Y GIÁO TẾ DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Mã số: 62.73.15.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ Công trình hoàn thành tại: Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ (2013), Phân lập xây dựng chất chuẩn crinamidin từ TNHC (Crinum latifolium L Amaryllidaceae), Tạp chí Dược học, số 441, tr 38-41 Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Lê Minh Thắng, Kiều Lê Thanh Thảo, Võ Thị Bạch ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Huệ (2013), Định lượng đồng thời alcaloid (crinamidin, 6hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin, 6-hydroxyundulatin) từ cao chiết TNHC (Crinum latifolium) sắc ký Người hướng dẫn khoa học: PGS TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ Bạch Huệ (2013), Xác định hàm lượng astragalin isoquercitrin TNHC (Crinum latifolium) sắc ký lỏng hiệu cao điện di mao quản, Tạp chí dược học, số 443, tr 53-58 Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại: Vào …… …… ngày …… tháng …… năm …… - Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM Thư viện Đại học Y Dược TPHCM Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Quang Anh Nguyet (2011), “Influence of pH on the separation of Crinum latifolium alakloids by thin layer chromatography and column chromatography”, Conference proceeding, the 2nd analytica Vietnam conference 2011, pp 213-216 Nguyen Huu Lac Thuy, Nguyen Dang Khoa, Nguyen Thi Ngoc Yen, Vo Thi Bach Hue (2011), “Extraction and preliminary screening for AChE inhibitor activity of Crinum latifolium L leaves extracts”, Conference proceeding, The 2nd Analytica VietNam Conference 201, pp 249-254 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Le Quang Hanh Thu (2011), “Antioxidant activity of extracts from Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 607-611 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Có thể tìm hiểu luận án tại: lỏng hiệu cao, Tạp chí dược học, số 442, tr 52-56 Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Trịnh Thị Thanh Nhã, Phan Thanh Dũng, Võ Thị Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Ngoc Yen (2011), “Isolation and identification of alkaloidal composition from the roots of Crinum latifolium L Amaryllidaceae by silica gel coated buffer on chromatographic column technique”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 600-603 Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang (2011), “Isolation and identification of isoquercitrin from the leaves of Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 604-606 24 Quy trình định tính - định lượng alcaloid flavonoid: - Luận án xây dựng quy trình định lượng alcaloid flavonoid TNHC Trong đó: - quy trình phân tích đồng thời alcaloid HPLC/ CE - quy trình phân tích đồng thời flavonoid HPLC/ CE - Phương pháp DVT–SKLM DVT–HPLC: sử dụng đề phân biệt chống nhầm lẫn dược liệu nguồn cung CĐC chưa ổn định GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Các tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm bột TNHC: - Hai tiêu cần thiết tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu tiêu định tính phương pháp dấu vân tay tiêu định lượng phương pháp HPLC với CĐC đánh dấu đặc trưng cho TNHC KIẾN NGHỊ Các kết nghiên cứu đạt sở khoa học để thực nội dung nghiên cứu sâu cho dược liệu TNHC: Từ kết chất đối chiếu thiết lập, quy trình phân tích thẩm định tiêu chuẩn kiểm nghiệm báo cáo nội dung luận án sở khoa học để tiến hành xây dựng “Chuyên luận dược liệu TNHC” cho Dược điển Việt Nam lần xuất tới Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên hiệu chiết xuất phương pháp SFE mẫu bột TNHC Từ tiến hành thử nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết hiệu chiết xuất cao Khảo sát tác dụng sinh học in vitro in vivo hợp chất tinh khiết phân lập để khẳng định thêm công dụng TNHC công dụng kháng khối u, tăng cường miễn dịch v.v… công bố trước Đặt vấn đề - Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) dược liệu sử dụng phổ biến thực phẩm chức năng, dạng bào chế thuốc để điều trị dạng u xơ tử cung, u tuyến tiền liệt - Thành phần hóa học tác dụng sinh học TNHC nhiều tác giả quan tâm có nhiều công trình công bố Tuy nhiên nghiên cứu lĩnh vực kiểm nghiệm hạn chế DĐVN IV chưa có chuyên luận cho TNHC Do đó, công tác đảm bảo chất lượng nguyên liệu chế phẩm có TNHC chưa thực cách chặt chẽ Nguyên nhân chủ yếu thành phần hóa học dược liệu chưa công bố cách toàn diện; chưa có công trình khoa học khẳng định chất đánh dấu hoàn toàn chưa có chất đối chiếu (CĐC) có nguồn gốc từ dược liệu phân phối hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia Với mong muốn giải bất cập công tác “Đảm bảo chất lượng” cho nguyên liệu TNHC, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid flavonoid cho Trinh Nữ Hoàng Cung – Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” với nội dung nghiên cứu sau: Chiết xuất cao cồn, phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid phân lập hợp chất tinh khiết từ Trinh nữ hoàng cung Thiết lập số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ Trinh nữ hoàng