Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn MỞ ĐẦU Vấn đề sâu hại khó khăn lớn sản xuất nông nghiệp Tổn thất sâu gây nghiêm trọng, hàng năm gây thiệt hại 29,7 tỷ USD, khoảng 13,8% mùa màng - cao so với loài dịch hại khác Để phòng trừ sâu hại, biện pháp truyền thống canh tác, hóa học, giới, vật lý , sử dụng giống kháng sâu biện pháp hiệu Trước đây, muốn tạo giống có đặc tính này, người ta phải lai tạo thời gian dài Tuy nhiên, công nghệ gen đời giải nhược điểm Nhiều giống trồng chuyển gen có khả kháng sâu như: bông, ngô, lúa, đậu tương có mặt thị trường nhờ phương pháp chuyển gen khẳng định ưu vượt trội Trên giới, nước Âu - Mỹ nghiên cứu thành công thành tựu ứng dụng đại trà để phục vụ cho sản xuất nông nghiệp, nhằm mang lại hiệu kinh tế, giảm chi phí cho người sản xuất tạo sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng bảo vệ môi trường Đầu tiên, Bỉ nghiên cứu thành công thuốc chuyển gen kháng sâu vào năm 1985 Từ năm 1995 đến năm 1996, Mỹ nghiên cứu ứng dụng đại trà loại trồng chuyển gen kháng sâu như: bắp, khoai tây, vải Còn châu Á, có nhiều quốc gia đạt thành tựu đáng kể Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan… Đặc biệt, Philippine nước đầu nghiên cứu sử dụng trồng chuyển đổi gen kháng sâu bắp, đậu tương, vải, cải dầu , bắp đứng thứ hai sau lúa Riêng Việt Nam, viện, trường, Trung tâm Công nghệ sinh học bước đầu nghiên cứu khảo nghiệm sử dụng giống trồng có gen kháng số loài sâu hại rau màu việc chuyển gen kháng sâu xanh da láng, sâu đục trái đậu tương Hiện nay, giới có 150 triệu trồng loại chuyển gen, dấu hiệu đáng mừng cho nhà sản xuất nông nghiệp toàn giới Tài liệu chia sẻ tại:1 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn CHƯƠNG ĐẠI CƯƠNG VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 1.1 Định nghĩa khái niệm • • • • Chuyển gen (transgenesis) đưa đoạn DNA ngoại lai vào genome thể đa bào, sau đoạn DNA ngoại lai có mặt hầu hết tế bào truyền lại cho hệ sau Khái niệm sử dụng cho thực vật động vật Nấm men, vi khuẩn tế bào nuôi cấy mang đoạn DNA ngoại lai gọi tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) tế bào biến nạp (transformed cell) Quá trình biến nạp (transformation) trình đưa DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) sinh vật Gen chuyển (transgene) gen ngoại lai chuyển từ thể sang thể kỹ thuật di truyền Gen chuyển phân lập từ loài thực vật có quan hệ họ hàng từ loài khác biệt hoàn toàn Cây trồng chuyển gen (transgenic crops) hay gọi trồng biến đổi gen (genetically modified crops) thực vật mang nhiều gen đưa vào nhân tạo thay thông qua lai tạo Nói cách khác, thực vật chuyển gen thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome Gen ngoại lai phải truyền lại cho tất tế bào, kể tế bào sinh sản mầm 1.2 Mục đích chuyển gen Tài liệu chia sẻ tại:2 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 1.1 Tỷ lệ phân bố mục tiêu công nghệ gen thực trồng Mỹ (thống kê năm 2004) Nói chung, mục đích chuyển gen thêm thông tin di truyền ngoại lai vào genome, để ức chế gen nội sinh Trong số trường hợp, thay gen hoạt động chức gen hoạt động chức khác cần thiết Gen ngoại lai thể đột biến gen nội sinh gen hoàn toàn khác Sự thêm gen thực để cung cấp sinh vật mang protein Sự thêm gen sử dụng để nghiên cứu chế hoạt động promoter toàn thể Sự kết hợp gen reporter với promoter nguyên tắc chung phương pháp Sự thay gen sử dụng chủ yếu để làm bất hoạt gen biết Trên thực tế, bao gồm thay gen nội sinh thể đột biến bất hoạt Phương pháp dùng thông tin chức sinh học gen trường hợp thêm gen Thực thêm gen bất hoạt gen gây biến đổi sinh vật chuyển gen, mà biến đổi quan sát đánh giá Các thể đột biến gen thay cung cấp thông tin cách thức tinh vi Sự thay gen gen có chức khác hoàn toàn khó thực để đưa marker gen chọn lọc vào genome Vị trí hợp vào genome chọn lọc khả chứa để biểu gen ngoại lai cách chắn [4] 1.3 Nguyên tắc việc chuyển gen 1.3.1 Một số nguyên tắc sinh học Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Không phải toàn tế bào thể tính toàn (totipotency) Tài liệu chia sẻ tại:3 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Các khác có phản ứng không giống với xâm nhập gen ngoại lai - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hoàn toàn khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập DNA ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các DNA (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, DNA virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) [2] 1.3.2 Phản ứng tế bào với trình chuyển gen Mục đích chuyển gen đưa đoạn DNA ngoại lai vào genome tế bào vật chủ có khả tái sinh biểu ổn định tính Tài liệu chia sẻ tại:4 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn trạng Nếu trình biến nạp xảy mà tế bào không tái sinh thành cây, tái sinh diễn mà không kèm theo biến nạp thí nghiệm biến nạp chưa thành công Ở nhiều loài thực vật, điều khó khăn phải xác định cho kiểu tế bào có khả tiếp nhận biến nạp Hạt phấn hay tế bào noãn sau biến nạp dùng để tạo biến nạp hoàn toàn, thông qua trình thụ tinh bình thường Hạt phấn thường coi nguyên liệu lý tưởng để gây biến nạp Trong đó, việc biến nạp gen vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn Trong trường hợp này, người ta thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi Việc biến nạp gen tế bào đơn mô phức tạp phôi hay mô phân sinh thường cho khảm Từ nhiều thập kỷ qua người ta biết rằng, tính toàn thể tế bào thực vật tạo điều kiện cho tái sinh hoàn chỉnh in vitro qua trình phát sinh quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi Các chồi bất định hay phôi hình thành từ tế bào đơn hoạt hóa phận dễ dàng tiếp nhận biến nạp có khả cho biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm) [2] 1.3.3 Các bước chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen thực vật chuyển đoạn DNA lạ, thường gene có chức mã hoá cho thông tin hay đặc điểm có lợi định vào tế bào thực vật khả kháng sâu hại, kháng virus hay kháng thuốc trừ cỏ Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ lồng vào genome, biểu kiểu hình va di truyền ổn định gọi chuyển gene Gene lạ có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động vật, chí gene tổng hợp Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước: xác định phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành hoàn chỉnh đánh giá biểu gene Tài liệu chia sẻ tại:5 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Trong bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng vai trò định kết chuyển gene Chuyển gene vào tế bào thực vật thực gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp Sau ví dụ chuyển qua thông qua Ti-plasmid vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens A tumefaciens vi khuẩn gây khối u hai mầm phản ứng hình thành khối u kết kiện chuyển gene tự nhiên Mấu chốt hình thành khối u Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) vi khuẩn chứa gene mã hoá sinh tổng hợp horrmon (auxin cytokinin) chịu trách nhiệm cho hình thành khối u Các gene nằm vùng T-DNA (transfered DNA) plasmid Khi plasmid xâm nhập vào tế bào cây, T-DNA chuyển vào genome Đoạn T-DNA yếu tố di truyền vận động trình chuyển gene Ý nghĩa Agrobacterium kỹ thuật di truyền khả chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật Lợi dụng phương thức chuyển gene tự nhiên nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều khiển T-DNA để thiết kế hệ vector cách lồng đoạn DNA cần chuyển gắn vào T-DNA vi khuẩn, sau cho nhiễm vi khuẩn chứa plasmid biến đổi Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực vật, tế bào đơn trong môi trường lỏng, đặt mô cấy dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi thời gian định Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm bước sau đây: - Phân lập gene có ích từ thể cho (DNA lạ) nhân gene - Loại bỏ T-DNA khỏi Ti-plasmid dong vi khuẩn chọn lọc - Chuyền DNA lạ vào Ti-plasmid với promotor gene thị có khả chọn lọc dễ dàng (ví dụ gene uidA vi khuẩn mã hoá βglucuronidaza thường gọi gene GUS, hay gene kháng kháng sinh) - Đưa plasmid biến đổi vào tế bào thực vật - Chọn tế bào chuyển gene Tài liệu chia sẻ tại:6 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Tái sinh tế bào chuyển gene - Chọn biểu chuyển (cấy chuyển gene) Hình 1.2 Tạo giống lúa Bt phương pháp súng bắn gene (particle bombardment method) Ở số loài dễ nuôi cấy khoai tây cà chua, mẫu cắt rời nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn thời gian ngắn Sau mẫu đưa vào môi trường dinh dưỡng Trong khoảng thời gian vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng