ni cú mt s c im khỏc vi phõn t DNA ban u c tỏch t t bo sng, c gi l DNA tỏi t hp v k thut ny c gi l k thut tỏi t hp DNA S tỏi t hp DNA c ỏnh giỏ l thnh cụng ch sau a c phõn t DNA tỏi t hp vo t bo sng v chỳng biu hin cỏc hot tớnh di truyn v th h chỏu s mang phõn t DNA tỏi t hp Cú th núi: K thut di truyn l s thao tỏc b mỏy di truyn ca mt c th sng bng cỏch thờm vo hay loi bt gen c hiu 1.2- GIAI ON DI TRUYN SAU MENDEL Phỏt minh ca Mendel ó t nn múng cho di truyn hc Tuy nhiờn, thi im m Mendel cụng b cụng trỡnh nghiờn cu ca mỡnh, mt phn cha hiu rừ c c ch phõn bo, cỏc nh khoa hc cha th hiu v ỏnh giỏ ỳng mc tm quan trng ca phỏt minh ny Cui th k XIX, nm sau ngy cụng b cụng trỡnh ca Mendel (1870), cỏc giai on ca quỏ trỡnh phõn bo nguyờn phõn v sau ú, phõn bo gim nhim (1890) ó c mụ t mt cỏch chi tit Di kớnh hin vi, cỏc nh nghiờn cu ó quan sỏt thy cỏc nhim sc th v s phõn chia cỏc nhim sc th quỏ trỡnh phõn bo Nm 1902-1903, W.S Sutton, Th Bovery v mt s nh khoa hc khỏc ó tin hnh cỏc nghiờn cu c lp, cng ó phỏt hin cú s tng quan ng iu gia s biu hin ca nhim sc th phõn bo vi s biu hin ca cỏc tớnh trng theo Mendel Thut ng gen nh khoa hc an Mch W Johansen nờu nm 1909 Hc thuyt di truyn nhim sc th i: Cỏc gen c chng minh l nm trờn nhim sc th, chim mt v trớ xỏc nh, xp theo ng thng v chỳng chu s phõn li nh nhim sc th Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -3- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hc thuyt di truyn nhim sc th ó a di truyn hc lờn mt bc phỏt trin mi S phỏt trin ca di truyn nhim sc th gn lin vi nhúm nghiờn cu Morgan lónh o vi cỏc nh di truyn hc ni ting nh C Bridges, A.H Sturtevant v G Muller: - Vic phỏt hin s khỏc gia cỏc cỏ th c v cỏi cp nhim sc th gi l nhim sc th gii tớnh, l mt d kin quan trng xõy dng nờn hc thuyt di truyn nhim sc th Cỏc gen nm trờn nhim sc th gii tớnh s cú s di truyn khỏc hn so vi cỏc gen nm trờn nhim sc th thng Quy lut di truyn ca cỏc gen liờn kt vi nhim sc th gii tớnh ó c xỏc nh - Hin tng trao i chộo gia cỏc on nhim sc th tng ng phõn bo gim nhim dn ti s sp xp li cỏc gen, t ú xut hin cỏc giao t dng mi khụng ging ca cha m, gi l dng tỏi t hp (recombinant) Da vo tn s tỏi t hp n nh gia cỏc gen, ngi ta xõy dng cỏc bn di truyn nhim sc th Hc thuyt di truyn nhim sc th ó cng c thờm cho hc thuyt v gen ca Mendel, nhng nú c th hn, ng thi, nú ch rừ gii hn ca quy lut phõn li c lp hc thuyt ca Mendel Sau chin tranh th gii ln th hai, di truyn hc phõn t ó phỏt trin rt mnh m Nm 1944, O Avery, Mc Leod v Mc Carty ó chng minh rng: DNA chớnh l cht di truyn Nm 1953, mụ hỡnh cu trỳc DNA ca Wattson-Crick i, ó to mt bc ngot ln cho s phỏt trin ca di truyn hc v sinh hc Nm 1961, M Nirenberg v J Matthei ó xỏc nh c b mó di truyn u tiờn v sau ú, ton b cỏc b mó di truyn cng ó c tỡm 1.3- S RA I CA CễNG NGH DI TRUYN K thut di truyn i vo nhng nm u ca thp niờn 70 th k 20 Phõn t DNA tỏi t hp u tiờn c nhúm cỏc nh nghiờn cu M l Berg, Boyer v Cohen to nm 1972-1973 t ngun vt liu di truyn ban u l DNA ca virus SV40 gõy ung th kh c ct, ghộp vi DNA ca vi khun E Coli Phõn t DNA mi c to ng nghim ny ó khụng c a vo vi khun E Coli nh ó d nh vỡ lý an ton cho ngi v Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -4- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn ng vt, s rng loi vi khun mi mang gen ca virus gõy nờn ung th, nu thoỏt ngoi s gõy dch bnh m ngi thỡ cha cú cỏch iu tr, tai hi l khú lng Nm 1973-1974, nhúm cỏc nh khoa hc ngi M Cohen ng u vi Helinski, Boyer ó s dng plasmid lm ngun vt liu cho cỏc nghiờn cu ca h Plasmid l nhng phõn t DNA mch vũng, xon kộp, ngoi nhõn Plasmid xut hin khỏ ph bin vi khun, mó húa cỏc gen biu hin tớnh khỏng thuc, khỏng khỏng sinh vi sinh vt - plasmid pSR100 c phõn lp v lm sch Plasmid ny mang gen khỏng tetracycline c ct ti mt v trớ bng enzyme ct hn ch EcoRI, v trớ ct ny khụng nm vựng cú cha cỏc gen c bn v ni mt on DNA ca plasmid R6-5d cú cha gen khỏng kanamixin to thnh mt phõn t lai gi l DNA tỏi t hp Nh vy, phõn t DNA tỏi t hp cú cha hai gen biu hin tớnh khỏng tetracycline v kanamixin Phõn t DNA c to dng ng nghim ny c a tr li vo t bo E Coli Kt qu l vi khun E Coli mang plasmid cú cha hai gen khỏng thuc ó cú kh nng khỏng c tetracycline v kanamixin, ngha l, loi vi khun ny cú th phỏt trin c trờn mụi trng chn lc cú cha c tetracycline v kanamixin Mt thớ nghim kim tra c b trớ ó khng nh rng, loi vi khun mi ny mang phõn t DNA tỏi t hp Sau thnh cụng rc r ca nghiờn cu trờn, nhiu nh khoa hc ó tin hnh cỏc thớ nghim lp ghộp gen v ó thu c nhiu kt qu ng dng c thc tin T nhng nm 1990, s kt hp gia sinh hc, cụng ngh di truyn v tin hc ó cho phộp rỳt ngn thi gian nghiờn cu v ó thu c nhiu kt qu hon ho hn 1.4- í NGHA KHOA HC V THC TIN CA CễNG NGH DI TRUYN Cụng ngh di truyn hin ang úng vai trũ c s cho nhng nghiờn cu v ng dng ca cụng