cung Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid flavonoid Trinh nữ hoàng cung phương pháp HPLC CE Đề xuất số tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu bột Trinh nữ hoàng cung 2 23 Tính cấp thiết đề tài: chưa có công trình khoa học xác định toàn diện thành phần hóa học chưa có tài liệu xác định chất đánh dấu chưa có quy trình định lượng đồng thời số chất đánh dấu thành phần TNHC Hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp CĐC có nguồn gốc từ TNHC Tuy nhiên, thực tế TNHC sử dụng phổ biến Vì kết nghiên cứu luận án giải bất cập công tác quản lý đảm bảo chất lượng dược liệu sản phẩm có thành phần TNHC Đây ưu điểm tiêu chuẩn kiểm nghiệm HPLC phương pháp có độ xác cao, khuyến khích ứng dụng vào kiểm nghiệm mẫu đa thành phần mẫu sinh học hay mẫu từ dược liệu Phương pháp dấu vân tay với chi tiết đặc trưng cho thành phần hoạt chất TNHC góp phần đánh giá chặt chẽ chất lượng dược liệu Những đóng góp luận án: Luận án đạt số kết mới, đóng góp vào công trình nghiên cứu cho TNHC sau: Ứng dụng phương pháp SFE vào chiết alcaloid từ TNHC Phân lập đươc 17 hoạt chất từ phận TNHC Trong có alcaloid mới, cấu trúc 6-ethoxyundulatin Các hợp chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin isoquercitrin phân lập lần từ TNHC Thiết lập CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin, astragalin isoquercitrin Hiện tại, CĐC chưa phân phối hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia Xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình phân tích alcaloid flavonoid HPLC CE Các quy trình chưa công bố công trình nước giới Đề xuất số tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC Hiện DĐVN IV Dược điển nước chưa có chuyên luận Bố cục luận án: có 120 trang chính: đặt vấn đề (2); chương 1: TQTL (24); chương 2: PPNC (13); chương 3: KQNC (62), chương BL (16); kết luận (2); kiến nghị (1) Và danh mục công trình (1); TLTK (12) KẾT LUẬN Luận án hoàn thành nội dung nghiên cứu đạt tất mục tiêu đề ban đầu, tóm tắt kết đạt sau: Chiết xuất hoạt chất từ TNHC: xây dựng quy trình chiết xuất cao toàn phần từ TNHC - Quy trình quy trình chiết cao cồn, PĐ alcaloid flavonoid phương pháp ngấm kiệt với cồn 70% - Quy trình có kết hợp phương pháp SFE ngấm kiệt để chiết cao ban đầu với mục đích phân lập CĐC khảo sát thành phần hóa học Phân lập hợp chất tinh khiết: 17 hợp chất phân lập - Trong số có: alcaloid 6-ethoxyundulatin hợp chất Và có chất lần phân lập từ TNHC: 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin, flazin, kaempferol, isoquercitrin, esuletin, phydroxybenzoic Các hợp chất lại công bố trước phận khác TNHC Thiết lập chất đối chiếu: - hợp chất có nguồn gốc từ TNHC đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ cấp với liệu gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR - Gồm alcaloid: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin flavonoid: astragalin isoquercitrin 22 tiến hành đánh giá quy trình chiết xuất, phân lập để thiết lập CĐC Các bước thực theo hướng dẫn ASEAN, ấn quy trình thiết lập CĐC hóa học - Bên cạnh đó, lycorin hippadin thiết lập CĐC hợp chất có độ tinh khiết cao hiệu suất phân lập lớn Lycorin alcaloid có nhiều hoạt tính sinh học chất đại diện cho nhiều loài chi Crinum Hiện hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp CĐC thị trường Kết đóng góp thêm vào danh mục CĐC có nguồn gốc từ dược liệu vốn khan NỘI DUNG LUẬN ÁN 4.4 Các quy trình định tính – định lượng alcaloid flavonoid: Alcaloid flavonoid TNHC định tính – định lượng HPLC CE cho kết không sai biệt - Với quy trình định lượng alcaloid HPLC: nên ý pH pha động ảnh hưởng lớn đến AF Rs pic định lượng Với mẫu flavonoid cần ý đến ảnh hưởng dung môi hữu lên độ bất đối AF pic cần định lượng, acetonitril hiệu methanol - Với quy trình định lượng alcaloid CE: cần ý mẫu thử alcaloid nên pha acid, kỹ thuật rửa giải MEKC ảnh hưởng nhiều đến kết phân tích Trong mẫu flavonoid cần kỹ thuật CZE đáp ứng yêu cầu phân tích - Phương pháp dấu vân tay: ứng dụng để tiêu chuẩn hóa dược liệu sản phẩm từ dược liệu nguồn cung cấp CĐC chưa đầy đủ 4.5 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC - Chỉ tiêu định tính hai nhóm hoạt chất alcaloid flavonoid phương pháp dấu vân tay - Chỉ tiêu định lượng hai nhóm hoạt chất alcaloid flavonoid hương pháp HPLC xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình phân tích định lượng Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Thực vật học TNHC: Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên Amaryllidaceae Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung, Hoàng cung trinh nữ, Tỏi lơi rộng, Náng rộng Đặc điểm hình thái: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía có thân giả ngắn bẹ ôm sát làm thành Phiến dạng bản, màu xanh nhạt, mép lượn sóng Cụm hoa tán, có 10-20 hoa Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng Nhị rời nhau; màu trắng, bao phấn màu vàng ô Bầu hạ, ô Vòi nhụy dạng sợi - Thành phần hóa học tác dụng sinh học: Có nhóm hoạt chất alcaloid (36) flavonoid (8); có nhóm coumarin, carbohydrat Các tác dụng kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa kích thích miễn dịch - Các phương pháp chiết hoạt chất khảo sát hóa học Hoạt chất chiết phương pháp ngấm kiệt, ngâm; đun hồi lưu Các hợp chất tinh khiết phân lập kỹ thuật sắc ký cột sắc ký lớp mỏng chế hóa Thành phần alcaloid TNHC xác định phương pháp GC, UV, HPLC - Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: Theo hướng dẫn ASEAN 4 21 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu alcaloid flavonoid TNHC điều chỉnh, lượng mẫu nhỏ, hiệu suất chiết cao phương pháp khác; thời gian, bước tiến hành thiết bị phổ biến PTN - Chiết cao nguyên liệu từ để làm thuốc thực phẩm chức năng: nguyên liệu lựa chọn suất thu hoạch lớn thân hành hay rễ đồng thời bảo tồn nguồn giống, phương pháp chiết ngấm kiệt thông dụng qui mô công nghiệp, trang thiết bị cách vận hành đơn giản thiết kế phù hợp để chiết nhiều cỡ mẫu 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1 Các phương pháp chiết xuất: - Chiết ngấm kiệt, chiết với hỗ trợ sóng siêu âm: nghiên cứu điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu - Chiết dung môi lỏng siêu tới hạn (SFE): khảo sát yếu tố áp suất, thời gian, tỷ lệ dung môi hỗ trợ 2.2.2 Phương pháp phân lập chất tinh khiết: - Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không sắc ký cột cổ điển - Biện giải cấu trúc phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR 2.2.3 Phương pháp HPLC, CE dấu vân tay: Khảo sát điều kiện để xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid flavonoid TNHC Quy trình phải đạt yêu cầu thẩm định - Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid flavonoid từ TNHC (dung môi chiết, số lần chiết) dung môi pha mẫu - Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ pH pha động, kỹ thuật rửa giải - Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ đệm, pH dung dịch đệm); nồng độ SDS - Phương pháp dấu vân tay: - SKLM: khảo sát điều kiện phân tích dung môi thuốc thử phát để xác định đặc trưng DVT– SKLM hai nhóm hoạt chất alcaloid flavonoid TNHC qua hệ số Rf màu sắc vết đặc trưng - HPLC: ứng dụng điều kiện phương pháp HPLC vào phân tích vân tay cho dược liệu TNHC Ghi nhận thời gian lưu, phổ 4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết: - Luận án sử dụng kỹ thuật phân lập hợp chất tinh khiết sắc ký cột Alcaloid TNHC tập trung nhiều nhóm alcaloid khung crinin, cấu trúc độ phân cực tương tự Vì vậy, dung môi rửa giải phải điều chỉnh tăng độ phân cực chậm để tránh dồn vết - Chất hấp phụ silica gel tẩm đệm pH thay đổi tùy tính chất mẫu; sở phương trình Henderson – Hasselbalch với mục tiêu giảm thiểu tối đa kéo đuôi vết Kết khảo sát cho thấy, alcaloid TNHC thích hợp với silica gel tẩm đệm pH 9; flavonoid TNHC phù hợp với silica gel tẩm đệm pH - Đối với mẫu có nhiều tạp chất, cần phải kết hợp nhiều kỹ thuật đồng thời chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột silica gel pha đảo, sắc ký cột với silica gel pha thuận trường hợp 6-ethoxyundulatin 6ethoxybuphanidirin Luận án xây dựng liệu phổ học cho 17 hợp chất từ TNHC, đặc biệt liệu phổ học hợp chất alcaloid phân lập tự nhiên 11 alcaloid thuộc khung crinin - khung alcaloid đại diện cho loài chi Crinum 4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết TNHC: - Sau trình nghiên cứu, nhận thấy crinamidin, 6-hydroxycrinmidin alcaloid; astragalin, isoquercitrin flavonoid chọn làm chất đánh dấu cho dược liệu TNHC Vì chất 20 Cách tiến hành: Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu Phép thử có giá trị độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic astragalin isoquercitrin không lớn 2,0% Tiến hành sắc ký dung dịch thử dung dịch đối chiếu Dựa vào diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch đối chiếu nồng độ astragalin (C21H20O11) isoquercitrin (C21H20O12) đối chiếu, tính hàm lượng hai flavonoid astragalin isoquercitrin dược liệu Đánh giá: dược liệu phải chứa 250 µg/g astragalin (C21H20O11) 100 µg/g isoquercitrin (C21H20O12) tính dược liệu khô kiệt UV-Vis, % diện tích pic đặc trưng Xác định DVT– HPLC hai nhóm hoạt chất TNHC 2.2.4 Phương pháp thiết lập CĐC: Thực theo hướng dẫn ASEAN, ấn quy trình thiết lập CĐC hóa học thứ cấp 2.2.5 Đề xuất số tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu TNHC: - Các tiêu hóa lý thông thường dược liệu phương pháp thực theo hướng dẫn DĐVN IV - Chỉ tiêu định tính bằng phương pháp dấu vân tay khảo sát với CĐC alcaloid CĐC flavonoid đánh dấu - Chỉ tiêu định tính định lượng phương pháp HPLC khảo sát với CĐC alcaloid CĐC flavonoid đánh dấu Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ TNHC Hai nhóm hoạt chất TNHC xác định gồm alcaloid flavonoid Tùy vào mục tiêu sử dụng hay nghiên cứu thành phần mà lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp - Chiết cao TNHC để khảo sát thành phần hóa học thiết lập CĐC: Đối với nguyên liệu lá: mục tiêu khảo sát toàn diện thành phần hóa học, phương pháp SFE lựa chọn để chiết hoạt chất giai đoạn đầu dược liệu sau chiết ngấm kiệt Cao chiết đa dạng thành phần dung môi chiết trãi rộng độ phân cực Đối với nguyên liệu rễ thân hành: kết khảo sát cho thấy SFE cho