xâm nhập vào tế bào tạo số tế bào chuyển gene Vì phần nhỏ tế bào chuyển gene nên cần phải tiến hành chọn lọc Việc chọn lọc thông thường dựa vào gene chọn lọc, gene kháng kháng sinh hay kháng thuốc trừ cỏ Sau mẫu chuyển vào môi trường khác chứa chất kháng sinh để diệt Agrobacterium sót lại chất kháng sinh khác hay thuốc trừ cỏ để loại trừ tế bào không Tài liệu chia sẻ tại:7 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn chuyển gene Các tế bào chọn chuyển sang loạt môi trường dinh để tái sinh Kết tái sinh tạo chuyển gene phụ thuộc vào loài Phương pháp chuyển gene thông qua Agrobacterium áp dụng thành công nhiều loài hai mầm thuốc lá, khoai tây cà chua [2] 1.4 Lịch sử phát triển, tiềm hạn chế kỹ thuật gen * Lịch sử phát triển: Lịch sử phát triển công nghệ gen thực vật chắn có nhiều kiện quan trọng Ở nêu lên mốc có ý nghĩa đặc biệt nhằm làm rõ phát triển nhanh lĩnh vực này: - Trước hết, vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens sử dụng làm phương tiện vận chuyển DNA Bình thường vi khuẩn tạo nên khối u thực vật Một phần nhỏ Ti-plasmid có vi khuẩn này, gọi T-DNA, vận chuyển từ Agrobacterium vào hai mầm Năm 1980, lần DNA ngoại lai (transposon Tn7) chuyển vào thực vật nhờ A tumefaciens, nhiên T-DNA chưa thay đổi Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu biến đổi T-DNA đưa DNA ngoại lai vào, tạo tính kháng số chất kháng sinh Ngoài ra, gen tạo khối u cắt DNA ngoại lai với phần lại chuyển vào thực vật biến nạp Thành công nhờ nghiên cứu xác đường lây nhiễm A tumefaciens trước khả hệ thống chọn lọc thực vật Từ kết thành công số lượng loài biến nạp ngày tăng Lúc có thêm nhiều phương pháp khác để biến đổi gen: - Năm 1984, biến nạp tế bào trần (protoplast) ngô thực Ở thành tế bào phân giải enzyme, xuất tế bào trần Nhờ polyethylene glycol (PEG) xung điện (electroporation) mà DNA đưa vào tế bào trần Tài liệu chia sẻ tại:8 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Năm 1985, lần biến đổi gen mô tả có tính kháng thuốc diệt cỏ Một năm sau, người ta thành công việc tạo thực vật kháng virus Năm 1996, thí nghiệm biến đổi gen phép đưa đồng ruộng - Năm 1987, phương pháp biến nạp phi sinh học sử dụng Ở tế bào thực vật bắn phá hạt vàng wolfram bọc DNA ngoại lai Nhờ phương pháp mà biến nạp thành công mầm quan trọng lúa (1988), ngô (1990) lúa mỳ (1992) Cũng năm 1987, cà chua thuốc kháng côn trùng làm cho công nghệ gen đạt bước phát triển quan trọng Một thành công quan trọng khác điều khiển trình chín cà chua, sau có tên FlavrSaver Năm 1994, lần cà chua biến đổi gen bán thị trường - Năm 1989, thành công việc chuyển gen mã hóa kháng thể vào thực vật, mà người ta tạo nên sản phẩm gen mong muốn Kết mở khả hoàn toàn mẽ cho việc sản xuất vaccine khả chống bệnh thực vật - Năm 1990, thành công việc tạo biến đổi gen bất dục đực, khả tạo hạt phấn Loại trồng có ý nghĩa lớn việc sản xuất hạt giống - Từ năm 1991, thành phần carbohydrate thực vật biến đổi năm 1992 acid béo Cùng năm đó, lần thành phần alkaloid loại cà cải thiện, bước quan trọng thực vật việc tổng hợp nhóm hợp chất Những thực vật có ý nghĩa lớn việc thu nhận dược liệu Sau thực vật biến đổi gen xuất hiện, chất nhân tạo phân giải sinh học tổng hợp Điều cho phép hy vọng rằng, tương lai Tài liệu chia sẻ tại:9 wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn có thực vật có đặc tính mới, sử dụng bioreactor thực vật để sản xuất “nguyên liệu tái sinh” - Năm 1994, cà chua Flavr SavrR trồng biến đổi gen đưa thị trường Năm 1998, giới có 48 giống trồng biến đổi gen sản phẩm thị trường hóa Năm 1999, lúa biến đổi gen đưa với gen biến nạp Đến đầu năm 1999, giới có khoảng 9.000 thí nghiệm đồng ruộng cho phép, khoảng 1.360 EU Cuối cùng, số nhận xét việc thị trường hóa biến đổi gen nông nghiệp Cho đến năm 1999, diện tích gieo trồng giới đạt 40 triệu Trong 20% ngô, 50% đậu tương 1/3 diện tích Mỹ Ngoài có 70% diện tích cải dầu Canada trồng với giống biến đổi gen Khoảng 90% thực vật biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ sâu bệnh hại Cần ý rằng, Mỹ sản phẩm đậu tương có 20.000 loại thực phẩm khác Điều cho thấy rằng, công nghệ gen ảnh hưởng đến sản xuất thực phẩm [1] * Tiềm năng: - Kỹ thuật chuyển gen cho phép đưa vào trồng gen lạ phân lập từ giống khác có quan hệ họ hàng