Thí nghiệm vi sinh thực phẩm BUỔI :HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ KỸ THUẬT LÀM NÚT BÔNG, BAO GÓI CÁC DỤNG CỤ HẤP KHỬ TRÙNG MỤC TIÊU Sau học xong này, sinh viên có khả năng: - Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết phòng thí nghiệm vi sinh vật - Vận dụng quy tắc an toàn phòng thí nghiệm vi sinh vật - Áp dụng phương pháp tiệt trùng môi trường, dụng cụ - Bao gói dụng cụ 1.1 Giới thiệu hướng dẫn sử dụng loại dụng cụ thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật 1.1.1 Hướng dẫn thực nôi quy thao tác an toàn - Hiểu nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật(VSV) - Thao tác an toàn đối tượng VSV mật độ cao - Không ăn uống , hút thuốc phòng thí nghiệm(PTN) VSV - Mặc áo blouse thời gian thực hành - Không dùng miệng hút ống hút (pipette) để định lượng VSV hóa chất mà phải dùng bóp cao su thao tác ống hút - Hộp petri đổ môi trường sau nuôi cấy VSV, không mở nắp, dùng tay để sờ dùng mũi để ngửi - Khi lỡ tay làm đồ VSV nơi làm việc, dùng khăn tay hay giấy tẩm cồn 700 để lau lau lại khăn hay giấy tầm cồn 70 khác - Khi sử dụng que cấy để gieo cấy VSV cần phải khử trùng cách đốt lửa đèn cồn tránh vương vãi xung quanh - Trước sau thao tác VSV cần lau tay kĩ cồn 70 Khi thực thao tác cần tránh xa lửa đèn cồn tay ướt - Cần ghi tên chủng VSV ngày tháng thí nghiệm lên dụng cụ chứa môi trườn nuôi cấy VSV - Tất chất thải môi trường chứa nhiễm VSV cần hấp khử trùng trước đem đổ vào thùng rác Các dụng cụ nhiễm VSV cần ngâm dung dịch sát khuẩn trước rửa - Không đổ thạch vào bồn rửa ống thoát nước THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm 1.1.2 Hướng dẫn sử dụng loại dụng cụ chuyên dụng phòng thí nghiệm vi sinh 1.1.2.1 Dụng cụ a Ống nghiệm: dùng để chứa môi trường nuôi cấy nuôi cấy VSV Môi trường dạng lỏng hay rắn Miệng ống nghiệm đậy nút không thấm nước, silicon, giấy nhôm hay nắp vặn phân tích VSV sử dụng giấy nhôm hay silicon để hạn chế nhiễm VSV b Đĩa Petri (petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên nắp nhỏ có hình tròn, đường kính 6,8,10,12 cm Đĩa Petri gói lại giấy trước đem hấp tiệt trùng nhiệt ẩm hay sấy nhiệt khô Mục đích bao gói nhằm ngăn ngừa VSV nhiễm vào môi trường trước sau cấy đồng thời để gọn tránh vỡ dụng cụ đưa vào nồi hấp trình thao tác THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm c Bình tam giác (bình nón): thường sử dụng để chuẩn độ, chứa đựng môi trường, dung dịch, nuôi cấy vi sinh vật, thực phản ứng, bình cầu thích hợp cho phản ứng cần xúc tác nhiệt độ Bình tam giác, bình cầu thường tích từ 50ml đến 10 lít tùy theo dung dịch chứa để chọn loại bình thích hợp Tương tự Petri bình tam giác làm nút gói lại giấy phần đầu trước đem hấp tiệt trùng Giúp ngăn ngừa VSV nhiễm vào môi trường trước vào sau nuôi cấy, tránh cho nước trình hấp lọt vào bình, VSV xâm nhập hấp xong nên cần làm nút bọc giấy bên d đèn cồn : loại đèn đốt cồn 900, mục đích nhằm tỏa nhiệt tạo vùng xung quanh vô trùng hạn chế VSV khác xâm nhập môi trường nuôi cấy VSV Đèn cồn dùng để khử trùng loại que cấy cách hơ hay đốt ngọ lửa đèn cồn THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm e Phiến kính(lame) kính (lamelle): - Phiến kính miếng thủy tinh hình chữ nhật, có độ suốt cao, dày 2mm dùng để chứa giọt VSV trạng thái sống hay nhuộm màu quan sát chúng kính hiểm vi - Lá kính: miếng thủy tinh hình vuông, có độ suốt cao dày 0.1-0.2 mm dung để đậy lên giọt VSV phiến kính để quan sát trạng thái sống tế bào VSV f Các loại que cấy - Que cấy thẳng: dùng để cấy điểm vsv Những vsv cần cấy sâu - Que cấy vòng : dùng cấy ria mặt thạch hay phân lập VSV bề mặt thạch cấy chuyền môi trường lỏng - Que cấy móc : dùng để cấy loại nấm mốc hay xạ khuẩn - Que trang: dùng để trải giọt sinh khối VSV bề mặt thạch g Micropipette Là loại ống hút máy có độ xác cao dùng để định lượng thể tích xác dung dịch VSV, môi trường nuôi cấy (lỏng) hay dung dịch hóa chất Mỗi loại micropipette có loại đầu tip tương ứng để hút Khi hút loại nồng độ khác hay hóa chất khác phải thay đổi đầu típ để tránh