hiệu tương đương với chiết ngấm kiệt Vì hoạt chất chiết phương pháp chiết ngấm kiệt - Chiết hoạt chất để phân tích định tính – định lượng: chiết với hỗ trợ sóng siêu âm chọn lựa yếu tố ảnh hưởng dễ Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Các quy trình chiết cao cồn, alcaloid flavonoid từ TNHC Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid flavonoid phương pháp ngấm kiệt: - Chiết cao cồn: dược liệu làm ẩm dung môi khoảng 12 Cho dung môi ngập dược liệu 1- cm, ngâm khoảng 24 Rút dịch chiết đến âm tính với TT Dragendorff TT FeCl3 1% Tỷ lệ dung môi/dược liệu (10 : 1) Gộp dịch chiết, lọc cô đến cao đặc - Chiết flavonoid: cao cồn siêu âm với HCl 1% Lắc với ethyl acetat đến âm tính với TT FeCl3 1% Gộp dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid - Chiết alcaloid: dịch acid sau chiết flavonoid kiềm hóa amoniac 25% đến pH 9-10 Lắc với cloroform đến âm tính với TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid 6 19 Chiết alcaloid flavonoid từ TNHC kết hợp phương pháp: - Chiết alcaloid flavonoid phương pháp SFE: thiết bị hệ thống chiết lưu chất CO2 Đài loan sản xuất với ba bình chiết lắp song song, thể tích 20 lít/bình Điều kiện SFE: áp suất 200 bar, nhiệt độ 50 oC, thời gian chiết giờ, 15% cồn 96% Dịch SFE thu hồi dung môi (cao L-SFE) Cao L-SFE hòa tan với HCl 1% Dịch acid chiết flavonoid FL-SFE alcaloid AL-SFE - Chiết alcaloid flavonoid phương pháp ngấm kiệt: bột sau chiết SFE tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70% Dịch chiết cồn chiết flavonoid FL-NK alcaloid AL-NK đối thời gian lưu diện tích crinamidin 6-hydroxycrinamidin không lớn 2,0% Tiến hành sắc ký dung dịch thử dung dịch đối chiếu Dựa vào diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch đối chiếu nồng độ crinamidin (C17H19NO5) 6-hydroxycrinamidin (C17H19NO6) đối chiếu, tính hàm lượng hai alcaloid crinamidin 6-hydroxycrinamidin dược liệu Đánh giá: dược liệu phải chứa 120 µg/g crinamidin (C17H19NO5) 100 µg/g 6-hydroxycrinamidin (C17H19NO6) tính dược liệu khô kiệt 3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC - Các PĐ alcaloid flavonoid chiết từ phận TNHC, sau tách PĐ VLC phân lập hợp chất CC - Sử dụng chất hấp phụ silica gel tẩm đệm pH mẫu phân lập alcaloid; silica gel pH cho mẫu phân lập flavonoid - Riêng 6-ethoxyundulatin (2) 6-ethoxybuphanidirn (3) phải qua giai đoạn: chiết lỏng – lỏng với ether ethylic để tách lấy nhóm phân cực từ PĐ AL-SFE Sử dụng lần sắc ký cột, lần đầu sử dụng chất hấp phụ silica gel RP-18 để loại tạp dầu béo, sau silica gel cỡ hạt nhỏ rửa giải n–hexan với tốc độ chậm để tránh dồn vết Kết quả: phân lập 17 hợp chất từ cao TNHC Trong đó: - alcaloid công bố lần đầu tiên, cấu trúc xác định 6-ethoxyundulatin - hợp chất công bố từ dược liệu khác, lần công bố từ TNHC: kaempferol, isoquercitrin, flazin, esuletin, phydroxybenzoic, 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin - hợp chất công bố trước từ TNHC: hippadin, augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin astragalin Định lượng flavonoid: Pha động: methanol – dung dịch acid phosphoric pH (20 : 80) Dung dịch đối chiếu: hòa tan astragalin isoquercitrin để có dung dịch đối chiếu có nồng độ 250 µg/ml 100 µg/ml Dung dịch thử: cân xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm 30 phút nhiệt độ 50 ± oC (x lần Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội, acid hóa dịch chiết bằng dung dịch acid hydrocloric 1% (TT) đến pH – Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy flavonoid cách lắc hỗn hợp bình lắng với 30 ml ethyl acetat (TT) (x lần) Cô dịch chiết ethyl acetat đến cạn dung môi, thu cắn flavonoid Hòa tan phần cắn bình định mức 10 ml với dung môi pha động, thêm dung môi đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký:Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C8 (5 µm) Detector: PDA, bước sóng 265 nm Rửa giải isocratic Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl 18 B Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu cao: bước tiến hành phương pháp đánh giá thực theo Mục 3.4.6 Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất alcaloid flavonoid Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 3.3 Thiết lập chất đối chiếu - Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg chất đánh dấu TNHC chọn để thiết lập CĐC - nguyên liệu chọn để thiết lập CĐC: alcaloid crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin; flavonoid astragalin isoquercitrin 3.