với từ thể thực vật khác, chí từ động vật vi sinh vật Vì vậy, lúc làm xuất tính trạng hoàn toàn mới, chí chưa có tự nhiên - Nhờ kỹ thuật chuyển gen người ta tạo nhũng giống trồng chứa hợp chất đặc biệt, chất hữu dùng công nghiệp, thực phẩm, y tế Ví dụ cải dầu chuyển gen có khả phòng chống bệnh tim mạch 10 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Vector liên hợp (Cointegrated vector): Vector liên hợp dựa tái tổ hợp plasmid Một vector liên hợp gồm có: vị trí để ghép gen quan tâm, thường vị trí có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E.coli Gen thị kháng sinh giúp cho chọn lọc vi khuẩn E.coli, Agrobacterium gen chọn lọc hoạt động tế bào thực vật Như vector liên hợp hình thành từ plasmid mang trình tự ADN mong muốn plasmid có chứa vùng vir gen vùng bờ lặp lại T-ADN Sau tái tổ hợp, vector liên hợp tạo dùng cho chuyển gen vào thực vật - Vector nhị thể (Binary vector): Vector nhị thể hệ thống dùng plasmid riêng biệt: cung cấp T-ADN độc tính gây khối u, plasmid Ti plasmid có khả thâm nhập vào tế bào thực vật (mang gen vir) Plasmid thứ mang gen chọn lọc thực vật gen ghép vào gen thực vật Khi plasmid đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, sản phẩm mang gen vir đưa T-AND vào tế bào thực vật, T-ADN nằm phân tử ADN khác [1] * Ưu điểm - Gen bị đào thải Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng - Số lượng Do tránh tượng ức chế lẫn câm lặng lẫn - Tồn bền vững thể thực vật phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, phương pháp khác gen mục tiêu tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu dễ dàng bị tách sau * Nhược điểm - Có phổ công giới hạn - Gây khối u cho khỏa tự hai mầm lại không gây khối u cho mầm (do mầm thuộc nhóm tiến hoá nhất, tích lũy nhiều chế kháng bệnh hai mầm bị 18 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn thương tế bào có xu hướng hóa gỗ không phân chia mạnh để tái tạo tiếp hợp chất phenol hai mầm ) 2.3.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta sử dụng virus làm vector chuyển gen vào trồng Chuyển gen nhờ virus thuận lợi virus dễ xâm nhập lây lan thể thực vật động vật đồng thời virus mang đoạn ADN lớn nhiều so với khả plasmid Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có tiêu chuẩn sau: - Hệ gen virus phải ADN - Virus có khả di chuyển từ tế bào sang tế bào khác qua lỗ vách tế bào - Có khả mang đoạn ADN (gen) mới, sau chuyển gen vào tế bào thực vật - Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây) - Không gây tác hại đáng kể cho thực vật Đối chiếu tiêu chuẩn trên, có hai loại virus sử dụng làm vector chuyển gen caulimovirus geminivirus Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen thực vật sử dụng ADN virus khó ghép nối với hệ gen thực vật 2.3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 2.3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen (gene gun) 19 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.3 Súng bắn gen sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen * Nguyên lý Ngâm viên đạn nhỏ (vi đạn) vàng tungsten có kích thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 - 1,5 μm với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật Các vi đạn làm khô đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5 - 0,9 cm Đĩa kim loại gắn vào đầu viên đạn lớn (macroprojectile) nhựa, vật liệu nhẹ Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen Khi bắn, áp suất đẩy viên đạn với tốc độ cao Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn bị cản lại lưới thép mịn, viên đạn nhỏ (vi đạn) tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào Sau bắn, tách mô, tế bào nuôi cấy invitro để tái sinh Các gen cần chuyển tái tổ hợp vào hệ gen cây, từ tạo thành chuyển gen Chỉ có tỷ lệ tế bào mang gen chuyển cần phải chọn lọc Người ta thường dùng khí nén helium áp lực cao để bắn gen 20 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn * Ưu điểm: - Thao tác dễ dàng, bắn lần nhiều tế bào - Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô hóa mô phân sinh) * Nhược điểm: Tần số biến nạp ổn định thấp theo Potrykus ưu việt phương pháp nghiên cứu gen tạm thời Tuy nhiên, năm gần phương pháp thành công lúa, mía, đu đủ, khẳng định tính ưu việt phương pháp 2.3.2.2 Chuyển gen xung điện (electroporation) * Nguyên