nhiễm hóa chất vsv nồng độ khác ảnh hưởng đến kết phân tích Trên micropipette điều chỉnh thể tích hút cách vặn số tương ứng THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm Cách hút mấu:  Vặn nút xoay điều chỉnh số µl hút định.Trong báo cáo tới có số: 0.1ml= 100µl 1ml=1000 µl Gắn ống típ tương ứng với nồng độ chất cần hút khác  Nhấn giữ nút phía để hút thể tích tương ứng Sau hút nhả nút  Khi nhả chất cần hút ống nghiệm , nhấn nút nấc sau nhấn thêm lần nấc để nhả hết chất cần hút Sở dĩ có nấc sau bấm nấc thể tích đầu típ, mũi típ nên nhấn nấc giúp thể tích hút xuống hết kết thí nghiệm xác  Làm đầu típ cất micropipette Lưu ý:Thay đổi đầu típ hấp khử trùng cần hút nhiều nồng độ khác hay hóa chất khác nút vặn điều chỉnh thể tích dễ hư nên cần thao tác cẩn thận tránh vặn vặn lại nhiều lần 1.1.2.2 Hướng dẫn sử dụng loại thiết bị chuyên dụng phòng thí nghiệm vi sinh a Nồi hấp : thiết bị bắt buộc phải có PTN vi sinh cho phép tiêu diệt tất dạng sống VSV(tế bào sinh dưỡng, bào tử) Nồi hấp có cấu tạo lớp vỏ nên có khả chịu áp suất cao Buồng khử trùng có gắn valve thoát khí, áp kế, nhiệt kế - Khi sử dụng phải dùng nước cất châm vào thùng, tránh bị đóng cạn Nước phải châm đến mức quy định - Nhiệt độ hấp 1210C 15 phút (thường để 20-30 phút lúc nhiệt độ lên tới mức 1210C lúc thời gian trùng, tiệt trùng cho dụng cụ) - Chỉ mở nắp lấy giỏ dụng cụ hấp nhiệt độ 100 0C áp suất THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm * Cách vận hành nồi hấp  Bước 1: Mở nắp nồi hấp, lấy hai giỏ inox  Bước 2: Cho nước cất vào nồi hấp đến ngập ốc cảm ứng khoảng 1-2 cm  Bước 3: Cho dụng cụ môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ đưa vào nồi hấp  Bước 4: Đóng nắp khóa van  Bước 5: Bật công tắt bên hông, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời gian, bấm nút “set” “start” Hấp nhiệt độ 1210C Trong thời gian 30 phút  Bước 5: Khi có tín hiệu mở nồi hấp ra, mặt hiển thị báo nhiệt độ 1000 có đèn báo “ complete” chớp chớp màu đỏ, chờ phút cho bớt nóng lấy dụng cụ môi trường mở nồi hấp điều kiện áp suất nhiệt độ 1000C Để đảm bảo an toàn tránh nổ nồi hấp b Máy lắc: Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường nuôi cấy VSV, tăng cường oxi tan môi trường Được dùng để nuôi VSV hiếu khí môi trường lỏng * Thao tác sử dụng máy lắc THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm - Cắm điện - Đặt ống nghiệm lên phần núm đen + Bật công tắc lên muốn sử dụng chế độ lắc gián đoạn(Manual) Nhấn nhẹ giữ chặt ống nghiệm vài giây nhấc ống nghiệm + Bật công tắc xuống muốn sử dụng chế độ lắc liên tục(Continuous) 1.2 Kỹ thuật làm nút ống nghiệm, bình tam giác Nhằm ngăn nhiễm VSV từ vào môi trường trước sau cấy VSV Bước Dùng tay xé miếng lớn hình chữ nhật, gấp rìa miếng vào cho gọn không bị xù Bước 2: Cuốn chặt lại thành nút cho vừa khít ống nghiệm bình tam giác (không chặt không lỏng) Nút không dài không ngắn để thuận tiện cho trình thao tác Sau làm nút xong bao gói hấp khử trùng 1.3 Kỹ thuật bao gói dụng cụ Mục đích ngăn ngừa VSV nhiễm vào môi trường trước sau cấy, để tránh vỡ dụng cụ thủy tinh trình thao tác Dùng giấy không thấm nước Vì giấy thấm nước dễ bị rách trình thao tác sau hấp khử trùng Trong phòng thí nghiệm VSV, người ta thường bao gói nhiều dụng cụ: - - Bao gói ống nghiệm : tùy theo mục đích nuôi cấy mà nên theo kiểu cho phù hợp:  Mục đích giữ giống: Người ta giấy tạo thành nắp chụp lấy chụp vào dễ dàng Vì nắp chụp dùng dùng lại nhiều lần sau lần lấy giống thí nghiệm Mép sau nên gấp nhét cho gọn  Mục đích phân tích: nắp giấy ống nghiệm sử dụng lần bỏ Nên ta đơn giản Mép giấy gấp nhét cột thun Gói giấy đĩa Petri: Bước Đặt 2,3 đĩa tờ giấy hình chữ nhật cắt phù hợp Bước Túm lấy cạnh nhỏ hình chữ nhật gấp cuộn mép 2-3 lần cho chặt vừa đĩa THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm - - Bước Sau ấn đầu mép lại xuống gấp mép hình tam giác nhọn gói quà Bước Gấp ngược hai hình tam giác xuống để chồng đĩa đè lên giữ nếp gấp Cuốn giấy bó ống nghiệm có chứa môi trường Bó ống nghiệm thường từ 4-6 ống xung