ngh sinh hc, l mi nhn ca nghnh cụng ngh sinh hc V ý ngha khoa hc, cú th núi rng, s i ca cụng ngh di truyn v nhng thnh tu t c ó to nờn mt cuc cỏch mng v nhn thc ca ngi i vi th gii sinh hc Ngy nay, ngi hiu rừ hn v Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -5- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn cỏc c ch di truyn v ang tng bc iu khin chỳng to cỏc chng loi sinh vt cú li cho ngi V ý nghió thc tin, cụng ngh di truyn c ng dng nhiu lnh vc nghiờn cu v sn xut liờn quan n nụng nghip, cụng ngh thc phm, y dc, bo v mụi trng, Khú cú th lit kờ ht tt c nhng kt qu nghiờn cu da trờn c s ca cụng ngh di truyn ó c ng dng vỡ tc phỏt trin nhanh chúng ca lnh vc cụng ngh ny, xin gii thiu mt s vớ d c th nh sau: 1.4.1- Trong y dc Vn dng k thut di truyn, cỏc nh khoa hc ó cú th chn oỏn cỏc bnh ri lon di truyn v tin ti iu tr bng cỏch thay gen bnh bng gen lnh hay a gen lnh vo c th bự p cho gen bnh - õy l mt hng ng dng khú thc hin nht Trong nhng nm qua, lnh vc ng dng cụng ngh di truyn mnh nht y t l nghnh sn xut thuc khỏng sinh, vỏc xin, khỏng th n dũng v cỏc protein cú hot tớnh sinh hc Hin nay, cỏc nghiờn cu nhm tỡm kim cỏc cht khỏng sinh mi tng mnh hin tng vi sinh vt khỏng li tỏc dng ca khỏng sinh ngy cng nhiu hn Phm vi ng dng ca khỏng th n dũng ngnh y t ngy cng tng nh phõn tớch dch, nh v cỏc u, phỏt hin mt s protein cú liờn quan n s hỡnh thnh u, xỏc nh s cú mt ca cỏc loi vi khun khỏc nhau, giỳp cho cỏc bỏc s xỏc nh bnh mt cỏch nhanh chúng v chớnh xỏc Khỏng th n dũng l hp cỏc phõn t khỏng th ng nht v mt cu trỳc v tớnh cht Khỏng th n dũng c to bng cỏch cho lai t bo lympho h dch ca ng vt hoc ca ngi vi t bo ung th Mt s th lai cú kh nng to khỏng th c hiu i vi khỏng nguyờn Chn cỏc th lai ú nhõn lờn v sn xut khỏng th n dũng Cỏc t bo lai cú kh nng tng sinh vnh vin mụi trng nuụi cy - tớnh cht ny nhn c t t bo ung th Nh cụng ngh s dng DNA tỏi t hp m ngi ta cú th sn xut mt s protein cú hot tớnh sinh hc dựng cha bnh nh insulin cha bnh Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -6- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn tiu ng, interferon cha bnh ung th, cỏc hormon tng trng cho ngi Bn cht ca cụng ngh ny l lm thay i b mỏy di truyn ca t bo bng cỏch a gen mó húa cho mt protein c hiu v bt nú hot ng to mt lng ln loi protein m ngi cn 1.4.2- Trong nụng nghip Vn chn ging cú vai trũ rt quan trng sn xut nụng nghip, nhm nõng cao sn lng v chng cỏc loi sõu, bnh cng nh cỏc iu kin t nhiờn bt li i vi cõy trng v vt nuụi K thut di truyn c s dng xỏc nh v trớ ca cỏc gen mó húa cho cỏc tớnh trng mong mun, giỳp cho vic lai to, chn ging cng nh to cỏc sinh vt chuyn gen nhanh v hiu qu cao Hin nay, nhiu ng vt v thc vt chuyn gen ó i, ỏp ng nhu cu cho ngi Cõy chuyn gen l cõy cú mang nhng gen c hiu m trc ú nú khụng cú, ngi ó a vo nú bng k thut di truyn Cỏc gen c chuyn thng liờn quan n cỏc tớnh trng nh chu hn, chu mn, chng c sõu bnh, 1.4.3- Trong cụng ngh thc phm Cụng ngh lờn men l mt lnh vc quan trng sn xut thc phm Vic tuyn chn cỏc chng vi sinh vt cú kh nng lờn men tt, em li hiu qu cao l rt cn thit Cỏc nghiờn cu s dng cụng ngh di truyn phc v cho cụng ngh lờn men ch yu i vo hai hng chớnh l: - Phõn tớch di truyn cỏc loi vi sinh vt s dng quỏ trỡnh lờn men, xỏc nh cỏc gen mó húa cho cỏc tớnh trng mong mun nhm to nng sut v cht lng sn phm lờn men - To cỏc vi sinh vt chuyn gen phc v cho cỏc qui trỡnh lờn men Vớ d sn xut ru, ngy ngi ta ó dựng cỏc chng vi sinh vt cú kh nng to ru cao v cho hng v tt Phn ln cỏc chng ú c nghiờn cu, tuyn chn, lai to bng cụng ngh di truyn sn xut ru vang, trc õy, ngi ta phi dựng hai loi vi sinh vt l S Cerevisiae to hm lng ru dch lờn men v sau ú, s Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -7- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn dng Leuconostos lờn men ph quỏ trỡnh tng tr, nhm nõng cao cht lng ca ru Ngy nay, ngi ta tin ti dựng mt chng vi sinh vt chuyn gen thc hin c hai quỏ trỡnh Cụng ngh di truyn úng vai trũ quan trng vic tuyn chn v to cỏc vi sinh vt cú hot tớnh enzyme cao, s dng cụng ngh thc phm i vi cỏc sn phm lờn men sa nh phomat v sa chua, trc kia, ngi ta thng s dng nhng vi sinh vt t nhiờn cú mt sa lờn men, vy, ngi ta khú lũng kim soỏt quỏ trỡnh lờn men v hiu qu khụng cao Ngy nay, vi cụng ngh di truyn, ngi ta ó to c cỏc chng mi vi cỏc tớnh cht xỏc nh v ó iu khin c quỏ trỡnh lờn men theo nh hng mong mun Trong nhng nm gn õy, bng cỏch s dng cụng ngh di truyn, ngi ta ó tuyn chn v to nhng chng vi sinh vt cú kh nng tng hp cỏc enzyme chu nhit, chu axit, chu kim tt sn xut enzyme Enzyme -amylase chu nhit ó v ang c s dng nhiu sn xut nha, ng glucose t tinh bt thi gian u, nhng nghiờn cu ca cụng ngh di truyn ch yu hng vo nhng sinh hc c bn thun tuý v cho n nhng nm gn õy, nhnh cụng ngh ny ó chuyn thnh mt nghnh cụng nghip