lý: Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật Ở điện cao, thời gian ngắn tạo lỗ màng tế bào trần (protoplast) làm cho ADN bên môi trường xâm nhập vào bên tế bào Người ta chuẩn bị protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn cần chuyển vào thực vật Dùng thiết bị xung điện tạo điện cao (200 – 400 V/cm) khoảng thời gian - phần nghìn giây Kết làm màng tế bào trần xuất lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid xâm nhập gắn vào hệ gen thực vật Quá trình thực cuvett chuyên dụng Sau trình xung điện, đem protoplast nuôi môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường chọn lọc để tách protoplast biến nạp Tiếp theo nuôi cấy invitro, tái sinh chọn lọc chuyển gen Đối với protoplast phương pháp xung điện có kết khích lệ chưa chứng minh chắn cho biến nạp Hơn nữa, việc nuôi cấy protoplast số loài gặp khó khăn [1] 21 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2.3.2.3 Chuyển gen vi tiêm (microinjection) Phương pháp sử dụng vi kim tiêm kính hiển vi để đưa ADN tế bào định, nhằm tạo dòng biến nạp từ protoplast biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn * Ưu điểm: - Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào - Quyết định đưa ADN vào loại tế bào - Có thể đưa cách xác chí vào tận nhân quan sát - Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn tế bào tiền phôi hạn chế số lượng tiêm xác - Có thể nuôi riêng lẻ tế bào vi tiêm biến nạp vào giống * Nhược điểm: - Mỗi lần tiêm phát tiêm với tế bào - Thao tác làm đòi hỏi độ xác cao 2.3.2.4 Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast Sau tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù Cắm đầu siêu âm máy phát siêu âm ngập hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo nhịp ngắn, nhịp khoảng 100 mili giây Số nhịp khoảng từ - nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây Sau siêu âm, đem protoplast nuôi môi trường thích hợp, chọn lọc để tách protoplast chuyển gen Nuôi cấy invitro để tái sinh Chọn lọc đưa trồng môi trường [1] 2.3.2.5 Chuyển gen phương pháp hóa học 22 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Chuyển gen phương pháp hóa học phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ chất hóa học polyethylen glycol (PEG) Khi có mặt PEG, màng protoplast bị thay đổi protoplast thu nhận ADN ngoại lai vào bên tế bào.Phương pháp chuyển gen hóa chất áp dụng với nhiều loài thực vật khả chuyển gen với tần số chuyển gen thấp Tuy nhiên, với khả tạo số lượng lớn protoplast, khắc phục hạn chế phương pháp [1] 2.3.2.6 Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) Phương pháp chuyển gen qua ống phấn phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô invitro Nguyên tắc phương pháp ADN ngoại lai chuyển vào theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh, tốt chuyển gen xảy trình thụ tinh noãn cho tế bào hợp tử chưa phân chia Như vậy, chuyển gen xảy tế bào sinh dục tái sinh không hình thành thể khảm - Sau thời gian hoa nở 1- giờ, cắt 2/3 3/4 phần hoa lúa - Sau cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa dung dịch ADN tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy bị cắt (nồng độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 μg/ml) - Bao lúa lại, chờ lúa chín thu hái - Phân tích xác định kết chuyển gen hệ sau 2.4 Thành tựu tạo trồng kháng sâu kỹ thuật chuyển gen Hiện nay, giới có tới 50 triệu hécta trồng chuyển gen kháng sâu, Các phòng thí nghiệm tạo nhiều giống chứa gene Bt (cry1Ab, 1Ac 1Aa, 2A, 1B, hay kết hợp gene này) để kháng lại côn trùng thuộc cánh vảy, giúp làm giảm thuốc trừ sâu cách đáng kể Các trồng quan 23 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn trọng chuyển gen Bt Mỹ (46% số thí nghiệm), đậu nành (17%), cà chua (16%), khoai tây (9%), ngô (8%), thuốc (4%) Các thành tựu tiêu biểu lĩnh vực kể đến như: * Chuyển gen cry1Ab vào vải G.A Khan ctv thuộc Viện nghiên cứu vải Pakistan, chèn thành công gen cry1Ab từ vi khuẩn sống đất vào giống vải MNH-93 Pakistan thông qua kỹ thuật bắn gen Transgene hợp vào genome thể qua xét nghiệm PCR phân tích Dot blot Số lượng Bt protein khẳng định, chúng biến thiên từ đến 1,35% protein tổng số Transgenic plants trồng nhà kính an toàn sinh học đồng ruộng để đánh giá tác động đồng, kết cho