quanh đáy ống thí nghiệm Chiều cao giấy từ đáy lên 1/3 ống nghiệm cột lại sợi thun Phần miệng ống nghiệm tương tự phần đáy để hở phần bó óng thí nghiệm Cần để đáy ống nghiệm phía tránh để lộn khiến môi trương sau hấp bị đầy hết áp lực tăng gia nhiệt trình hấp Cuốn giấy bình tam giác: Bình tam giác phần miệng ống nghiệm Cuốn giấy dụng cụ khác: Các dụng cụ giấy như: pipette, cốc thủy tinh, que cấy Một số câu hỏi: Tại phải làm nút bao gói dụng cụ? VSV loài sinh trưởng phát triển nhanh trình thực hành việc hạn chế mức thấp xâm nhập VSV bên vào môi trường nuôi cấy cần thiết ảnh hưởng đến kết nuôi cấy vây thí nghiệm độ tin cậy cao Ống nghiệm bình tam giác làm nút nhằm hạn chế xâm nhập vi khuẩn vào dụng cụ, ảnh hưởng đến kết nuôi cấy Đồng thời số trình thao tác cần nút để hạn chế bay nhiễm VSV bên đổ môi trường nuôi cấy Bao gói dụng cụ mục đích nhằm ngăn ngừa vi sinh vật nhiễm vào môi trường trước sau cấy Tránh vỡ dụng cụ thủy tinh trình thao tác Quá trình hấp ủ dụng cụ hiệu Tại phải hấp khử trùng ? Dụng cụ thí nghiệm thường sử dung sử dụng lạ nhiều lần đồng thời xâm nhập vsv từ môi trường bên nên không hoàn toàn mà chứa VSV khác bên Vì trước nuôi cấy phải rửa hấp khử trùng để tạo không gian vô trùng tiêu diệt VSV bên xung quanh thành dụng cụ giúp kết nuôi cấy sau không bị nhiễm VSV không mong muốn làm ảnh hưởng kết Tại hấp số dụng cụ nên dùng giấy bạc, số khác lại dùng bông? Vì giấy bạc đậy ống nghiệm dễ dàng dụng cụ thao tác lần bỏ nước cất nên dùng giấy bạc, dụng cụ thí nghiệm sử dụng sử dụng lại hiều lần không nên dùng giấy bạc giấy bạc có nhược điểm dễ rách THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page Thí nghiệm vi sinh thực phẩm đồng thời bao lại lần 2,3 nhăn không kín dẫn đến vsv dễ xâm nhập, bao giấy bạc tốn hơn, trình thao tác thí nghiệm nhanh dùng nút Tại đĩa petri lại có nắp lớn, nắp nhỏ ? Việc nắp lớn đạy lên nắp nhỏ có ý nghĩa lớn Thứ giúp cho tuyệt đối kín nắp tránh vsv bên xâm nhập Thứ trình thí nghiêm thao tác cần nhanh để tránh vsv bên xâm nhập nên nắp lớn phía giúp mở đậy lạ dễ dàng Buổi 2: PHA MÔI TRƯỜNG VÀ QUAN SÁT KÍNH HIỂM 2.1 Chuẫn bị Mỗi sinh viên: • đĩa Petri/30ml • ống nghiệm/10ml Môi trường: • PCA: 22.5 g/l pha 1.2l • DRBC: 32 g/l pha 1.2l Tính chất thành phần PCA DRBC: PCA (Plate Count Agar): môi trường tổng hợp Thành phần Peptone Yeast extract Glucose Agar Số lượng 2.5 15 Đơn vị g g g g Tính chất: đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí DRBC(Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol): môi trường chọn lọc Thành phần Glucose Pepton K2HPO4 MgSO4 Rose Bengal (5%w/v) Dichloran (0,2% w/v THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Số lượng 10 0,5 0,5 Page Đơn vị g g g g ml ml Thí nghiệm vi sinh thực phẩm ethanol) Chloramphenicol Agar Nước cất pH cuối (25 o C) 0,1 15 1000 7,00,2 g g ml Chloramphenicol để nguội đến 50oC bổ sung vào Tiệt trường môi trường 121oC thời gian 15 phút Chú ý:  Môi trường có chứa dichloran rose Bengal nên ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh, cho phép phát nấm mốc mọc chậm  Rose Bengal chất dễ bị phân huỷ ánh sáng, nên cần giữ môi trường tối  Choloramphenicol thường có tác dụng kìm khuẩn, diệt khuẩn nồng độ cao vi khuẩn nhạy cảm cao Chloramphenicol ức chế tổng hợp protein vi khuẩn nhạy cảm cách gắn vào tiểu thể 50S ribosom  Rose Bengal thường sử dụng tác nhân ức chế vi khuẩn SPW (SaltPepton Water): môi trường tăng sinh Thành phần Số lượng Đơn vị NaCl 85 g Pepton 10 g Nước cất 1000 ml o Tiệt trùng môi trường 121 C thời gian 15 phút Lưu ý pha: thành phần PCA DRBC có agar nên pha môi trường phải kết hợp với gia nhiệt agar hoà tan đồng Sau pha xong: • PCA: màu vàng • DRBC: màu đỏ • SPW: màu vàng 2.2 Phân loại môi trường: 2.2.1 Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo cấu trúc: a Môi trường lỏng: Thường dung để tăng sinh hoá, nhân giống thứ cấp, lên men,…của VSV Môi trường lỏng không chứa chất làm đặc môi trường, như: agar, getalin… b Môi trường rắn Ngoài thành phần dinh dưỡng, môi trường rắn môi trường có