tr giỏ nhiu t USD Bờn cnh nhng ng dng cc k to ln, cú li cho ngi, cng cn nhỡn nhn s quan tõm, lo lng chớnh ỏng v cỏc thc phm chuyn gen Tuy ngy nay, cỏc nh khoa hc ó cú th tng hp c cỏc gen nhõn to hay ghộp gen ny hay gen vo b mỏy di truyn ca mt sinh vt no ú, nhng chc chn, cũn rt nhiu v nhng n ca s sng, nht l cỏc sinh vt bc cao cha c khỏm phỏ Ngi ta cú th chng t s vụ hi ca cỏc loi thc phm t thc vt, ng vt hay vi sinh vt chuyn gen qua cỏc thớ nghim, nhng v lõu di, ngi ta cha th khng nh c s vụ hi ú, vỡ vy, khụng ớt ngi ó t lo lng s dng chỳng thng xuyờn vi mt s lng ln Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -8- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CHNG I BN CHT CA VT CHT DI TRUYN 1.1- AXIT NUCLEIC - VT CHT DI TRUYN CA MI SINH VT 1.1.1- Thnh phn cu to húa hc ca axit nucleic Axit nucleic c F Miescher phỏt hin nm 1869 Cú hai loi axit nucleic l axit deoxyribonucleic (DNA) v axit ribonucleic (RNA) Axit deoxyribonucleic (DNA) l polyme cú phõn t lng ln, cú mt tt c t bo sng DNA trung ch yu cỏc nhim sc th nhõn t bo, ngoi cũn cú mt s lng nh nm ty th v lc lp - l cỏc DNA ngoi nhõn S lng DNA l khụng thay i nhõn ca cỏc t bo cựng loi Axit ribonucleic cú mt c nhõn t bo v nguyờn sinh cht 1.1.1.1- Thnh phn nguyờn t Trong cu to ca axit nucleic cú nguyờn t húa hc l carbon (C), hydro (H), oxy (O), nit (N) v phospho (P) Trong ú, thnh phn nit thng chim khong t 8-10% v phospho l 15-16% 1.1.1.2- Thnh phn cu to húa hc Phõn t axit nucleic c cu to t thnh phn chớnh l cỏc baz nit, ng pentose v axit phosphoric Khi thu phõn hon ton axit nucleic bng enzyme hoc bng axit thỡ thu c ba thnh phn chớnh l baz nit, ng pentose v axit phosphoric Nu thu phõn tng bc bng cỏc enzyme thỡ u tiờn, enzym ribonuclease ct liờn kt phosphoester, gii phúng cỏc nucleotide - l n v cu to c bn ca phõn t axit nucleic Cỏc nucleotide s tip tc b thu phõn di tỏc dng ca cỏc enzyme nucleotidase v nucleosidase gii phúng axit phosphoric, ng pentose v baz nit (Hỡnh 1-1) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn -9- Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Axit nucleic (DNA RNA) - Deoxyribonulease - Ribonuclease Nucleotide Nucleotidase Axit phosphoric Đờng pentose - Deoxyribose - Ribose Nucleoside Nucleosidase Bazơ nitơ - Purine - Pyrimidine Hỡnh 1-1: S thu phõn tng bc ca axit nucleic 1,- Cỏc baz nit: Cú nhúm baz nit l purine v pyrimidine (Hỡnh 1-2): - Baz purine l hp cht nit d vũng Vũng purine c nh hoỏ hc c E Fischer gi ln u tiờn, ú, bao gm mt vũng pyrimidine v mt vũng imidazol ghộp li Cỏc baz cú nhõn purine l adenine (A) v guanine (G) Mi baz u cú dng ng phõn Mt dn xut quan trng ca baz adenine l hypoxanthine Hypoxanthine c to thnh nhúm NH2 ca adenine c thay bng nhúm OH Hypoxanthine cú ý ngha quan trng quỏ trỡnh trao i cht ca t bo sng - Baz pyrimidine l mt vũng cnh cú cha hai nguyờn t nit Cỏc baz cú nhõn pyrimidine l cytosine (C) v thymine (T) Trong iu kin sinh lý, guanine v thymine thng tn ti dng ceton ụi khi, baz cytosine cũn gp di dng 5-methyl cytosine, cũn adenine v cytosine thng tn ti di dng amin Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 10 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 7.2.6- Phng phỏp in di DNA 7.2.6.1- Nguyờn tc in di in di l k thut c s dng thớ nghim phõn phõn tớch cỏc i phõn t tớch in Trong phũng thớ nghim sinh hc phõn t ngi ta thng s dng phng phỏp in di tỏch ly, phỏt hin phõn t DNA nguyờn vn, DNA b ct hn ch v DNA ca sn phm PCR Axit nucleic núi chung l mt phõn t tớch in õm, vỡ vy, chỳng cú th dch chuyn qua bng gel t cc õm (cathode) sang cc dng (anode) di tỏc dng ca in trng Trờn cựng mt bn gel, cú cựng mt dũng in nhng phõn t DNA khỏc v trng lng nờn khỏc v in tớch v chy c nhng quóng ng khỏc sau mt thi gian nh Sau phõn tỏch bng in di, phỏt hin phõn t DNA, ngi ta dựng phng phỏp lm hin hỡnh i vi gel agarose, ngi ta nhum bng ethidium bromid Cht ny s gn xen cỏc baz ca phõn t DNA v phỏt quang di tia t ngoi Nh vy d dng cho phộp phỏt hin v trớ cỏc on DNA trờn gel v cú th phõn bit c phõn t DNA trờn cựng mt bng gel i vi gel polyacrylamid, cỏc phõn t thng c ỏnh du bng ng v phúng x v v trớ ca chỳng s c phỏt hin bng k thut phúng x t ghi Trong in di, ngi ta s dng thang DNA chun, thng l DNA Khi in di cho chy cựng vi mu nghiờn cu, qua ú cú th so sỏnh vi DNA mu vi DNA chun bit trng lng phõn t, hoc trớch li c DNA khỏc 7.2.6.2- Cỏch tin hnh H thng in di bao gm ngun in, bung in di, khuụn gel v h thng soi chp nh Cỏc bc c tin hnh nh sau: - Cõn khong 1g agarose cho vo 100ml m TBE (Tris-borate-EDTA) hoc TAE (Tris-acetate-EDTA) nhit phũng, khuy u v yờn phỳt, cho vo lũ viba (lm núng chy gel v khụng to bt) - Lm ngui gel xung 50ữ55C, thờm 1àl ethidium bromid, gel vo khuụn gel v lp lc - Khi gel ngui, t khuụn gel vo bung in di, thỏo lc v m chy vo