thấy dòng transgenic thể mức độ tính kháng sâu cánh vảy từ 40 đến 60% Dùng giống chuyển gen Bt để kiểm soát hoàn toàn sâu đục (bollworm) Spodoptera, tiết kiệm 1.161 triệu USD tiền thuốc sâu [7] Hình 2.5 Bông chuyển gen Bt đối chứng * Ngô chuyển gen Bt: Ngô chuyển gen người canh tác có tên ngô Bt tự tạo protein diệt vi khuẩn có đất có tên Bacillus theringiesis, triệt tiêu loại sâu đục bắp 24 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Ở Mỹ, năm 1996 giống ngô chuyển gen Bt với đặc tính kháng sâu cắn gié trồng diện tích triệu nhiều bang Cùng với ngô, quan giám sát an toàn sinh học APHIS thuộc Bộ Nông nghiệp Mỹ cho phép đưa vào sản xuất giống cà chua, bông, đậu nành, dưa, đu đủ chuyển gen kháng sâu Lợi ích thu tiết kiệm thuốc trừ sâu ngô chuyển gen Bt xác định khoảng 1094 triệu USD Hình 2.6 Cây Ngô chuyển gen Bt giống đối chứng * Chuyển gen tạo lúa có khả kháng sâu: Một số phòng thí nghiệm tạo giống chứa gene Bt (cry1Ab, 1Ac 1Aa, 2A, 1B, hay kết hợp gene này) để kháng lại côn trùng thuộc cánh vãy Các thử nghiệm đồng ruộng giống lúa Bt Trung Quốc thực vào năm 1998 Tuy nhiên chưa có giống lúa Bt đưa thương mại hóa Cuối năm 2009 Trung Quốc làm thủ tục để công nhận cho phóng thích giống lúa Bt Huahui No.1 Bt Shanyou 63 để đưa đại trà vào 2012 25 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.7 Lúa chuyển gen Bt MH63 giống đối chứng Giống lúa chuyển nạp gen Bt MH63 (T) phát triển tốt giống MH63 bình thường (C) bị nhiễm sâu nặng Kế bên giống Bt MH63 (T) kháng sâu đục thân giống MH63 bình thường (C) bị nhiễm nặng Bảng 2.1 Các loại trông chuyển gen kháng sâu thương mại hóa (Nguồn liệu bản: Cơ sở liệu GM Agbios - 2009) Số giống chuyển gen Nước sử dụng Bông Achentina, Ôxtralia, Trung quốc, Canada, Nhật Bản, Mêxicô, Philippine, Nam Phi, Mỹ Khoai tây 14 Ôxtralia, Canada, Philippine, Mỹ Ngô Achentina, Ôxtralia, Canada, EU, Nhật Bản, Hà Lan, Philippine, nam Phi, Thuỵ sỹ, Mỹ Hướng Dương Canada, Nhật bản, Philippine, Hoa kỳ Cà tím Ấn Độ, Braxin, Canada, Nhật Bản, Mêxicô, Philippine, Nam phi, Thuỵ sỹ, Anh quốc, Mỹ Cây trồng 26 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn CHƯƠNG QUY TRÌNH TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU VIP3A 3.1 Giới thiệu chung Thuốc (Nicotiana tabacum L) công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm thu hoạch tươi, phải thông qua giai đoạn chế biến đặc trưng (sấy, hong, phơi…) dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc Ngoài thuốc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng để chiết xuất dầu thực vật Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc theo hướng khác quan tâm quốc gia lớn Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe… Một hướng chọn tạo giống quan tâm ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại kháng bệnh virus khảm thuốc (TMV,CMV), virus xoăn thuốc (TLCV) kháng sâu (sâu xanh, sâu xám ) Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu 27 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn gen cry mã hóa cho tạo nội độc tố δ pha sinh bào tử vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt), gần nhà khoa học phát gen vip (vegetative insecticidal protein - protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho protein pha dinh dưỡng chu trình phát triển vi khuẩn Bt Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác định trình tự thử hoạt tính sinh học Kết cho thấy protein Vip có hoạt lực phổ tác dụng diệt côn trùng cao nhiều lần protein gen cry mã hóa Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA có phổ hoạt động rộng diệt sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc [6] Ở Việt Nam, thuốc công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Vấn đề sâu bệnh hại sản xuất nguyên nhân gây giảm suất chất lượng nguyên liệu, ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại hướng để giải vấn đề Viện Công nghệ Sinh học bước đầu thành công việc chuyển gen vip3A vào thuốc lá, tạo giống thuốc chuyển gen kháng sâu 3.2 Quy trình tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A Các nhà khoa học Viện Công nghệ Sinh học thực thành công việc tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A theo quy trình sau: Thiết kế mồi PCR nhân đoạn gen vip3A tinh sản phẩm PCR Lựa chọn vector tách dòng Ghép