thêm thành phần làm đặc (agar, gelatin….) người ta thường dung loại môi trường phân lập VSV, quan sát khuẩn lạc, định lượng VSV (trong phân tích tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men, nấm mốc…), hay nghiên cứu đặc tính khác VSV c Môi trường bán rắn THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 10 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm  Lúc đổ đĩa không nói để tránh bị lây nhiễm từ vào mẫu cấy  Đánh dấu môi trường đỗ vào đĩa tránh nhầm lẫn sau 3.4.4 Tiến hành cấy: • Lấy đĩa Petri chứa môi trường • Dùng cồn 70o triệt trùng tay xung quanh khu vực đặt dụng cụ cấy • Triệt trùng quay trang cách dùng cồn 90 o đổ cốc nhỏ ngâm quay trang vào Bước 1: Dùng micropipette đầu tip vô trùng hút 0,1 ml dịch VSV lên bề mặt môi trường thạch đĩa petri không gian vô trùng (hoặc gần đèn cồn) Bước 2: Lấy đầu quqy trang cốc chứa cồn đốt đèn cồn làm làm lại lần để triệt trùng quay trang, để dầu quay trang nguội môi trường vô trùng… Bước 3: Sau từ từ mở đĩa petri đưa đầu quay trang vào,dùng quay trang gạt đều, xoay tròn nhè nhẹ giọt VSV khắp mặt thạch tránh làm vỡ mặt thạch Bước 4: Rút quay trang khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy , đánh dấu nhóm VSV nuôi cấy để tránh nhầm lẫn nồng độ dung dịch VSV, môi trươg bảo lưu nhiệt độ thời gian thích hợp với VSV nuôi cấy THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 19 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm Lưu ý: Lúc cấy không nói để tránh bị lây nhiễm từ vào mẫu cấy Đánh dấu mẫu vật nuôi cấy trước bảo lưu để tránh nhầm lẫn sau 3.5 Định lượng VSV (Phương phápđếm khuẩn lạc): 3.5.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc: − Bước 1: Lấy kết từ đĩa cấy trãi, chịn đếm đĩa Petri − Bước 2: Dùng viết long máy đếm khuẩn lạc − Bước 3: Mỗi khuẩn lạc đếm đánh dấu chấm mực bút đếm khuẩn lạc − Bước 4: Khi có tổng số khuẩn lạc đĩa Petri dùng công thức sau suy số lượng VSV có đơn vị trọng lượng hay thể tích thực phẩm Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí 1g mẫu tính sau: A(CFU/g)= Trong đó: A số tế bào vi khuẩn /1g mẫu THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 20 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm N tổng số khuẩn lạc đĩa chọn số lượng đĩa cấy độ pha loãng V thể tích dịch cấy vào Petri độ pha loãng tương ứng 3.6 Kết thực nghiệm : Độ pha loãng Độ pha loãng Độ pha loãng () Đĩa số 335 60  Áp dụng công thức ta có kết quả: = (CFU/g) =(CFU/g)  Nhận xét: Độ pha loãng lớn mật độ khuẩn lạc thưa dần Câu hỏi: Tại lại dùng cồn 70o để triệt trùng môi trường tay trước cấy mà không dùng cồn 98o?  Trả lời: có lí nên dùng cồn 700: - Môi trường cấy môi trường vô trùng người ta thực trình cấy gần đèn cồn dùng cồn 98o để triệt trùng dụng cụ tay phực lửa gây cháy nguy hiểm cho người cấy phòng thí nghiệm làm hại đến VSV cần nuôi cấy THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 21 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm - Cồn 700 tạo không gian vô trùng cho bàn cấy tay người Nếu dùng cồn 980 tay có cảm giác nóng khó chịu - Tiết kiệm nguồn nguyên liệu dùng cồn 98 để pha cồn 700 với thể tích lớn Tại nên đổ thạch nhiệt độ 40-50 0? Đĩa petri đổ môi trường (đã đông) nên đặt úp hay đặt ngửa mặt thạch? Vì sao?  Trả lời: Nên đổ thạch nhiệt độ thích hợp Nếu đổ nóng khó khăn cho trình cầm đĩa thao tác làm nguy hiểm đồng thời thạch lâu đông Nếu đổ nguội thạch dễ đông làm bề măt thạch không đồng Khi đổ môi trường nên đặt ngửa vì: Quá trình đổ thạch nóng làm bốc nước nước tích tụ bề mặt nắp lớn Viêc để úp(nắp lớn trên, nắp nhỏ dưới) làm cho nước tích tụ nắp lớn rớt xuống tạo điều kiện cho vsv khác phát triển chưa cấy VSV làm ảnh hưởng kết cấy Vì nên để ngửa Khi cấy xong để úp lúc có vsv dùng nước để phát triển tốt Tại phải dùng đèn cồn để vô trùng bàn dụng cụ cấy suốt trình thao tác? Trong trình đổ môi trường cấy giống vsv bên dễ xâm nhập làm ảnh hưởng kết phải khử vô trùng cho dụng cụ cấy mà bàn cấy, que cấy phải vô trùng, đồng thời cấy cần đặt miệng ống nghiệm, bình tam giác gần