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC - Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết HPLC: Định lượng alcaloid: Pha động: Dung môi A: methanol Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 0,2% TEA Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin 6-hydroxycrinamidin pha động để có dung dịch đối chiếu có nồng độ 150 µg/ml 100 µg/ml Dung dịch thử: cân xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm 30 phút nhiệt độ 50 ± oC (x lần Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội, kiềm hóa dịch chiết bằng dung dịch amoniac 25% (TT) đến pH – 10 Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy alcaloid cách lắc hỗn hợp bình lắng với 30 ml cloroform (TT) (x lần) Cô dịch chiết cloroform đến cạn dung môi, thu cắn alcaloid Hòa tan phần cắn bình định mức 10 ml với dung hỗn hợp dung môi A B (25 : 75), thêm dung môi đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C8 (5 µm) Detector: PDA, bước sóng 214 nm Rửa giải gradient Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Cách tiến hành: Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu Phép thử có giá trị độ lệch chuẩn tương Điều kiện phân tích: cột: C8 Phenomenex (250 x 4,6 mm; m); nhiệt độ cột: 40 oC; detector PDA; tốc độ dòng ml/phút - Mẫu thử: nguyên liệu CĐC pha 100 μg/ml pha động - Thành phần pha động chất trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.13 Thành phần pha động quy trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu CĐC phương pháp HPLC Tên chất khảo sát Thành phần tỷ lệ pha động Crinamidin Methanol – acid phosphoric pH (35 : 65) 6-hydroxycrinamidin Methanol – acid phosphoric pH (35 : 65) Lycorin Methanol – acid phosphoric pH (10 : 90) Hippadin Methanol – acid phosphoric pH (70 : 30) Astragalin Acetonitril – acid phosphoric pH (25 : 75) Isoquercitrin Acetonitril – acid phosphoric pH (25 : 75) Xác định tính phù hợp hệ thống: hệ số sắc ký đạt yêu cầu, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Thẩm định quy trình: - Tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng tín hiệu vị trí thời gian lưu pic sắc ký đồ mẫu thử - Tính tuyến tính: tiêm nồng độ chất từ 10  500 (µg/ml) 8 17 Phương trình hồi qui hệ số tương quan sau: Crinamidin: ŷ = 70299x R2 = 0,9994 6-hydroxycrinamidin: ŷ = 149967x R2 = 0,9996 Lycorin: ŷ = 9088x R2 = 0,9999 Hippadin: ŷ = 58426x R2 = 0,9990 Astragalin: ŷ = 21716x R2 = 0,9969 Isoquercitrin: ŷ = 17244x R2 = 0,9991 Nhận xét: có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic CĐC khoảng nồng độ khảo sát (R2 > 0,998) - Độ xác: Kết khảo sát trình bày Bảng 3.2 RSD% độ tinh khiết sắc ký pic < 2% Như vậy, quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký CĐC đạt yêu cầu độ xác Bảng 3.15 Kết độ tinh khiết sắc ký (%) CĐC HPLC Tên chất đối chiếu Độ tinh khiết sắc ký (%) Crinamidin 98,71% (RSD% = 0,02) 6-hydroxycrinamidin 96,78 % (RSD% = 0,08) Lycorin 99,99% (RSD% = 0,03) Hippadin 99,92% (RSD% = 0,02) Astragalin 98,29% (RSD% = 0,11) Isoquercitrin 98,12% (RSD% = 0,03) - Độ đúng: chưa thực hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia chưa phân phối chất đối chiếu gốc 3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đối chiếu - Tính chất: alcaloid bột kết tinh màu trắng, flavonoid bột kết tinh màu vàng - DVT– HPLC alcaloid: mẫu thử có pic đặc trưng sau: Pic diện tích (%) 9,0 ± 0,5 (6-hydroxycrinamidin) 21,9 10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin) 17,8 13,5 ± 0,5 (crinamidin) 13,7 18,0 ± 0,5 (6-hydroxybuphanidrin) 20,8 20,5 ± 0,5 (6-hydroxyundulatin) 18,3 23,5 ± 0,5 (undulatin) 7,6 Thời gian lưu (phút) Phổ UV-Vis Các pic alcaloid có phổ UV tương tự: λmax = 214 nm vai 281 nm 3.5 Đề xuất số tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho bột TNHC Một số tiêu phương pháp thử để đánh giá chất lượng bột TNHC sau: Một số tiêu TCKN TNHC Lá phơi sấy khô Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) Mô tả: khô có màu từ vàng nâu đến nâu sẫm, dai, mùi hăng đặc biệt, dài 50 - 90 cm, rộng khoảng - cm Vị đắng Bột: mùi hăng, vị đắng Mảnh biểu bì mang lỗ khí có tinh thể calci oxalat hình kim, tế bào hình đa giác thuôn dài Mảnh mạch xoắn Hạt tinh bột riêng lẻ, dạng hình bầu dục, tễ có hình Cuộn sợi nhiều, sợi vách dày, khoang hẹp Độ ẩm: không 12% (DĐVN IV - Phụ lục 9.6) Tro không tan acid HCl: ≤ 2% (DĐVN IV - Phụ lục 9.7) Tro toàn phần: không 15% (DĐVN IV - Phụ lục 9.8) Định tính: định tính hai nhóm hoạt chất alcaloid flavonoid Có thể thực theo hai phương pháp sau: A Phương pháp dấu vân tay sắc ký lớp mỏng: bước tiến hành phương pháp đánh giá thực theo Mục 3.4.6 16 3.4.6 Phương pháp dấu vân tay định tính alcaloid flavonoid Mẫu thử: alcaloid AL-SA flavonoid FL-SA Mẫu đối chiếu: chất đối chiếu phần định lượng alcaloid flavonoid phương pháp HPLC - Điểm chảy: thực theo hướng dẫn DĐVN IV-Phụ lục 6.7 - Định tính: phương pháp phổ nghiệm Phổ UV-Vis: mẫu hòa tan methanol, nồng độ 10 µg/ml Quyét phổ khoảng bước sóng từ 200 – 800 nm Phổ MS: xác định pic (m/z) Phổ IR: dập viên KBr Xác định dao động đặc trưng Phổ NMR: xác định độ dịch chuyển proton carbon Dữ liệu phổ CĐC criamidin: Phương pháp DVT – SKLM: Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254; chiều dài 10 cm; chiều rộng vết khoảng 1cm; khai triển lần nhiệt độ phòng Dung môi: Mẫu thử alcaloid: cloroform – methanol – dd amoniac (5 : : 0,05) Mẫu thử flavonoid: cloroform – methanol – acid formic (3 : : 1) Tiến hành: chấm riêng biệt mỏng khoảng 20 μl dung dịch thử đối chiếu Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Quan sát ánh sáng tử ngoại màu TT Dragendorff (alcaloid) TT FeCl31% (flavonoid) Phát hiện: đèn UV 254 365 nm TT Dragendorff Đánh giá: sắc ký đầy DVT – SKLM alcaloid TNHC phải có vết có