nối đoạn gen vip3A vào vector tách dòng Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 28 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A tumerfaciens xung điện Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Nuôi cấy mô tế bào Đánh giá mặt hình thái Kiểm tra sinh học phân tử Hình 3.1 Quy trình tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A Quá trình tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A chia thành giai đoạn sau: (1) Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A (2) Kiểm tra theo dõi kết chuyển gen (3) Chuyển gen vip3A vào thuốc Với quy trình (hình 3.1) nhà khoa học Viện Công nghệ Sinh học - thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo thành công giống thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A Thành công ý nghĩa mặt kinh tế mà mang ý nghĩa khoa học vô to lớn, việc tạo thành công thuốc chuyển gen kháng sâu để đưa vào sản xuất, tiết kiệm kinh phí việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, bảo vệ 29 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn môi trường, thuốc chuyển gen coi mô hình, để từ nhà khoa học tiếp tục phát triển nghiên cứu chuyển gen, tạo nhiều giống có khả kháng sâu chuyển gen mang tính trạng có lợi khác như: khả kháng virus, kháng bệnh, khả chống chịu điệu kiện bất lợi như: chịu hạn, chịu nóng, chịu lạnh … hay tính trạng cảm quang, tính trạng quy định giá trị dinh dưỡng … KẾT LUẬN Công nghệ tạo trồng chuyển gen nói chung công nghệ tạo giống trồng chuyển gen kháng sâu nói riêng ngày phát triển Các nhà khoa học tạo hàng trăm giống trồng chuyển gen khác mang nhiều đặc tính quý Có thể nói, kỹ thuật chuyển gen tạo trồng có khả kháng sâu mang lại lợi ích vô to lớn không người mà môi trương sinh thái Tuy nhiên vấn đề trồng chuyển gen (GMOsGenetically Modified Organisms) vấn đề tranh cãi, chí gặp phải phản đối gay gắt từ nhiều nhà khoa học Sản phẩm chuyển gen bị nhiều người tiêu dùng lo ngại Các sản phẩm chuyển gen phải dán nhãn để người tiêu dùng lựa chọn Nhiều nước chưa cho phép nhập sản phẩm chuyển gen trồng chuyển gen 30 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn May mắn là, nhà Khoa học khẳng định việc sử dụng trồng có gen kháng sâu bệnh không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến quần thể thiên địch, giảm chi phí sản xuất, tăng suất trồng, tăng thu nhập cho người sản xuất tạo sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng Đây hướng đắn hướng tới đảm bảo phát triển nông nghiệp bền vững TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Công nghệ chuyển gen (Động vật – Thực vật), Nxb Đại học Huế, 2006 Hoàng Trọng Phán, Trương Thị Bích Phượng, Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb ĐH Huế, 2008 Lê Duy Thành, Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2000 Nguyễn Thị Hải Yến, Bài giảng Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa Học, ĐH Thái Nguyên, 2010 http://agrobiotech.gov.vn/tabid/38/MenuID/1/language/vi-VN/Default.aspx 31 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn TÀI LIỆU TIẾNG ANH Singh, D.P and A Singh, Disease and Insect Resistance in plants Science Publishers, 2005 G A Khan, A Bakhsh, S Riazuddin and T Husnain, Introduction of cry1Ab gene into cotton (Gossypium hirsutum) enhances resistance against Lepidopteran pest (Helicoverpa armigera), Spanish Journal of Agricultural Research 2011 9(1), 296-302 MỤC LỤC 32 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn [...]... để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một trong những hướng đi để giải quyết vấn đề đó Viện Công nghệ Sinh học đã bước đầu thành công trong việc chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá, tạo giống cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu 3.2 Quy trình tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A Các nhà khoa học của Viện Công nghệ Sinh học đã thực hiện thành công việc tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A... tính trạng quy định giá trị dinh dưỡng của cây … KẾT LUẬN Công nghệ tạo cây trồng chuyển gen nói chung và công nghệ tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu nói riêng ngày càng phát triển Các nhà khoa học đã và đang tạo ra hàng trăm giống cây trồng chuyển gen khác nhau mang nhiều đặc tính quý