kế bên đèn cồn nhiệt độ cao đèn cồn khử vsv xung quanh môi trường vsv bên không bị nhiễm BUỔI 4: LÊN MEN LACTIC 4.1 Lên men lactic Lên men latic trình chuyển hóa kỵ khí đường với tích lũy acid lactic môi trường Con người biết ứng dụng tượng từ lâu để chế biến loại thức ăn chua ( sữa chua, muối dưa, muối cà,…), ủ chua thức ăn cho gia súc hay sản xuất acid lactic phục vụ cho ngành công nghiệp thuộc da, dệt nhuộm, công nghệ thực phẩm,… THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 22 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm Các vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Mặc dù loại vi khuẩn không đồng với mặt hình thái( hình que ngắn, dài, hình cầu), song mặt sinh lí chúng lại tương đối đồng Tất vi khuẩn gram +, không tạo bào tử hầu hết không di động Thu nhận lượng từ việc phân giải hydrocacbon tiết acid lactic 4.2 Cơ chế lên men lactic Khi thủy phân đường điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang Pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+ NAD H C6H12O6 CH3COOH NAD + CH3-CHOH-COOH + Q Căn vào sản phẩm sinh ra, trình lên men lactic chia làm kiểu: ∗ Lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đường tạo thành sản phẩm chủ yếu acid lactic (95%) VSV lên men lactic đồng hình: Giống Streptococus: S cremoris, S lactic, S.thermophillus… Giống Lactobacillus: L Bulgaricus, L acidophilus, L.platarum… ∗ Lên men lactic dị hình Khi lên men vi khuẩn tạo 60% acid lactic phần lại acid acetic, rượu etanol, Glyxerin số sản phẩm khác VSV lên men lactic dị hình: Lactobacillus brasiacar fermentatae, Leuconostoc memsenterioides, Escherichia Coli,… 4.3 Qui trình làm sữa chua Nguyên liệu – bịch sữa tươi – Sữa đặc có đường: hộp – hộp sữa chua giống dùng để gây men – Các bao nhỏ để đựng sữa chua Cách bước làm sữa chua: THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 23 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm – + + + + Bước Đun sôi nước Cho hộp sữa đặc có đường Dùng lại lon sữa bò khui, đong lon nước sôi khuấy theo chiều Cho tiếp bịch sữa tươi vào khuấy Hình 3.1 Rót nước sôi, sữa tươi vào trộn - Bước + Khi hỗn hợp đạt đến nhiệt độ khoảng 30– 35 độ C, cho hộp sữa chua vào, để tránh nóng làm chết vi khuẩn lên men + Tiếp tục khuấy hỗn hợp (không để sôi) nhắc nồi xuống khỏi bếp – Bước + Đổ sữa chua vào bao nhỏ chuẩn bị sẵn, bọc kín lọ lại Cách làm có tác dụng giữ vệ sinh ủ sữa chua kín sữa chua lên men tốt THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 24 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm Hình 3.2 Sữa chua – Bước + Đun nồi nước ấm + Đặt bao sữa chua vào nồi nước + Dùng nắp đậy nồi lại để ủ sữa chua khoảng – 10 đồng hồ – Bước Khi thấy sữa chua sệt sệt + Lấy sữa chua bỏ vào ngăn mát tủ lạnh khoảng sử dụng Chú ý: Đo pH trước sau lên men để xem sữa chua có thay đổi nồng độ acid hay không 4.4 Qui trình làm cơm rượu Nguyên liệu – 2kg nếp – Men – Hủ nhựa có nắp Cách bước làm cơm rượu: – Bước + Ngâm nếp + Nấu nếp: không đổ nước nhiều làm nhão xôi khô không vò viên Nấu phải thật khéo: xôi nát ,rượu chua ; xôi khô, cơm rượu sượng + Bới xôi mâm, khay trải mỏng xôi cho xôi mau nguội – Bước + Giã nhuyễn viên men + Khi xôi nguội rây men lên mặt cơm nếp Lưu ý xôi phải nguội, xôi nóng men bị "chết", không thành rượu THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 25 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm + Rắc men lên mặt xôi, dùng đũa trộn thật – Bước Hình 4.1 Rải men lên xôi + Pha loãng muỗng cà phê muối + chén nước + Nhúng ướt tay chén nước muối, vo xôi trộn men thành viên tròn cỡ đầu ngón tay cái, khô tay lại nhúng nước muối cho ướt để khỏi bị dính tay + Sắp xôi viên vào hũ nhựa cho đầy vào khoảng 3/5 dung tích hũ, đậy kín THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 26 Hình 4.2 Cơm rượu Thí nghiệm vi sinh thực phẩm – Bước + Tùy chất lượng men, sau - ngày, hũ cơm rượu tự nước mùi thơm rượu + Sau thêm nước đường để tiếp tục lên men + Bỏ tủ lạnh để giữ lâu không cơm rượu nặng mùi " rượu " 4.5 Nhận xét sau lên men