khay gel cho m cao hn mt gel khong 2ữ5 mm Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 165 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Np DNA mu v DNA chun vo cỏc ging, y np v cm in cc - in di khong 30 phỳt vi in th 100ữ120V - Chp hỡnh nh gel di ỏnh sỏng UV xem kt qu Lu ý: Tựy thuc vo kớch thc ca DNA mu m ngi ta chn loi gel (agarose, polyacrlamid), nng gel, loi m (TBE hoc TAE) m TAE cho phõn gii cao cỏc phõn on ln hn kb, m TBE cú phõn gii cao t 0,1 n 3kb Ngoi ra, phõn gii cỏc phõn on DNA cũn ph thuc vo phng phỏp in di, ti u in th, ti u lng DNA np v m np Thuc nhum ethidium bromid (EtBr) l mt thuc nhum hunh quang m cú th nhn bit c hai loi DNA si n v si kộp Mc dự vy, ỏi lc liờn kt vi DNA si n tng i thp hn so vi DNA si kộp DNA nhum EtBr c nhn bit bng tia cc tớm Ti bc súng 254nm, ỏnh sỏng UV c hp th bi DNA v chuyn sang thuc nhum Ti bc súng 302nm v 366nm, ỏnh sỏng UV c hp th bi chớnh thuc nhum Trong c hai trng hp, nng lng c phỏt x ng vi tia ti bc súng 590nm vựng vng ca quang ph thy c EtBr l cht gõy t bin mnh, cn phi mang gng tay thao tỏc vi dung dch thuc nhum ny v cỏc gel nhum to phõn gii cao rừ nột, cỏc vch v nn nht nờn nhum gel vi EtBr sau in di 7.3- CC PHNG PHP LAI PHN T 7.3.1- Phng phỏp Southern blot Phng phỏp Southern blot c E Southern phỏt minh vo nm 1975, cho phộp nghiờn cu DNA ca b gen, kim tra kt qu chuyn gen hoc kim tra s cú mt ca mt gen no ú b gen ca t bo thc hin c quỏ trỡnh lai, u tiờn, ngi ta phi tỏch DNA b gen ca t bo S dng enzyme ct gii hn ct phõn t DNA thnh nhng on nh, in di trờn gel agarose tỏch nhng on cú kớch thc khỏc Gõy bin tớnh DNA trờn gel bng dung dch NaOH-0,5M, sau ú, chuyn DNA t gel sang mng lai (nitrocellulose) Trong quỏ trỡnh chuyn, v trớ ca DNA phi c gi nguyờn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 166 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn DNA c nh trờn mng c lai vi mu dũ cú ỏnh du phúng x, nhit 65C v thi gian lai khong 3ữ8 gi Sau quỏ trỡnh lai ngi ta mng lai loi b nhng mu dũ khụng bt cp chuyờn bit vi DNA c nh trờn mng lai 1: Dung dịch đệm 20X.SSC 2: Gía đỡ 3: Bấc giấy lọc 4: Gel agarose 5: Màng lai 6: Giấy thấm 7: Tấm kính 8: Vật nặng Hỡnh 7-4: K thut chuyn DNA t gel agarose lờn mng lai Cui cựng, ngi ta dựng k thut phúng x t ghi nh v cỏc phõn t lai Trong k thut ny, ngi ta t mt phim nhy cm vi tia x ỏp sỏt vo mng lai Cỏc phõn t lai cú ỏnh du phúng x s tỏc ng lờn phim v kt qu c th hin qua cỏc chm en trờn phim (Hỡnh 7-4) Cỏc ng dng quan trng ca Sourthern blot: - Lp bn gii hn ca mt gen - Phỏt hin cỏc a dng trỡnh t ca cựng mt gen cỏc chng hay cỏc cỏ th khỏc qua s so sỏnh bn gii hn ca chỳng - Phỏt hin cỏc t bin mt on, t bin im hay tỏi t hp trờn mt gen vỡ chỳng lm thay i bn gii hn 7.3.2- Phng phỏp Northern blot Phng phỏp lai Northern blot l phng phỏp lai RNA ca t bo vi mu dũ DNA Phng phỏp ny c s dng xỏc nh kớch thc v hm lng ca mt mRNA c trng mt hn hp RNA V nguyờn tc ging nh lai Southern blot, c tin hnh nh sau: Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 167 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn RNA (ó c lm bin tớnh) s c phõn tớch theo kớch thc nh in di trờn gel agarose cú cha cht lm bin tớnh Cỏc cht lm bin tớnh cú tỏc dng ngn cn s hỡnh thnh cu trỳc bc hai ca RNA sau ó bin tớnh V ú, khụng cn tr s di chuyn cng nh s tỏch ca cỏc RNA trờn gel Sau ú, RNA c chuyn lờn mng lai Nhng RNA c nh trờn mng lai c em lai vi mu dũ DNA cú ỏnh du phúng x to phõn t lai RNA-DNA Cỏc phõn t lai c phỏt hin nh k thut phúng x t ghi 7.3.3- Lai ti ch Lai ti ch l phng phỏp lai phõn t, ú, trỡnh t axit nucleic cn tỡm nm t bo hay mụ Lai ti ch cho phộp nghiờn cu axit nucleic m khụng cn qua giai on tỏch chit chỳng mụ, t bo Cỏc ng dng ca kiu lai ny rt a dng i t k thut nh v gen trờn nhim sc th, phỏt hin dũng vi khun tỏi t hp phng phỏp to dũng n vic nghiờn cu mt mRNA chuyờn bit t bo v mụ Phng phỏp ny ớt tn kộm hn l lai Southern blot, mu dũ c ỏnh du bng hunh quang thay cho mu dũ ỏnh du phúng x Tựy tng loi t bo v mụ cú th thc hin cỏc phng phỏp lai ti ch khỏc 7.3.3.1- Lai trờn khun lc Phng phỏp ny c s dng phỏt hin dũng vi khun cú mang vector tỏi t hp cn tỡm mt ngõn hng gen Ngõn hng gen c tri trờn mt thch ca hp petri Sau cỏc khun lc t kớch thc nht nh, ngi ta thu ly du n ca chỳng bng cỏch ỏp mt mng lai trờn mt thch Mi khun lc s li vi t bo vi khun trờn mng lai Sau ú x lớ mng lai bng NaOH lm v t bo vi khun v lm bin tớnh DNA Kt qu phúng x t ghi ca du n cho phộp xỏc nh dũng vi khun cn tỡm trờn hp pectri ban u Dũng ny s c thu nhn v phõn tớch 7.3.3.2- Lai trờn nhim sc th Phng phỏp ny cung cp thụng tin chớnh xỏc v v trớ v s phõn b ca mt trỡnh t DNA cn tỡm trờn nhim sc th nh mt mu dũ chuyờn bit Chn t bo kỡ gia ca quỏ trỡnh phõn bo cỏc nhim sc th cú kớch thc ln nht (cỏc nhim sc th ny thng cú