BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 VÕ VĂN SONG TOÀN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ ĐỂ ỨNG DỤNG CHĂN NUÔI GIA SÚC NHAI LẠI VÀ CUNG CẤP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỒN TỪ BÃ MÍA Cần Thơ, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 VÕ VĂN SONG TOÀN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ ĐỂ ỨNG DỤNG CHĂN NUÔI GIA SÚC NHAI LẠI VÀ CUNG CẤP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỒN TỪ BÃ MÍA Cần Thơ, 2015 CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trần Nhân Dũng Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Hồ Quảng Đồ Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………………………………………… Vào lúc … … ngày … tháng … năm ….…… Phản biện 1: …………………………………………… Phản biện 2: …………………………………………… Phản biện 3: …………………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam Chapter CHƢƠNG I: KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Công nghệ sinh học cung cấp cho kinh tế phát triển giải pháp nhiều vấn đề phải đối mặt thường xuyên sản xuất nông nghiệp, lương thực, dược phẩm, lượng suất thấp ô nhiễm môi trường Một sản phẩm công nghệ sinh học dạng thức ăn bổ sung probiotic Bào tử số loài B cereus, B licheniformis, B subtilis thường sử dụng thức ăn bổ sung probiotic để đưa vào đường tiêu hóa (Sanders et al., 2003) Việc cho ăn trực tiếp vi sinh vật (Microbials Direct-Fed, DFM) tác động tốt đến môi trường cỏ, đồng thời cải thiện sức khỏe phát triển bê non (Krehbiel et al., 2014) Điều cho thấy việc sử dụng vi sinh vật sở hữu hệ cellulase đồng thời có khả sử dụng thức ăn probiotic cần thiết để cải thiện khả tiêu hóa gia súc nhai lại, góp phần cải thiện sức khỏe vật nuôi Bên cạnh đó, sức p t khủng hoảng dầu mỏ nhu cầu lượng vấn đề đặt cho quốc gia giới Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol hệ thứ (sản phẩm nông nghiệp) đe dọa an ninh lương thực toàn cầu Điều khích lệ nước giới đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học hệ thứ hai: lignocellulose (Rubin, 2008) Bã mía sử dụng để lên men ethanol Candida shehatae NCIM 3501 (Anuj, 2007) Pichia stipitis tái tổ hợp sử dụng để lên men thân bắp sau nổ nước thủy phân trực tiếp với enzyme (Xiushan, 2011) Với mong muốn phát triển chế phẩm vi sinh vật hỗ trợ gia súc nhai lại tiêu hóa xơ thực vật phát triển nguồn nhiên liệu sinh học hệ thứ 2, tiến hành thực đề tài “phân lập, tuyển chọn vi khuẩn cỏ để ứng dụng chăn nuôi gia súc nhai lại cung cấp cho trình lên men cồn từ bã mía” 1.2 Mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu - Tuyển chọn tổ hợp VKDC ứng dụng chăn nuôi GSNL - Tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol t bã mía 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Vi khuẩn phân lập t dịch cỏ bò, trâu, c u dê nấm men (D3, D7, D9, D11, D16, H6, H13, ST1 CM4) 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án Về khoa học, tổ hợp VKDC sử dụng để bổ sung trực tiếp vào cỏ bò tổ hợp VKDC bò nấm men lên men ethanol làm sở cho nghiên cứu tài liệu tham khảo cho giảng dạy Về thực tiễn, tổ hợp dòng VKDC (BM13, BM21, BM49 