Sữa chua: mịn, lên men có vị chua, ngọt, ngon, qui trình làm sữa chua thành công Cơm rượu: có mùi nồng rượu, thơm, lên men hk bị sượng, bổ sung đường trễ, qui trình làm cơm rượu thành công BÀI KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT 5.1 Nguyên Tắc Nuôi Cấy Và Phân Lập Vi Sinh Vật Mục đích việc gieo cấy VSV để nhân giống VSV; phát có mặt VSV mẫu cần phân tích; nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa đối tượng vsv mục tiêu 5.2 Các Kỹ Thuật Phân Lập, Nuôi Cấy Và Giữ Giống VSV 5.2.1 Kỹ thuật phân lập vsv VSV tồn tự nhiên dạng quần xã gồm nhiều quần thể loài VSV Việc phân lập loài định quần xã VSV dựa vào khả nagnw phân tách tế bào thành riêng rẽ mội trường chọn lọc Hầu hết phương pháp phân lập chủng VSV dựa kỹ thuật phan loãng để phân tách tế baofVSV kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo ưu tăng trưởng cho Hiện có kỹ thuật phổ biến sau: 5.2.1.1 Kỹ thuật hộp đĩa ria THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 27 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm Là kỹ thuật phân tách VSV cách ria bề mặt đĩa thạch cho tế bào riêng rẽ Sauk hi ủ thời gian, tế bào tăng trưởng thành khuẩn lạc riêng biệt Khuẩn lạc hình thành sinh sản, phân chia từ tế bào ban đầu Kỹ thuật ria có nhiều cách ria khác nhau, kỹ thuật hoàn hảo tuyệt đối Hiệu kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy Có kiểu cấy thường dùng: Kỹ thuật ria chữ T, Kỹ thuật ria lien tục, Kỹ thuật ria góc, Kỹ thuật ria tia 5.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy bảo quản VSV Cấy đâm sâu ống thạch đứng Người ta sử dụng que cấy để đam sâu vào môi trường thạch đứng Các bước tiến hành tương tự 1.1 1.2, có điểm khác biệt sau: - Quay ngược ống nghiệm cho miệng ống nghiệm quay xuống để tránh việc nhiễm khuẩn lúc gieo cấy Đưa ống nghiệm có VSV đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho gần đáy ống nghiệm THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 28 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm 5.3 Các bước tiến hành kỹ thuật cấy ria ống nghiệm thạch nghiêng Sử dụng ống nghiệm chuẩn bị sẳn từ 2: ống thạch nghiêng môi trường Cao thịt – pepton Czapek-Dox Ông nghiệm thạch nghiêng chứa Cao thịt – pepton dùng để cấy ria giống vi khuẩn Ống nghiệm thạch nghiêng Czepek-Dox dùng để cấy ria nắm men hay nấm mốc Bước 1: ông nghiệm nằm tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út long bàn tay tay phải dùng để mở giũ nút Sauk hi khử trùng que cấy mở nút ống chưa VSV, khử trùng miệng ống nghiệm cách hơ qua hơ lại miệng ống nghiệm lửa để khử trùng Bước 2: Đưa que cấy khử truvào bên ống nghiệm hay bình tam giác nhúng vào canh trường lấy sinh khối VSV mà không để đàu que chạm vào thành vào miệng ống nghiệm Bước 3: Mở nút ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm, đưa que cấy vào đáy ống nghiệm đưa theo đương dzich dzắc từ kéo hướng miệng ống nghiệm Bước 4: Rút que cấy đốt miệng ống nghiệm nút đậy lại Bước 5: Để ống nghiệm vào giá, đốt que cấy lửa đèn cồn trước trả que cấy giá để Bước 6: dán nhãn lên môi trường vừa nuôi cấy, ghi tên VSV ngày gieo cấy THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 29 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm BUỔI : KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT VÀ NHUỘM GRAM 6.2 Kỹ thuật làm tiêu quan sát vi sinh vật 6.1.1 Kỹ thuật làm tiêu quan sát vi sinh vật trạng thái sống 6.1.1.1 Tạo tiêu quan sát vi sinh vật trạng thái sống hay gọi tiêu giọt ép (quan sát vi sinh vật vật kính 40X) Bước 1: Rửa phiến kính kính, để nước Bước 2: Cho giọt vsv chuẩn bị Bước 3: Sau lấy kính mỏng đặt lên giọt dịch thật cẩn thận cho không tạo thành bọt khí Muốn quan sát lâu dùng vazơlin bôi quanh mép kính giọt dịch khỏi khô Đậy kính phiến kính, nghiêng góc ≤ 450 hạ kính xuống để bọt khí, cho kính ép đầy vsv phiến kính Đưa tiêu lên quan sát kính hiển vi 6.1.2 Tạo tiêu quan sát vi sinh vật trạng thái chết(tiêu nhuộm Gram) Phương pháp nhuộm Gram: Đây phương pháp thường dùng thực nghiệm vi sinh vật học Phương pháp