ngun gc t bch cu) Bng cỏc k thut x lớ c nh t bo trờn lam kớnh, nh v hỡnh dng v v trớ ca nhim sc th S dng enzyme RNase v enzyme protease K loi Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 168 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn b RNA v protein Nhim sc th c nh trờn lam c em lai vi mu dũ DNA hoc RNA cú ỏnh du phúng x S dng k thut phúng x t ghi phỏt hin phõn t lai (phõn t lai trờn lam c ph mt huyn dch nhy cm vi tia x) Sau mt thi gian, cho tia x tỏc ng lờn huyn dch, lam c em quan sỏt di kớnh hin vi Ti cỏc im cú cỏc phõn t lai xut hin cỏc chm en trờn lp huyn dch 7.3.3.3- Lai trờn t bo v mụ Lai trờn t bo v mụ thng c s dng phỏt hin cỏc mRNA Cỏc loi mRNA hot ng cỏc giai on khỏc quỏ trỡnh phỏt trin t bo v c th Lai trờn t bo v mụ nhm nghiờn cu giai on hot ng ca mRNA, t ú, tỡm hiu hot ng ca mt gen, mi liờn quan gia phiờn mó v gii mó, nh v cỏc gen cn nghiờn cu trờn nhim sc th Mụ hoc t bo c x lớ bng phng phỏp mụ, t bo hc nh: c nh, kh nc, tm paraffin, ct thnh nhng lỏt mng (7ữ10àm) tri trờn lam X lớ vi enzyme protease loi b protein, sau ú x lớ vi enzyme DNase loi b DNA Lai vi mu dũ cú ỏnh du phúng x hoc hunh quang Sau ú ph mt lp huyn dch nhy vi phúng x hoc hunh quang mt thi gian thớch hp cho phn ng xy ra, quan sỏt kt qu lai di kớnh hin vi Trong t bo nhng v trớ cú phõn t lai c phỏt hin bng cỏc chm en Phm vi s dng ca phng phỏp: - i tng nghiờn cu cú t chc phc bao gm nhiu hp cỏc t bo khỏc nh b nóo - Cỏc phng phỏp dch t bo cho phộp phỏt hin mt protein chuyờn bit thụng qua khỏng th c trng ca nú Khi phi hp nhng phng phỏp dch t bo v lai ti ch, ngi ta s phỏt hin ng thi mRNA v protein ca nú, t ú, xỏc nh c mi tng quan gia hot ng phiờn mó v dch mó ca mt gen - Bng cỏch lai nhiu lỏt ct liờn tc (cú cu trỳc gn nh ng nht) vi nhiu mu dũ khỏc nhau, ngi ta cú th xỏc nh v trớ, s phõn b v tng tỏc gia cỏc mRNA cựng tham gia vo mt quỏ trỡnh sng Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 169 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 7.4- PHNG PHP GII TRèNH T CA AXIT NUCLEIC Khi nghiờn cu v gen, vic xỏc nh c v trớ ca gen trờn nhim sc th cha cho phộp kt lun v bn cht ca nú nh gen ú tng ng vi gen gỡ, chc nng iu hũa hay mó húa cho protein no Nh vic gii trỡnh t gen m ngi ta ó gii quyt c nhng khú khn trờn Cú hai phng phỏp gii trỡnh gen ú l phng phỏp húa hc ca Maxam-Gilbert v phng phỏp enzyme ca Sanger v cng s 7.4.1- Phng phỏp húa hc ca Maxam-Gilbert Vo nm 1977, Maxam v Gilbert ln u tiờn phỏt minh phng phỏp gii trỡnh t gen bng phng phỏp húa hc Nguyờn tc ca phng phỏp l da trờn phn ng húa hc thy gii c hiu, cỏc DNA khụng t xon li vi nhau, to thnh hp nhiu phõn on cú kớch thc khỏc 32 Trc ht, phõn t DNA c ỏnh du ng v phúng x P u ca mch n, to nhng on ỏnh du cú th phỏt hin bng hỡnh phúng x X lớ húa hc c hiu phõn hy c trng mt loi nucleotide ca mch DNA ó ỏnh du phúng x, to cỏc on oligonucleotide cú chiu di hn kộm nucleotide c phỏt hin bng in di Kt qa cỏc phn ng húa hc x lớ mch DNA c phỏt hin bng in di trờn gel polyacriamid cú th xỏc nh c trỡnh t mch n Mch n ó ỏnh du phúng x cú th x lớ theo nhúm phn ng: - Nhúm phn ng th nht x lớ mch n DNA bng dimethyl sulphat lm t mch ti G - Nhúm phn ng th hai x lớ mch n DNA bng axit (pH=2) gõy t mch n ti A hoc G - Nhúm phn ng th ba x lớ mch n DNA bng hydrazin gõy t mch n ti T v C - Nhúm phn ng th x lớ mch n DNA bng hydrazin vi nng mui cao lm t mch n ti C Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 170 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Kt qu: Cỏc phn ng to thnh cỏc on DNA ct ngu nhiờn, cú kớch thc khỏc in di trờn gel polyacriamid (Hỡnh 7-5), c kt qu in di bng mỏy phúng x t ghi ta thu c trỡnh t nucleotide ca mch n DNA G G+A T+C - C ACACTG ACACT ACAC ACA AC A + Hỡnh 7-5: S gii trỡnh gel theo phng phỏp hoỏ hc 32 Vớ d, on mch n DNA ỏnh du phúng x P , u 5` 32 nucleotide A cú trỡnh t : 5`P ACACTG Sau x lớ bng phng phỏp húa hc v ct mch n núi trờn ta thu c cỏc phõn on sau: - Kt qu nhúm ct ti G: 32 P ACACT 32 P ACACTG - Kt qu phn ng nhúm ct ti A hoc G: 32 P AC 32 P ACACTG 32 P ACACT 32 P ACACTG - Kt qu phn ng nhúm ct ti C hoc T: 32 P A 32 P ACA 32 P ACACTG 32 P ACAC 32 P ACACTG Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 171 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Kt qu phn ng nhúm ct ti C: 32 P A 32 P ACA 32 P ACACTG Tng hp cỏc kt qu, ta thu c trỡnh t cỏc nucleotide trờn mch n DNA, t ú ta bit c trỡnh t sp xp cỏc nucleotide ca gen 7.4.2- Phng phỏp enzyme s dng cỏc dideoxynucleotide Phng phỏp ny c F Sanger v cng s phỏt minh vo nm 1977 Nguyờn tc ca phng phỏp dideoxy l da vo s tng hp mch b sung cho trỡnh t cn xỏc nh nh hot ng ca enzyme DNA-polymerase Vi vic s dng thờm cỏc dideoxynucleotide (ddNTP) vi cỏc deoxynucleotide (dNTP) thụng thng, kt qu tng hp cng l s hỡnh thnh mt hp