Có thể nói, kỹ thuật chuyển gen tạo ra các cây trồng có khả năng kháng sâu đã mang lại lợi ích vô cùng to lớn không... vào cây để tạo cây trồng kháng sâu 14 Tài liệu được chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu được chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2.2.1 Các nguồn gene kháng sâu Nguồn gene kháng sâu có thể tìm thấy ở: + Các giống cây trồng + Nguồn tài nguyên di truyền của các loài + các loài hoang dại có quan hệ huyết thống với cây trồng 2.2.2 Một số gen kháng sâu đã được chuyển vào cây trồng Hiện nay, để tạo các cây. .. chua, bông, đậu nành, dưa, đu đủ chuyển gen kháng sâu Lợi ích thu được do tiết kiệm thuốc trừ sâu đối với cây ngô chuyển gen Bt được xác định khoảng 1094 triệu USD Hình 2.6 Cây Ngô chuyển gen Bt và giống đối chứng * Chuyển gen tạo lúa có khả năng kháng sâu: Một số phòng thí nghiệm đã tạo ra các giống chứa gene Bt (cry1Ab, 1Ac 1Aa, 2A, 1B, hay kết hợp các gene này) để kháng lại các côn trùng thuộc bộ... thực hiện biến nạp các gene này vào các giống cây trồng bằng phương pháp lai tế bào trần, phương pháp xung điện hoặc súng bắn gene để tạo ra các cây trồng có khả năng kháng sâu Đây chính là cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen tạo ra các cây trồng kháng sâu 2.1.4 Những khó khăn của việc tạo giống kháng sâu + Trong một số trường hợp chọn được giống kháng sâu này lại bị các sâu khác gây hại Điều... tính của cây chủ, gene kháng trội một loại sâu này có thể liên kết với gene không kháng loại sâu khác + Trong một số trường hợp chọn tạo giống kháng sâu làm giảm chất lượng sản phẩm, thậm chí không thể sử dụng được + Trong trường hợp gene kháng sâu chỉ có ở các loài hoang dại Việc chuyển gene bằng phương pháp lai giữa các loài là rất khó khăn và thường có sự liên kết giữa gene kháng với các gene bất... điện Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A tumefaciens Nuôi cấy mô tế bào Đánh giá về mặt hình thái Kiểm tra bằng sinh học phân tử Hình 3.1 Quy trình tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A Quá trình tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A được chia ra thành 3 giai đoạn chính như sau: (1) Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A (2) Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển. .. hécta trồng cây chuyển gen loại này, giúp làm giảm thuốc trừ sâu một cách đáng kể 15 Tài liệu được chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu được chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.1 Vi khuẩn BT và Gen độc tố Bt 2.3 Các phương pháp chuyển gen Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp 2.3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 2.3.1.1 Chuyển gen gián tiếp... chuyển gen (3) Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá Với quy trình như trên (hình 3.1) các nhà khoa học của Viện Công nghệ Sinh học - thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo thành công giống cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A Thành công này không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà nó còn mang một ý nghĩa khoa học vô cùng to lớn, bởi ngoài việc tạo thành công cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu. .. tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy đã bị cắt (nồng độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 μg/ml) - Bao bông lúa lại, chờ lúa chín thu hái - Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau 2.4 Thành tựu tạo các cây trồng kháng sâu bằng kỹ thuật chuyển gen Hiện nay, trên thế giới có tới 50 triệu hécta trồng cây chuyển gen kháng sâu, Các phòng thí nghiệm đã tạo ra nhiều giống chứa gene Bt (cry1Ab, ... gen (transgenic crops) hay gọi trồng biến đổi gen (genetically modified crops) thực vật mang nhiều gen đưa vào nhân tạo thay thông qua lai tạo Nói cách khác, thực vật chuyển gen thực vật có gen. .. nghệ gen thực trồng Mỹ (thống kê năm 2004) Nói chung, mục đích chuyển gen thêm thông tin di truyền ngoại lai vào genome, để ức chế gen nội sinh Trong số trường hợp, thay gen hoạt động chức gen. .. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 1.1 Định nghĩa khái niệm • • • • Chuyển gen (transgenesis) đưa đoạn DNA ngoại lai vào genome thể đa bào, sau đoạn DNA ngoại lai có mặt hầu hết tế bào truyền lại cho hệ sau