DD9) phát triển thành chế phẩm thức ăn bổ sung probiotic vào ăn cho gia súc Bên cạnh đó, tổ hợp bao gồm dòng nấm men (D11) VKDC bò (BM13, BM21, BM49) sử dụng để phát triển lên men ethanol hệ thứ 1.5 Những đóng góp luận án T 121 dòng vi khuẩn cỏ (VKDC) phân lập t dịch cỏ bò, trâu, c u dê Đề tài xác định VKDC dê DD9 (tương đồng 94% với Bacillus subtilis RC24) phối hợp với tổ hợp VKDC bò BM13, BM21 BM49 (tương đồng 91%, 94% 94% với Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis strain S2O, Uncultured Bacillus sp Filt.17) theo tỷ lệ 3:1 cho kết phân giải bã mía hiệu điều kiện in vitro, đồng thời hỗ trợ tích cực bò thí nghiệm tiêu hóa thực liệu giàu xơ điều kiện in vivo Bên cạnh đó, dòng nấm men D11 (tương đồng 96% với Candida inconspicua) cho thấy phối hợp với tổ hợp VKDC bò (BM13, BM21, BM49) để lên men cồn t bã mía Chapter CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu “Tổ hợp vi khuẩn cỏ thích hợp để để phân giải bã mía điều kiện in vitro in vivo lên men ethanol t bã mía có kết hợp nấm men tổ hợp dịch vi khuẩn cỏ bò” đề tài xây dựng hoàn thành nội dung nghiên cứu: (1) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn cỏ bò, trâu, c u, dê (2) Tuyển chọn vi khuẩn cỏ để phân giải bã mía điều kiện in vitro in vivo (3) Tuyển chọn nấm men để kết hợp với vi khuẩn cỏ bò để lên men ethanol t bã mía Những nội dung nghiên cứu mô tả theo sơ đồ sau: Hinh 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu luận án 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía từ dịch cỏ trâu, bò, cừu dê 2.2.1.1 Phân lập vi khuẩn có nguồn gốc từ dịch cỏ (VKDC) Dịch cỏ loài gia súc nhai lại (bò, trâu, c u dê) dùng để phân lập vi khuẩn đĩa petri theo phương pháp Robert Koch (Brock, 1961) với thành phần dung dịch khoáng môi trường nuôi cấy theo Ryckeboer et al (2003) tiến hành ủ ở 38oC 48 bình ủ thủy tinh có nắp kín Đèn cầy đặt bên bình đốt hết oxy bình ủ để tạo môi trường kỵ khí (bình ủ kỵ khí) Những khuẩn lạc đồng hình dạng, màu sắc dạng bìa sử dụng quan sát tiếp vật kính độ phóng đại 100X để xác định độ ròng mẫu để mô tả số đặc điểm khuẩn lạc tế bào vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2008) 2.2.1.2 Tuyển chọn định danh VKDC có hệ endo- exoglucanase Mỗi 20 µL dịch VKDC (đã phân lập t cỏ loài gia súc) có mật số 106 tế bào/mL bơm vào giếng thạch có đường kính mm môi trường M1 (cơ chất CMC bã mía), ủ ngày 38oC bình ủ kỵ khí Mẫu nhuộm với Congo red để khảo sát vòng halo (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Mỗi loại VKDC chọn dòng vi khuẩn với hệ endo- exoglucanase mạnh để định danh kỹ thuật PCR dựa theo phương pháp White et al (1983) với cặp mồi 8F 1492R (Turner et al., 1999) khuếch đại vùng gen 16S rDNA Sản phẩm PCR tiếp tục giải trình tự theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (Sanger et al., 1977) với đoạn mồi 8F (Turner et al., 1999) Trình tự nucleotide vùng gen 16S rDNA so sánh tương đồng với trình tự nucleotide NCBI; Đồng thời sử dụng để phả hệ mô tả tương quan di truyền dòng vi khuẩn theo phương pháp phân tích Neighborjoining phần mềm Mega 6.0 với số lần lặp lại 