nhiu on DNA cú kớch thc khỏc Trong phn ng s dng on DNA mi mch n khong 20 nucleotide, bn loi dNTP (trong ú cú mt loi ỏnh du bng ng v phúng x) v b xung thờm 1% ddATP (hoc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mi loi phn ng Cỏc ddNTP mt hai nguyờn t oxy C3 v C2 mch n DNA ang tng hp c gn ddNTP phn ng ngng tng hp Mi loi phn ng c thc hin riờng r, cú DNA khuụn, DNA mi, y cỏc loi dNTP, enzyme Taq DNApolymerase, dung dch m v cú thờm khong 1% mt loi ddNTP Kt qu phn ng tng hp nờn cỏc on oligonucleotide di ngn khỏc mt nucleotide v c nhn bit nh phng phỏp in di (Hỡnh 7-6) Tng hp kờt qu phn ng ng, thu c trỡnh t cỏc nucleotide ca mch n, cú th bit c trỡnh t sp xp cỏc nucleotide gen - TGAGGTC TGAGGT TGAGG TGAG TGA TG + T Hỡnh 7-6: S gii trỡnh gen theo phng phỏp Sanger Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 172 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Vớ d: Gii trỡnh on gen: - Mch cn tng hp l 5`- AGTCCAG-3` 3`- TCAGGTC-5` - Kt qu phn ng theo loi A: TCAdd TCAGGTC - Kt qu phn ng loi G: TCAGdd TCAGGdd TCAGGTC - Kt qu phn ng loi C: TCdd TCAGGTCdd TCAGGTC - Kt qu phn ng loi T: Tdd TCAGGTdd TCAGGTC 7.4.3- Phng phỏp xỏc nh trỡnh t nucleotide bng mỏy t ng Trong k thut ny, ngi ta khụng ỏnh du bng cỏc ng v phúng x m bng húa cht (cỏc fluochrome) Mi loi ddNTP c ỏnh du bng mt fluochrome cú mu khỏc Nh vy, tt c cỏc oligonucleotide cựng chm dt ti mt loi ddNTP s cú cựng mt mu Sau in di trờn gel polyacriamid, kt qu s c x lớ qua mt h thng vi tớnh Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 173 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn TI LIU THAM KHO 1- ỏi Duy Ban (19980, Cụng ngh ADN iu tr gen cỏc bnh him nghốo, Nxb Y hc, H Ni 2- Bựi Chớ Bu, Nguyn Th Lang (1999), Di truyn phõn t - Nhng nguyờn tc c bn chn ging cõy trng, Nxb Nụng nghip, H ni 3- Nguyn Hu Chn ch biờn (1999), Nhng hoỏ sinh hc hin i, Nxb KH&KT, H Ni 4- Phm Th Trõn Chõu, Trn Th ng (1997), Hoỏ sinh hc, Nxb Giỏo Dc, H Ni 5- Nguyn Lõn Dng ch biờn, Nguyn ỡnh Quyn, Phm Vn Ty (1997), Vi sinh vt hc, Nxb Giỏo dc, H Ni 6- H Hunh Thu Dng (1998), Sinh hc phõn t, Nxb Giỏo dc, H ni 7- Nguyn Nh Hin (2002), Di truyn v cụng ngh t bo soma, Nxb KH&KT, H Ni 8- ỡnh Ho ch biờn (1996), Giỏo trỡnh hoỏ sinh, i hc Y Dc, TP HCM 9- Phm Thanh H (2000), Di truyn hc, Nxb Giỏo dc, H Ni 10- Nguyn ỡnh Huyờn (1998), Sinh hc phõn t ADN, Nxb KH&KT, H Ni 11- Vừ Th Thng Lan (2002), Sinh hc phõn t, Nxb i hc Quc gia, H Ni 12- Nguyn Th Lang (2002), Phng phỏp c bn nghiờn cu cụng ngh sinh hc, Nxb Nụng nghip-Chi nhỏnh TP H Chớ Minh 13- Lờ ỡnh Lng, Phan C Nhõn (1993), Di truyn hc, Nxb KH&KT, H Ni 14- Phan C Nhõn (1992), Mt s v di truyn hc (hin i), Nxb Giỏo dc v o to, H Ni 15- Phan C Nhõn (1998), Sinh hc i cng, Nxb i hc Quc gia, H ni Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 174 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 16- Khut Hu Thanh (2003), C s di truyn hc phõn t v k thut gen, Nxb KH&KT, H Ni 17- Nguyn c Thnh (2000), Nuụi cy mụ t bo thc vt - Nghiờn cu v ng dng, Nxb Nụng nghip, H Ni 18- Lờ Ngc Tỳ (1997), Hoỏ sinh cụng nghip, Nxb KH&KT, H Ni 19- Lờ Ngc Tỳ, Ngc Liờn, ng Th Thu (2002), T bo v cỏc quỏ trỡnh sinh hc, Nxb KH&KT, H ni 20- Nguyn Vn Uyn ch biờn, Nguyn Tin Thng (2000), Nhng kin thc c bn v cụng ngh sinh hc, Nxb Giỏo dc, H Ni 21- C.Vili v Dethio (1979), Cỏc nguyờn lý v cỏc quỏ trỡnh sinh hc, Nxb KH&KT, H Ni 22- Emil L Smith (1983), Principles of Biochemistry, Mc Graw-Hill Book Company (7th Edition), New Dehi 23- Emil L Smith, Robert L Hill (1983), Principles of biochemistry -General aspects, McGraw-Hill Book Company, New Dehi 24- Hartl Daniel L., Freifelder David, Snyder Leon A (1988), Basic genetics, Johnes and Bartlett Publishers Inc., USA 25- Rastogi S C (1996), Biochemistry, Tata McGraw-Hill Publishing Co.Ltd, New Dehi 26- Renộ Scriban coordonnateur (1982), Biotechnologie, Technique et documentation lavoisier, Paris 27- The national medical series for indepenent study (1996), Genetics, William & Wilkins, USA 28- Watson James D., Hopkins Nancy H., Roberts Jeffrey W., Steiz Joan Argetsinger, Weiner Alan M (1987), Molecular biology of the gene, The Benjamin/Cummings Publishing Co Inc., USA 29- William M Fogarty (1983), Microbial enzymes and biotechnology, Applied Science Publishes Ltd, London & New York Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 175 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MC LC Phn I- C s di truyn M u- Lc s phỏt trin ca di truyn hc v k thut di truyn 1.1- Lnh vc nghiờn cu ca di truyn hc v cụng ngh di truyn 1.2- Giai on di truyn sau Mendel 1.3- S i ca cụng ngh di truyn 1.4- í ngha khoa hc v thc tin ca cụng ngh di truyn 1.4.1- Trong y dc 1.4.2- Trong nụng nghip 1.4.3- Trong cụng ngh thc phm Chng I - Bn cht ca vt cht di truyn 