màu sắc tương đương Rf với vết CĐC tương ứng Phương pháp DVT – HPLC Điều kiện: điều kiện sắc ký, bước tiến hành xác định DVT alcaloid Mục 3.4.2; xác định DVT flavonoid TNHC Mục 3.4.3 Đánh giá: chọn pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% λ = 214 nm (alcaloid); λ = 265 nm (flavonoid) để ghi nhận thời gian lưu tương đối, % diện tích pic phổ UV - DVT– HPLC flavonoid: mẫu thử có pic đặc trưng sau: Pic Thời gian lưu (phút) 11,5 ± 0,5 (isoquercitrin) 18,5 ± 0,5 (astragalin) % diện tích 29,5 70,5 Phổ UV-Vis λ = 254 355 (nm) λ = 265 346 (nm) - UV/methanol: max (nm) 212 286 - IR (KBr): υmax (cm-1) 3200 (-OH); 1616 (C=C); 1046 (-OCH2O-) - ESI-MS (+): m/z = 318,46 [M+H]+, M phù hợp với công thức nguyên C17H19NO5 - 1H-NMR (500 MHz, CDC13): δH (ppm) 1,59 (2H; m; H-4); 2,02 (1H; m; H-11); 2,39 (1H; dt; J=6; 11,5 Hz; H-11*); 2,79 (1H; m; H-12); 3,17 (1H; m; H-4a); 3,17 (1H; m; H-12*); 3,27 (1H; t; J = 2,5 Hz; H2); 3,70 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6β); 3,76 (1H; d; J = Hz; H-1); 3,97 (3H; s; H-14); 4,18 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6α); 4,47 (1H; d; J = 2,5 Hz; H-3); 5,87 (2H; dd; J = 6,5; 1,5 Hz; H-13); 6,63 (1H; s; H-10) - 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 29,7 (C-4); 39,1 (C-11); 41,7 (C-10b); 52,6 (C-12); 53,8 (C-1); 56,5 (C-2); 58,5 (C-6); 59,1 (C-14); 61,0 (C-4a); 65,2 (C-3); 96,5 (C-10); 100,7 (C-13); 117,5 (C6a); 133,4 (C-8); 138,7 (C-10a); 141,1 (C-7); 148,2 (C-9) Dữ liệu phổ CĐC 6-hydroxycriamidin: - UV/methanol: max (nm) 212 286 - IR (KBr): υmax (cm-1) 3508 (-OH); 1616 (C=C); 1286 (-OCH3); 1037 (-OCH2O-) - ESI-MS (+): m/z = 334,38 [M+H]+ ]+, M phù hợp với công thức nguyên C17H19NO6 10 15 - 1H-NMR (500 MHz, CDCl3+MeOD): δH (ppm) 1,52 (1H; m; H-4β); 1,60 (1H; m; H-4α); 1,77 (1H; m; H-11); 2,35 (1H; m; H-11*); 2,70 (1H; m; H-12); 3,12 (1H; m; H-12*); 3,28 (1H; brt; H-2); 3,68 (1H; dd; J = 13,5; 10 Hz; H-4a); 3,74 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-1); 4,05 (3H; s; H-14); 4,43(1H; d; J = Hz; H-3); 5,19 (1H; s; H-6); 5,90 (2H; d; J = Hz; H-13); 6,65 (1H; s; H-10) - 13C-NMR (125 MHz, CDCl3+MeOD): δC (ppm) 28,7 (C-4); 35,5 (C11); 42,1 (C-10b); 46,3 (C-12); 53,7 (C-1); 54,6 (C-4a); 56,4 (C-2); 59,7 (C-14); 64,9 (C-3); 85,2 (C-6); 96,7 (C-10); 101,2 (C-13); 119,3 (C-6a); 134,4 (C-8); 139,2 (C-10a); 142,9 (C-7); 149,8 (C-9) Dữ liệu phổ CĐC lycorin: 3.4.5 Quy trình định lượng đồng thời flavonoid CE - Điều kiện điện di: điều kiện điện di tương tự quy trình định lượng alcaloid Dung dịch điện di dinatri tetraborat 45 mM; điều chỉnh đến pH 9,0 acid boric, phối hợp với methanol để dung dịch điện di có 10% methanol Kỹ thuật điện di vùng CZE Khảo sát tính phù hợp hệ thống: quy trình đạt yêu cầu Thẩm định quy trình phân tích: quy trình đạt yêu cầu tính đặc hiệu; tính tuyến tính (R2 ≥ 0,998); độ xác (RSD kết định lượng ≤ 5,3%); độ với tỷ lệ phục từ 90 – 107% - UV/methanol: max (nm) 238 288 - IR (KBr): υmax (cm-1) 3333 (-OH); 1500 (C=C); 1018 (-OCH2O-) - ESI-MS (+): m/z = 288,44 [M+H]+, M phù hợp với công thức nguyên C16H17NO4 - 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 2,20 (1H; m; H-12); 2,442,50 (2H; m; H-11); 2,49 (1H; overlapped; H-10b); 2,60 (1H; d; J =10,5 Hz; H-4a); 3,19 (1H; m; H-12*); 3,32 (1H; d; J = 14,5 Hz; H6β); 3,97 (1H; br s; H-2); 4,01 (1H; d; J = 14 Hz; H-6α); 4,27 (1H; brs; H-1); 4,78 (1H; d; J = Hz; 1-OH); 4,89 (1H; d; J = 6,5 Hz; 2-OH); 5,36 (1H; brt; H-3); 5,94-5,95 (2H; 2d; J = 0,5; Hz; H-12); 6,67 (1H; s; H-7); 6,80 (1H; s; H-10) - 13C-NMR (125 MHz): δC (ppm) 28,1 (C-11); 40,2 (C-10b); 53,3 (C12); 56,7 (C-6); 60,8 (C-4a); 70,2 (C-1); 71,7 (C-2); 100,5 (H-12); 105,0 (C-10); 106,9 (C-7); 118,4 (C-3); 129,6 (C-6a); 129,7 (C-10a); 141,7 (C-4); 145,2 (C-8); 145,6 (C-9) Dữ liệu phổ CĐC hippadin: - UV/methanol: max (nm) 247; 297 349 Bảng 3.28 Kết định lượng alcaloid TNHC (n = 6) Hàm lượng alcaloid TNHC (µg/g) Tên alcaloid HPLC CE µ = 145,3 ± 3,3 µ = 142,7 ± 4,7 Crinamidin (RSD = 2,16%) (RSD = 4,07%) µ = 112,1 ± 3,2 µ = 115,4 ± 4,4 6-hydroxycrinamidin (RSD = 2,68%) (RSD = 4,76%) µ = 345,9 ± 9,5 µ = 339,7 ± 13,1 6-hydroxypowellin (RSD = 2,63%) (RSD = 4,81%) µ = 421,1 ± 9,9 µ = 420,7 ± 14,8 6-hydroxybuphanidrin (RSD = 2,24%) (RSD = 4,38%) µ = 77,6 ± 2,6 µ = 75,7 ± 2,36 Undulatin (RSD = 3,17%) (RSD = 3,90%) µ = 286,4 ± 7,1 µ = 285,3 ± 8,5 6-hydroxyundulatin (RSD = 2,35%) (RSD = 3,71%) Bảng 3.31 Kết định lượng flavonoid TNHC (n = 6) Astragalin - IR (KBr): υmax (cm-1) 1675 (C=O); 1620 (C=C); 1036 (C-O) Isoquercitrin Hàm lượng flavonoid TNHC (µg/g) Phương pháp HPLC Phương pháp CE µ = 266,0 ± 6,2 µ = 261,9 ± 9,7 RSD = 2,21% RSD = 3,56% µ = 125,9 ± 2,6 µ = 126,0 ± 3,1 RSD = 1,99% RSD = 2,32% 14 11 3.4.1 Quy trình xử lý mẫu - Mẫu thử alcaloid: cân 10 g bột cho vào cốc, thêm 50 ml cồn 70%, siêu âm 30 phút nhiệt độ 50 ± oC (x lần) Toàn dịch chiết thu hồi dung môi, kiềm hóa amoniac 25% đến pH – 10 Chiết với 30 ml cloroform (x3 lần) Gộp toàn dịch cloroform, thu hồi dung môi đến cắn alcaloid AL-SA - Mẫu thử flavonoid: cân 10 g bột cho vào cốc 250 ml, thêm 50 ml