100 lần 2.2.1.3 Tuyển chọn tổ hợp VKDC để phân giải bã mía Mẫu: Các dòng VKDC bò (BM13, BM21, BM49 BM97), VKDC trâu (TM9, TM11, TM17 TM27), VKDC c u (CD15, CD11, CD21 CD43) VKDC dê (DD9, DD5, DD7, DD13) Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm tổ hợp dòng VKDC VK ĐC           Ghi chú: ĐC: đối chứng, NT: nghiệm thức NT   10     11    12    13    14    15     Mỗi 20 µL dịch VKDC (đã phân lập t cỏ loài gia súc) có mật số 106 tế bào/mL bơm vào giếng thạch có đường kính mm môi trường M1 (cơ chất CMC bã mía), ủ ngày 38oC bình ủ kỵ khí Mẫu nhuộm với Congo Red sau ngày để khảo sát vòng halo phân giải bả mía (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.2.2 Nội dung 2: Tuyển chọn tổ hợp dịch VKDC phân giải bã mía điều kiện in vitro in vivo 2.2.2.1 Phối hợp VKDC loài điều kiện in vitro a) Ảnh hƣởng tổ hợp VKDC bò trâu cừu dê Mẫu: Tổ hợp 03 VKDC bò (BM13, BM21 BM49 = 1:1:1), dịch VKDC trâu (TM9 TM11), VKDC c u (CD43 CD11), VKDC dê (DD9 DD7) chọn t kết 2.2.1.3 Thành phần dung dịch đệm theo Tilley Terry (1963) Dịch cỏ (DDC) bò thu qua lỗ dò bò trữ vào lọ tối màu chuyển vào bình giữ ấm Dịch cỏ thu dùng để bố trí thí nghiệm in vitro sau gạn bỏ thức ăn th a Khí CO2 bơm 45 phút để tạo kỵ khí ủ ấm nhiệt độ 38oC bồn ủ ổn nhiệt trước dùng Bảng 2.2 Phối hợp VKDC loài điều kiện in vitro Thành phần DDC bò DD đệm (mL) VKDC bò (mL) VKDC (mL) VKDC (mL) DC40 160 0 DC+ 160 12 0 NT1 40 160 12 0 NT2 40 160 6 NT3 40 160 6 NT4 40 160 3 NT5 40 160 NT6 40 160 NT7 40 160 4,5 4,5 * Ghi chú: DC-: Đối chứng âm; DC+: Đối chứng dương; NT: Nghiệm thức * VKDC bò (BM13, BM21 BM49 = 1:1:1); Dịch VKDC 1: Trâu/cừu/dê : TM9/CD43/DD9; Dịch VKDC 2: Trâu/cừu/dê: TM11/CD11/DD7 Ủ ổn nhiệt cách thủy ngày 38oC điều kiện kỵ khí Đánh giá phần trăm VCK (AOAC, 2000), cellulose, hemicellulose lignin (Van Soest and Wine, 1967; Van Soest, 1979) bã mía phân giải b) Ảnh hƣởng tổ hợp VKDC bò, cừu dê Bảng 2.3 Phối hợp VKDC bò, c u dê Thành phần Bã mía (g) DD đệm (mL) Dịch cỏ bò (mL) VK (mL) VK (mL) VK (mL) NT1 160 40 NT2 200 NT3 160 40 NT4 160 40 0 12 0 12 0 Nghiệm thức NT5 NT6 2 160 160 40 40 6 NT7 160 40 NT8 160 40 NT9 160 40 NT10 160 40 6 4 * Ghi chú: VK 1: Tổ hợp VKDC bò: BM13, BM21 BM49 = 1:1:1; VK 2: VKDC cừu: CD43:CD1 = 1:1 , VK 3: VKDC dê = DD9 Trong đó, dịch VKDC bò (BM13, BM21 BM49 = 1:1:1) chọn t 2.2.1.3, tổ hợp VKDC c u (CD11 CD43), VKDC dê (DD9) chọn t 2.2.2.1.a Thành phần dung dịch đệm theo Tilley Terry (1963); Dịch cỏ (DDC) bò chuẩn bị tiểu mục 3.3.2.1; VKDC trâu VKDC c u VKDC dê có mật số 107CFU/mL bố trí theo bảng 2.3 tiến hành theo phương pháp in vitro Tilley Terry (1963) Đánh giá: Phần trăm VCK phân giải (AOAC, 2000), cellulose, hemicellulose lignin bã mía phân giải (Van Soest and Wine, 1967; Van Soest, 1979) c) Khảo sát hệ endoglcanase exoglucanase VKDC bò, dê Vi khuẩn (BM13, BM21, BM49 DD9) nuôi cấy môi trường lỏng với chất bột bã mía với thành phần môi trường khoáng theo Ryckeboer et al (2003) ủ kỵ khí (để yên, không lắc suốt thời gian nuôi cấy) nhiệt độ 38oC, ngày Dịch nuôi cấy ly tâm lạnh 6.000 vòng/phút 20 phút Dịch emzym thô thu dùng