1.1- Axit nucleic - Vt cht di truyn ca mi sinh vt 1.1.1- Thnh phn cu to hoỏ hc ca axit nucleic 1.1.2- Cu trỳc phõn t DNA 1.1.3- Tớnh cht ca DNA 1.1.4- Cỏc thớ nghim chng minh DNA l vt cht di truyn 1.2- Cỏc RNA 1.2.1- Cu to húa hc v c im chung ca RNA 1.2.2- Cỏc loi RNA 1.3- Mó di truyn 1.3.1- Khỏi nim v mó di truyn 1.3.2- c tớnh ca mó di truyn 1.4- Vt cht di truyn ca mt s nhúm sinh vt 1.4.1- Vt cht di truyn ca virus 1.4.2- Vt cht di truyn ca vi khun 1.4.3- Vt cht di truyn ca eucaryote Chng II - Hot ng v s biu hin ca gen 2.1- Gen l n v chc nng ca b mỏy di truyn 2.1.1- Cỏc quan nim v gen 2.1.2- Cu trỳc ca gen 2.2- S mó 2.2.1- Lý thuyt v mó DNA theo khuụn 2.2.2- Quỏ trỡnh mó 2.2.3- Sao mó DNA si kộp dng vũng ca t bo procaryote 2.2.4- Sao chộp mó t bo eucaryote 2.2.5- Sa sai DNA t bo 2.3- S phiờn mó 2.3.1- c im chung ca quỏ trỡnh phiờn mó 2.3.2- Phiờn mó tng hp mRNA procaryote 2.3.3- Phiờn mó tng hp mRNA eucaryote 2.3.4- Phiờn mó tng hp tRNA Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 176 - 14 20 21 25 26 31 32 33 34 38 38 39 41 44 48 50 53 55 56 61 65 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 2.3.5- Phiờn mó tng hp rRNA 2.4- Dch mó 2.4.1- c im chung ca quỏ trỡnh dch mó 2.4.2- S hot hoỏ v chuyn axit amin 2.4.3- Hng c mó v hng kộo di si polypeptide 2.4.4- Cỏc giai on ca quỏ trỡnh dch mó 2.4.5- Polyribosome 2.5- iu ho biu hin gen (iu ho sinh tng hp protein) 2.5.1- Mc ớch ca iu ho biu hin gen 2.5.2- Cỏc yu t iu ho biu hin gen 2.5.3- Mụ hỡnh iu ho biu hin gen vi khun 2.5.4- Mụ hỡnh iu ho biu hin gen eucaryote 2.5.5- S bit húa t bo Chng III - Bin i vt cht di truyn 3.1- Khỏi nim v bin d 3.2- t bin 3.2.1- Tỏc nhõn gõy t bin 3.2.2- t bin gen 3.2.3- t bin nhim sc th 3.3- Tỏi t hp Phn II- Nhng nguyờn lý c bn ca cụng ngh di truyn Chng IV- Cỏc enzyme s dng cụng ngh di truyn 4.1- Cỏc enzyme gii hn 4.1.1- Hin tng gii hn v h thng hn ch - ci biờn 4.1.2- Cỏch gi tờn ca enzyme gii hn 4.1.3- Cỏc loi enzyme gii hn 4.1.4 - Cỏc loi RE nhúm II 4.1.5- ng dng ca RE cụng ngh di truyn 4.2- Cỏc loi nuclease 4.2.1- Phõn loi 4.2.2- Mt s nuclease thng dựng v ng dng ca nú 4.3- Enzyme kt ni 4.3.1- Ligase 4.3.2- Cỏc enzyme dephosphoryl hoỏ 4.3.3- Cỏc enzyme phosphoryl hoỏ 4.4- Cỏc enzyme tng hp 4.4.1- Enzyme chộp DNA 4.4.2- Enzyme phiờn mó ngc 4.4.3- Cỏc enzyme tng hp RNA (RNA-polymerase) 4.4.4- Enzyme terminal-transferase Chng V - Vector chuyn gen 5.1- Khỏi nim v vector 5.1.1- S chuyn gen Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 177 - 66 67 68 70 74 75 76 80 82 84 86 88 92 94 96 98 99 100 104 105 106 108 109 110 111 112 113 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 5.1.2- Vector 5.2- Nhng yờu cu ti thiu ca mt vector chuyn gen 5.3- Mt s ng dng ca vector chuyn gen 5.4- Cỏc vt ch thu nhn cỏc vector chuyn gen 5.5- Cỏc loi vector chuyn gen 5.5.1- Vector chuyn gen l plasmid 5.5.2- Cỏc vector chuyn gen l phage 5.5.3- Cỏc vector chuyn gen khỏc 5.5.4- Cỏc vector l virus ca eukaryote Chng VI - Cụng ngh DNA tỏi t hp v s tỏch dũng 6.1- Cụng ngh DNA tỏi t hp 6.1.1- DNA tỏi t hp 6.1.2- Cỏc cụng on chớnh to DNA tỏi t hp 6.1.3- Cỏc phng phỏp to DNA tỏi t hp 6.2- Mt s phng phỏp a DNA tỏi t hp vo t bo ch 6.2.1- Húa bin np 6.2.2- in bin np 6.2.3- Bin np t bo trn 6.2.4- Phng phỏp bn gen 6.2.5- Phng phỏp vi tiờm 6.2.6- Ti np 6.3- K thut tỏch dũng (to dũng) 6.3.1- Mc ớch ca s tỏch dũng 6.3.2- Cỏc bc c bn ca phng phỏp tỏch dũng 6.3.3- Mt s phng phỏp xỏc nh dũng cn tỡm 6.4- Ngõn hng gen 6.5- Ngõn hng cDNA 6.5.1- Thit k ngõn hng cDNA 6.5.2- Sng lc ngõn hng cDNA Chng VII - Mt s phng phỏp nghiờn cu cụng ngh di truyn 7.1- Cỏc phng phỏp tỏch chit axit nucleic 7.1.1- Phng phỏp tỏch chit DNA vi khun 7.1.2- Phng phỏp tỏch DNA plasmid 7.1.3- Tỏch DNA ca t bo khỏc 7.1.4- Phng phỏp tỏch ARN tng s v mRNA 7.1.5- Tỏch v thu nhn gen 7.2- Phng phỏp nhõn bn (PCR) 7.2.1- Nguyờn tc ca phng phỏp PCR 7.2.2- Cỏc bc tin hnh thớ nghim 7.2.3- Cỏc yu t nh hng n phn ng PCR 7.2.4- ng dng ca phng phỏp PCR 7.2.5- Nguyờn lý c bn ca phn ng RT-PCR (PCR ngc) 7.2.6- Phng phỏp in di DNA Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 178 - 114 115 116 121 125 128 129 132 135 140 141 142 143 145 148 149 150 151 152 153 154 156 157 158 161 163 164 165 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 7.3- Cỏc phng phỏp lai phõn t 7.3.1- Phng phỏp Southern blot 7.3.2- Phng phỏp Northern blot 7.3.3- Lai ti ch 7.4- Phng phỏp gii trỡnh t ca axit nucleic 7.4.1- Phng phỏp húa hc ca Maxam-Gilbert 7.4.2- Phng phỏp enzyme s dng cỏc dideoxynucleotide 7.4.3- Phng phỏp xỏc nh trỡnh t nucleotide bng mỏy t ng Ti liu tham kho Mc lc Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 179 - 166 167 168 170 172 173 174 176 [...]