cồn 70%, siêu âm 30 phút nhiệt độ 50 ± oC (x lần) Toàn dịch chiết thu hồi dung môi, sau acid hóa acid hydrocloric đến pH – Chiết với 30 ml ethyl acetat (x3 lần) Gộp toàn dịch ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cắn flavonoid FL-SA 3.4.2 Quy trình định lượng đồng thời alcaloid HPLC - ESI-MS (+): m/z = 286,31 [M+Na]+, M phù hợp với công thức nguyên C16H9NO3 - 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 6,16 (2H; s; H-12); 6,90 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-4); 7,47 (1H; t; J = Hz; H-2); 7,64 (1H; s; H-11); 7,74 (1H; d; J = Hz; H-3); 7,91 (1H; d; J = Hz; H-1); 7,97 (1H; s; H-8); 8,04 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-5) - 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 101,7 (C-11); 102,3 (C-12); 108,4 (C-8); 110,8 (C-4); 116,7 (C-11a); 118,4 (C-1); 122,6 (C-3); 122,6 (C-11b); 123,5 (C-5); 124,0 (C-2); 128,4 (C-3a); 131,0 (C-11c); 131,7 (C-7a); 148,6 (C-10); 152,6 (C-9); 158,2 (C-7) Dữ liệu phổ CĐC astragalin: - Các điều kiện sắc ký: cột C8 Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; m), - IR (KBr): υmax (cm-1) 3284 (OH); 1654 (C=O); 1068 (C-O) - ESI-MS (+): m/z = 471,31 [M+Na]+, M phù hợp với công thức nguyên C21H20O11 - 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 3,08 (2H; br s; H-3” H4”); 3,18 (1H; m; H-2”); 3,21 (1H; m; H-5”); 3,32 (1H; m, H-6”a); 3,56 (1H; dd; J = 11,5; Hz, H-6”b); 5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”); 6,21 (1H; d; J = Hz, H-8); 6,43 (1H; d; J = Hz, H-6); 6,88 (2H; d; J = Hz, H-3’, H-5’); 8,04 (2H; d; J = Hz, H-2’, H-6’); 10,19 (1H; s; 4’-OH); 10,87 (1H; s; 7-OH); 12,62 (1H; s; 5-OH) - 13C-NMR (125 MHz, DMSO): δC (ppm) phần đường 60,8 (C6”); 69,9 (C-4”); 74,2 (C-2”); 76,4 (C-5”); 77,5 (C-3”); 100,9 (C-1”); phần aglycon 93,63 (C-8); 98,7 (C-6); 104,0 (C-10); 115,1 (C-3’ 5’); 120,9 (C-1’); 130,9 (C-2’ 6’); 133,2 (C-3); 156,3 (C-5); 156,4 (C-2); 159,9 (C-4’); 161,2 (C-9); 164,10 (C-7); 177,46 (C-4) Dữ liệu phổ CĐC isoquercitrin: tốc độ dòng: ml/phút, bước sóng phát hiện: 214 nm, thể tích tiêm: 10 µl, nhiệt độ cột: 40 oC Rửa giải theo chương trình dung môi, pha động methanol; dung dịch acid H3PO4 pH 0,2% TEA 3.4.3 Quy trình định lượng đồng thời flavonoid HPLC - Điều kiện sắc ký: điều kiện sắc ký tương tự quy trình định lượng alcaloid Rửa giải đẳng dòng, pha động hỗn hợp dung môi acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH (20 : 80), bước sóng 265 nm 3.4.4 Quy trình định lượng đồng thời alcaloid CE - Điều kiện điện di: cột mao quản silica nung chảy chiều dài tổng cộng 64,5 cm; chiều dài hiệu 56 cm; đường kính 50 μm Thể tích tiêm mẫu 50 mbar x giây, điện 25 kV, nhiệt độ cột 25 oC, sước sóng phát 214 nm Dung dịch điện di dinatri tetraborat 25 mM; SDS 50 mM; điều chỉnh pH 9,5 natri hydroxid 1N, phối hợp để dung dịch điện di có 10% methanol Kỹ thuật điện di MEKC - UV/methanol: max (nm) 265 347 - UV/methanol: max (nm) 255 354 - IR (KBr): υmax (cm-1) 3219 (OH); 1662 (C=O); 1060 (C-O) 12 13 - ESI-MS (+): m/z = 487,33 [M+Na]+, M phù hợp với công thức nguyên C21H20O12 - 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δH (ppm) 3,08 (2H; overlapped; H3” H- 4”); 3,24 (1H; overlapped; H-5”); 3,24 (1H; overlapped; H2”); 3,32 (1H; overlapped, H-6”); 3,58 (1H; d; J = 11,5 Hz, H-6”); 5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”); 6,20 (1H; d; J = Hz, H-6); 6,40 (1H; d; J = Hz, H-8); 6,84 (1H; d; J = Hz; H-5’); 7,57 (1H; overlapped, H6’); 7,58 (H; overlapped, H-2’);12,62 (1H; s; 5-OH) - 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): phần đường δC (ppm) 61,0 (C-6”); 69,9 (C-4”); 74,1 (C-2”); 76,5 (C-5”); 77,5 (C-3”); 100,9 (C-1”); phần aglycon δC (ppm) (C-5’); 116,2 (C-2’); 121,1 (C-1’); 121,5 (C-6’); 144,8 (C-4’); 148,4 (C-3’); 93,5 (C-8); 98,6 (C-6); 103,9 (C-10); 115,2; 133,3 (C-3); 156,2 (C-5); 156,3 (C-2); 161,2 (C-9); 164,1 (C7); 177,4 (C-4) Bảng 3.18 Kết đánh giá đồng lô CĐC sau đóng gói - Xác định độ tinh khiết sắc ký: thực phương pháp HPLC Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: quy trình đạt yêu cầu Kết đánh giá độ tinh khiết sắc ký CĐC: kết trình bày Bảng 3.2 Các nguyên liệu CĐC có độ tinh khiết sắc ký ≥ 95% 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá CĐC: Các CĐC khảo sát xây dựng tiêu chuẩn đánh CĐC hóa học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng 3.2.4 Đóng gói đánh giá đồng nhất: Đóng gói: CĐC đóng lọ thủy tinh nâu tủ đóng ống Glove-box Các ống CĐC bảo quản nhiệt độ - oC Đánh giá đồng lô: lọ CĐC đồng trình gói Đánh giá đồng liên phòng thí nghiệm: độ tinh khiết CĐC không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá, lọ CĐC đồng TT 10 11 TB % Độ tinh khiết sắc ký TB lần phân tích (%) Crina 6-OHcri Hippadin Lycorin Astra Isoquer 98,69 96,72 99,96 99,99 98,23 98,02 98,70 96,75 99,98 99,99 98,27 98,07 98,67 96,76 99,98 100,00 98,26 98,11 98,72 96,73 99,99 100,00 98,30 98,13 98,73 96,74 99,93 100,00 98,30 98,09 98,76 96,75 99,95 99,99 98,29 98,10 98,70 96,72 99,91 100,00 98,31 98,15 98,74 96,76 99,98 100,00 98,25 98,11 98,71 96,75 99,93 99,99 98,27 