nhuộm kép nhà bác học người Đan mạch Christian Gram người cộng tác đưa THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 30 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm năm 1884 Với phương pháp nhuộm người ta phân biệt vi sinh vật thành nhóm: Gram dương G+ nhóm Gram âm G Vi sinh vật bắt màu tím sau nhuộm gọi vi sinh vật Gram dương (bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm men, cầu khuẩn) Còn vi sinh vật bắt màu hồng gọi Gram âm trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, số cầu khuẩn lậu cầu khuẩn, não mô cầu khuẩn 6.1.2.1 Nguyên tắc: Dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau: - Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram dương - Loại phức chất thứ hai không giữ màu thuốc nhuộm nên màu bị xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram âm 6.1.2.2 Cách tiến hành Bước 1: Chuẩn bị hộp sữa chua TH true YOGURT( vi sinh vật cần quan sát) Lấy lượng pha loãng pha loãng số lượng vi sinh vật sau nhuộm Gram dễ quan sát Bước 2: Chuẩn bị phiến kính kính, rửa cồn 980 nhằm vô trùng kính Để nước Bước 3: Cố định vi sinh vật cách cho giọt sinh khối VSV trải phiến kính sạch, hơ lửa đèn cồn khô(không ướt không cháy) Bước 4: Nhuộm vết bôi dung dịch tím kết tinh, nhỏ 1-2 giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ 30 giây Tiếp theo dùng bình tia rửa phẩm nhuộm hơ khô Bước 5: Nhuộm vết bôi dung dịch Lugol, nhỏ 1-2 giọt I2/ KI lên vết bôi, để phút Sau đó, dùng bình tia chứa cồn 980 rửa thật phẩm nhuộm đến hết màu, rửa lại nước hơ khô Bước 6: Nhuộm vết bôi safranin(hoặc cảbofuchin), nhỏ 1-2 safranin lên vết bôi, để yên 30 giây Sau đó, rửa vết bôi nước, hơ khô, nhỏ giọt dầu soi kính lên vệt bôi quan sát vật kính 100X THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 31 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm Từ kết nhuôm gram cho thấy vi sinh vật Gram dương nên bắt màu tím Thực tế cho thấy sữa chua yaourt thực phẩm dinh dưỡng từ sữa tạo cách lên men lactic nhờ tác động Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus có sữa chủng vi khuẩn Gram dương KẾT LUẬN Qua thực hành ta biết thao tác để thí nghiệm an toàn, kĩ thuật làm nút bông, bao gói Biết cách làm môi trường Cấy quan sát vsv Một số lưu ý cần thiết để vô trùng môi trường dụng cụ nhằm hạn chế đến mức tối thiểu xâm nhập vi sinh vật Các kĩ thuật cấy nhằm nuôi giống giữ giống Dùng phương pháp cấy chuyền để giữ giống giống lúc có sẵn mua với giá cao, cách giữ giống lần sau phải tốn tiền mua sống thời gian định không ngừng thay đổi bổ sung môi trường nuôi cấy Qua ta biết thêm cách thức làm sữa chua, lên men cơm rượu cho ngon nắm bắt chế lên men chúng THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 32 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Google.com.vn Tailieu.vn Thí nghiệm vi sinh thực phẩm trường đại học công nghiệp thực phẩm TPHCM THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 33 [...]... ngày gieo cấy THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 29 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm BUỔI 6 : KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT VÀ NHUỘM GRAM 6.2 Kỹ thuật làm tiêu bản quan sát vi sinh vật 6.1.1 Kỹ thuật làm tiêu bản và quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống 6.1.1.1 Tạo tiêu bản quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống hay còn gọi là tiêu bản giọt ép (quan sát vi sinh vật ở vật kính 40X) Bước 1: Rửa sạch phiến... hiển vi 6.1.2 Tạo tiêu bản quan sát vi sinh vật ở trạng thái chết(tiêu bản nhuộm Gram) Phương pháp nhuộm Gram: Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan mạch là Christian Gram và những người cộng tác đưa ra THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 30 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm năm 1884 Với phương pháp nhuộm này người ta có thể phân biệt vi sinh. .. kết quả cấy  Thay vì dùng nước cất ta có thể sử dụng môi trường tăng sinh để pha loãng 3.3 Các phương phấp cấy: Các loại môi trường gieo cấy: THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 16 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm  Đối với những ống nghiệm chứa thạch đứng thường dùng để cấy sâu đối với các vi sinh vật kị khí THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 17 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm 3.4 Quy trình cấy: 3.4.1 Dụng cụ và dung dịch cần chuẩn... ống nghiệm cho miệng ống nghiệm quay xuống dưới để tránh vi c nhiễm khuẩn lúc gieo cấy Đưa ống nghiệm có VSV đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho gần đáy ống nghiệm THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 28 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm 5.3 Các bước tiến hành kỹ thuật cấy ria trên ống nghiệm thạch nghiêng Sử dụng các ống nghiệm đã chuẩn bị sẳn từ bài 2: ống thạch nghiêng môi trường Cao thịt – pepton và Czapek-Dox Ông nghiệm. .. LOẠI VI SINH VẬT 3.1 Kỹ thuật gieo cấy: 3.1.1 Mục tiêu: • Thực hiện được thí nghiệm lấy mẫu phân tích • Thực hiện được kỹ thuật pha loãng bậc 10 • Thực hiện được kỹ thuật hộp trãi và hộp đổ 3.1.2 Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật: • Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài • Môi trường và dụng cụ cấy đều phải... sinh vật gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác nhau, các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về các chất dinh dưỡng (tuỳ thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật) cho nên có rất nhiều công thức pha chế môi trường nuôi cấy với các loại chất khác nhau và thành phần cũng khác nhau THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 14 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm BUỔI 3 KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LOẠI VI. .. 1884 Với phương pháp nhuộm này người ta có thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương G+ và nhóm Gram âm G Vi sinh vật bắt màu tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh vật Gram dương (bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm men, cầu khuẩn) Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là Gram âm như trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn, não mô cầu... bằng cồn Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương - Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm 6.1.2.2 Cách tiến hành Bước 1: Chuẩn bị một hộp sữa chua TH true YOGURT( vi sinh vật cần quan sát) Lấy một lượng ít và pha loãng vì khi pha loãng số lượng vi sinh vật ít... hơn cho vi c nuôi cấy vi sinh vật) và một số ống để bình thường Khi nghiêng ống môi trường dâng lên cách miệng ống 2 – 3 cm tức là 2/3 ống nghiệm Không được để môi trường chảy gần nút bông và miệng ống Thạch đặt nghiêng  Nhúng nước vào bông thấm nước, đắp lên ống nghiệm đã được đặt nghiêng để môi trường mau đông THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 12 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm 2.3 Quan sát kính hiển vi: 2.3.2... có mùi nồng của rượu, thơm, lên men đều hk bị sượng, hơi ngọt do bổ sung đường trễ, qui trình làm cơm rượu thành công BÀI 5 KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT 5.1 Nguyên Tắc Nuôi Cấy Và Phân Lập Vi Sinh Vật Mục đích của vi c gieo cấy VSV để nhân giống VSV; phát hiện sự có mặt của VSV trong các mẫu cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa của đối tượng vsv mục tiêu ... BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT VÀ NHUỘM GRAM 6.2 Kỹ thuật làm tiêu quan sát vi sinh vật 6.1.1 Kỹ thuật làm tiêu quan sát vi sinh vật trạng thái sống 6.1.1.1 Tạo tiêu quan sát vi sinh vật trạng thái... Page 30 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm năm 1884 Với phương pháp nhuộm người ta phân biệt vi sinh vật thành nhóm: Gram dương G+ nhóm Gram âm G Vi sinh vật bắt màu tím sau nhuộm gọi vi sinh vật Gram... 5,7 TIẾT 7-11 Page 16 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm  Đối với ống nghiệm chứa thạch đứng thường dùng để cấy sâu vi sinh vật kị khí THỨ 5,7 TIẾT 7-11 Page 17 Thí nghiệm vi sinh thực phẩm 3.4 Quy trình