... gia gc phosphat vi carbon th 3 ca nucleotide ny v carbon th 5 ca nucleotide nm k nú (Hỡnh 1-5) Phõn t DNA bao gm hai si polynucleotide ngc chiu nhau, baz purine ca si polynucleotide ny nm i din vi baz pyrimidine ca si polynucleotide kia theo quy lut b sung nghiờm ngt: adenine ng i din vi thymine (AT) v guanine ng i din vi cytosine (G-C) Hai si polynucleotide c gi vng v n nh nh cỏc liờn kt hydro gia... Liờn kt glycoside gia baz nit v ng pentose Khi mt baz nit liờn kt vi phõn t ng pentose bng liờn kt ,N-glycoside s to thnh mt nucleoside Liờn kt ,N-glycoside ny hỡnh thnh gia nguyờn t carbon th nht (C1) ca ng pentose vi nguyờn t th 9 (N9) ca baz purine hoc vi nguyờn t th nht (N1) ca baz pyrimidine - Nucleoside ca baz pyrimidine vi ng ribose mang tờn ca baz v cú u i l -idine (thymidine, uridine, cytidine)... dimethylguanine, inosine, Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 26 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 5' G G G C G G D C G A U G G D A I D T 1 mG m22G 1 mI Inosine Dihydrouridine Ribothymidine Methylguanosine Dimethylguanosine Methylinosine U U m1G Alanine A C C A C C U G C C G U A G G C C C G C G G C G C m22 G C U C C C U C C G G C D G A G A Các bazơ ngo i lai G Pseudouridine Y G CCG Codon G I. .. Crick, mụ hỡnh cu to khụng gian ca DNA cú nhng c im chớnh sau: - Phõn DNA gm hai si polynucleotide sp xp theo hai hng ngc chiu nhau (i song song): si bờn ny cú u 3'OH thỡ si bờn kia s l 5'P - Hai si cựng xon (xon i) xung quanh mt trc chung - Cỏc baz nit ca hai si nm quay vo trong Baz ca si ny ng i din vi baz ca si kia theo quy lut b sung A i din T v G i din C A ni vi T bng hai liờn kt hydro, G ni vi... cytosine (AC), tng t nh vy, baz guanine cng cú th to liờn kt vi cytosine (GC) v thymine (GT) Trong iu kin sinh lý ca t bo, ngi ta thy, baz adenine v cytosine thng nm di dng amino, ngha l, nguyờn t nit gn vi vũng purine v pyrimidine luụn cú hai nguyờn t nit (NH2), rt ớt khi gp dng imin (NH) Tng t nh vy, baz guanine v thymine, nguyờn t oxy gn carbon th 6 ca vũng purine v pyrimidine luụn nm di dng... nhit t t, cng vi iu kin thớch hp thỡ hai mch s bt cp tr li - hin tng ny gi l s hi tớnh Nu ta gim nhit mt cỏch t ngt thỡ s bt cp tr li s khụng din ra Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 20 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Cỏc nucleotide trong DNA hp th tia cc tớm vi di bc súng ti a l 260nm Do vy, kh nng hp th tia cc tớm ca hai si n s ln hn mt si kộp DNA b thy phõn di tỏc dng ca cỏc... 1-1: Tờn gi v ch vit tt ca mt s nucleotide Tờn gi Ký hiu Adenozine 5-monophosphat (axit adenylic) AMP Guanosine 5-monophosphat (axit guanylic) GMP Cytidine 5-monophosphat (axit cytidytic) CMP Uridine 5-monophosphat (axit thymidylic) UMP Deoxyadenosine 5-monophosphat (axit deoxyadenylic) dAMP Deoxyguanosine 5-monophosphat (axit deoxyadenylic) dGMP Deoxycytidine 5-monophosphat (axit deoxycytidylic) dCMP... cỏch cc i Mi nhim sc th cú mt im tht eo gi l tõm ng (centromere) Tõm ng chia nhim sc th lm hai phn vi chiu di khỏc nhau Da vo v trớ tõm ng cú th phõn bit ba kiu hỡnh th i ca nhim sc th: - Nhim sc th cõn tõm: Tõm ng nm gia nhim sc th Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 30 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Nhim sc th lch tõm: Tõm ng chia nhim sc th lm hai phn khụng u nhau, mt bờn di v... uridine, cytidine) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 12 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - Nucleoside ca baz purin vi ng ribose mang tờn ca baz v cú u i l -osine (adenosine, guanosine) - Khi baz nit liờn kt vi ng deoxyribose thỡ cú thờm tip u ng deoxy- (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytisine) Riờng baz thymine ch cú mt trong DNA nờn gc ng trong nucleoside luụn l deoxyribose, trong... phage T2 l DNA Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn - 24 - Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.2- CC RNA 1.2.1- Cu to húa hc v c im chung ca RNA Axit ribonucleic (RNA) cng l mt axit nucleic Hai c im c bn v cu to, phõn bit gia axit ribonucleic v axit deoxyribonucleic l cu t ng v baz nit Trong phõn t RNA cú cha ng ribose, cũn trong DNA cú cha ng deoxyribose Thnh phn cỏc baz pyrimidine trong RNA ... anticodon H C H Ribose N Inosine-Cytosine Anticodon H N N C C H O N C N C H Codon Anticodon U CU AGA U CU Anticodon Sợi mRNA Codon Codon AGA Codon Bazơ U anticodon liên kết với bazơ A G codon... codon CC I G GU Codon Sợi mRNA CC I CC I Anticodon G GC Codon GGA Codon Bazơ I anticodon liên kết với bazơ U, C A codon Hỡnh 1-13: S hỡnh thnh liờn kt hydro gia nucleotide th codon vi baz ngoi... U LC S PHT TRIN CA DI TRUYN HC V K THUT DI TRUYN 1.1- LNH VC NGHIấN CU CA DI TRUYN V CễNG NGH DI TRUYN Thut ng di truyn (geneties) xut phỏt t gc latinh l gentikos (ngun gc) Di truyn hc l mt b