98,15 98,69 96,79 99,93 99,99 98,30 98,14 98,70 96,81 99,99 100,00 98,26 98,10 98,71 96,75 99,96 99,99 98,28 98,10 3.2.5 Xác định giá trị ấn định giá trị công bố: Bảng 3.25 Giá trị ấn định giá trị công bố CĐC Tên chất khảo sát Crinamidin 6-hydroxycrinamidin Hippadin Lycorin Astragalin Isoquercitrin x*% 98,74 96,75 99,99 99,98 98,28 98,15 s* 0,023 0,017 0,009 0,020 0,115 0,018 µx 0,007 0,006 0,003 0,006 0,037 0,005 X% 98,74 96,74 99,99 99,98 98,25 98,16 3.4 Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính, định lượng alcaloid flavonoid Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6-hydroxycrinamidin (96,75%), 6-hydroxypowellin (98,56%), 6-hydroxyundulatin (99,66%), undulatin (98,50%) 6-hydroxybuphanidrin (98,65%) Mẫu đối chiếu flavonoid: astragalin (98,28%), isoquercitrin (98,15%) Cafein (100,01%) quercetin (91,4%) chuẩn nội quy trình CE [...]... Phương pháp dấu vân tay định tính alcaloid hoặc flavonoid Mẫu thử: alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA Mẫu đối chiếu: các chất đối chiếu như trong phần định lượng alcaloid và flavonoid bằng phương pháp HPLC - Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN IV-Phụ lục 6.7 - Định tính: bằng các phương pháp phổ nghiệm Phổ UV-Vis: mẫu được hòa tan trong methanol, nồng độ 10 µg/ml Quy t phổ trong khoảng bước sóng... hiện phương pháp HPLC Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: các quy trình đều đạt yêu cầu Kết quả đánh giá độ tinh khiết sắc ký của các CĐC: kết quả được trình bày ở Bảng 3.2 Các nguyên liệu CĐC có độ tinh khiết sắc ký ≥ 95% 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá các CĐC: Các CĐC khảo sát được xây dựng tiêu chuẩn đánh giá như CĐC hóa học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng 3.2.4 Đóng gói và đánh giá đồng nhất:... để định tính, định lượng alcaloid hoặc flavonoid Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6-hydroxycrinamidin (96,75%), 6-hydroxypowellin (98,56%), 6-hydroxyundulatin (99,66%), undulatin (98,50%) và 6-hydroxybuphanidrin (98,65%) Mẫu đối chiếu flavonoid: astragalin (98,28%), isoquercitrin (98,15%) Cafein (100,01%) và quercetin (91,4%) là chuẩn nội của quy trình CE ... lycorin: 3.4.5 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng CE - Điều kiện điện di: các điều kiện điện di tương tự quy trình định lượng alcaloid Dung dịch điện di dinatri tetraborat 45 mM; điều chỉnh đến pH 9,0 bằng acid boric, phối hợp với methanol để được dung dịch điện di nền có 10% methanol Kỹ thuật điện di vùng CZE Khảo sát tính phù hợp hệ thống: các quy trình đạt yêu cầu Thẩm định quy trình phân... động là methanol; dung dịch acid H3PO4 pH 3 và 0,2% TEA 3.4.3 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC - Điều kiện sắc ký: các điều kiện sắc ký tương tự quy trình định lượng alcaloid Rửa giải đẳng dòng, pha động là hỗn hợp dung môi acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80), bước sóng 265 nm 3.4.4 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng CE - Điều kiện điện di: cột mao... biệt trên bản mỏng khoảng 20 μl dung dịch thử và đối chiếu Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu bằng TT Dragendorff (alcaloid) hoặc TT FeCl31% (flavonoid) Phát hiện: đèn UV 254 hoặc 365 nm hoặc TT Dragendorff Đánh giá: sắc ký đầy DVT – SKLM alcaloid TNHC phải có ít nhất 6 vết có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng Phương... quả định lượng flavonoid trong lá TNHC (n = 6) Astragalin - IR (KBr): υmax (cm-1) 1675 (C=O); 1620 (C=C); 1036 (C-O) Isoquercitrin Hàm lượng flavonoid trong lá TNHC (µg/g) Phương pháp HPLC Phương pháp CE µ = 266,0 ± 6,2 µ = 261,9 ± 9,7 RSD = 2,21% RSD = 3,56% µ = 125,9 ± 2,6 µ = 126,0 ± 3,1 RSD = 1,99% RSD = 2,32% 14 11 3.4.1 Quy trình xử lý mẫu - Mẫu thử alcaloid: cân 10 g bột lá cho vào cốc, thêm... Phương pháp DVT – HPLC Điều kiện: điều kiện sắc ký, các bước tiến hành xác định DVT alcaloid như Mục 3.4.2; xác định DVT flavonoid TNHC như Mục 3.4.3 Đánh giá: chọn các pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% tại λ = 214 nm (alcaloid) ; λ = 265 nm (flavonoid) để ghi nhận thời gian lưu tương đối, % diện tích pic và phổ UV - DVT– HPLC flavonoid: mẫu thử có ít nhất 2 pic đặc trưng như sau: Pic Thời gian lưu (phút) 1... định và giá trị công bố: Bảng 3.25 Giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC Tên chất khảo sát Crinamidin 6-hydroxycrinamidin Hippadin Lycorin Astragalin Isoquercitrin x*% 98,74 96,75 99,99 99,98 98,28 98,15 s* 0,023 0,017 0,009 0,020 0,115 0,018 µx 0,007 0,006 0,003 0,006 0,037 0,005 X% 98,74 96,74 99,99 99,98 98,25 98,16 3.4 Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính, định lượng alcaloid. .. dịch chiết được thu hồi dung môi, kiềm hóa bằng amoniac 25% đến pH 9 – 10 Chiết với 30 ml cloroform (x3 lần) Gộp toàn bộ dịch cloroform, thu hồi dung môi đến cắn alcaloid AL-SA - Mẫu thử flavonoid: cân 10 g bột lá cho vào cốc 250 ml, thêm 50 ml cồn 70%, siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần) Toàn bộ dịch chiết được thu hồi dung môi, sau đó acid hóa bằng acid hydrocloric đến pH 3 – 4 Chiết