để tủa phân đoạn ammonium sulphate theo nồng độ bão hòa 30 đến 90% Các phân đoạn protein thu nhận để đánh giá hoạt tính đặc hiệu mẫu thu Enzym (có hoạt tính) thu t tủa ammonium sulphate sử dụng để tiếp tục tinh phương pháp sắc ký trao đổi ion âm với gel sắc ký sử dụng Uno sphere Q Các phân đoạn thu t trình sắc ký phân tích hoạt tính đặc hiệu endoglucanase exoglucanase; Đồng thời phân tích thành phần khối lượng phân tử protein diện phân đoạn phương pháp điện di SDS-PAGE Chỉ tiêu đánh giá - Hàm lượng protein phương pháp Bradford (µg/mL) - Hoạt tính phương pháp Nelson-Soymogi (U/mL) - Khối lượng phân tử protein phương pháp điện di SDSPAGE (kDa) 2.2.2.4 Ảnh hƣởng VKDC bò dê điều kiện in vivo a Khảo sát phát triển VKDC Mẫu: VKDC bao gồm BM13, BM21 BM49 DD9 Mỗi 1% (v/v) dịch vi khuẩn (BM13, BM21, BM49 DD9) có mật số 107 tế bào/mL bổ sung vào môi trường nuôi cấy (Ryckeboer et al., 2003) ủ vi khuẩn 38oC với bình ủ kỵ khí Dịch vi khuẩn kiểm tra mật số phương pháp đếm sống thời điểm 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 b Khảo sát ảnh hƣởng VKDC bò dê điều kiện in vivo Bò đực Lai Sind (4 con) khoảng 2,5 năm tuổi có trọng lượng ban đầu trung bình t 150-170 kg mổ lỗ dò Tổ hợp VKDC sử dụng bao gồm VKDC bò (BM13, BM21 BM49 = 1:1:1) VKDC dê (DD9) có mật số 107 CFU/mL phối trộn theo tỷ lệ 1:3 Bò tiêm ng a lở mồm long móng, chia làm nhóm nhóm 1:2 bò cho ăn theo phần không bổ sung VKDC; Nhóm 2:2 bò cho ăn theo phần kết hợp bổ sung VKDC Thí nghiệm tiến hành trại nuôi bò hộ ông Nguyễn Văn Việt (Ấp Phú Long, Xã Phú Thành, H Trà Ôn, T Vĩnh Long) diễn liên tục giai đoạn, giai đoạn khảo sát 15 ngày Chuồng trại nuôi bò có diện tích dài x rộng = x (m2), chiều cao 3m, bêtông, mái lá; bên cạnh có đường bêtông dài x rộng = x (m2) để dẫn bò t trại đến chỗ để cân bò Khẩu phần thực liệu dùng cho bò mổ lỗ dò bao gồm cỏ lông tây, bã mía, bánh dầu vải urea theo tỷ lệ 70% : 20% : 8,5% : 1,5% Bò cho uống ăn tự phần thực liệu (được trộn đều) thí nghiệm vào lúc 15 ngày Ngay sau cho ăn, bổ sung dịch VKDC cho hai (02) bò thuộc nhóm thông qua lỗ dò Thu mẫu thức ăn th a, phân loại cân loại thức ăn th a vào buổi sáng hôm sau lúc giờ; Cân lượng bò; Thu mẫu phân vào ngày thứ 15, 30, 45, 60 (ngày kết thúc giai đoạn thí nghiệm); Thu mẫu dịch cỏ bã thức ăn cỏ bò mốc thời gian: giờ, giờ, sau cho bò ăn ngày thứ 15, 30, 45, 60 Đánh giá: Lượng thực liệu ăn vào, pH, hàm lượng NH3 dịch cỏ, thành phần hóa học (VCK, cellulose, hemicellulose, lignin) thực liệu tiêu hóa, kích thước thức ăn cỏ, thành phần hóa học phân bò, tỷ lệ tiêu hóa protein thô tăng trọng bò 3,7h 22bcd 23,7b 23bc 12 13 14 15 16,3ef 17,7e 11 10,3g 18e Nghiệm thức 10 21d 17,7e 29a 15,7f 17,7e 2,3h 21,7cd DC 0i ĐK halo (mm) Bảng 3.3 Tổ hợp VKDC bò phân giải bã mía Ghi chú: VKDC: vi khuẩn cỏ, ĐK: đường kính, DC: đối chứng, NT: nghiệm thức VKDC bò: 1: BM13, 2: BM21, 3: BM49, 4: BM97 NT1: 1, NT2: 2, NT3: 3, NT4: 4, NT5: 1+2, NT6: 1+3, NT7: 1+4, NT8: 2+3, NT9: 2+4, NT10: 3+4, NT11: 1+2 + 3, NT12: 1+2+4, NT13: 1+ 3+4, NT14: 2+3+4, NT15: 1+2+3+4 CVVKDC bò = 6,41% Bảng 3.3 cho thấy có tương tác tích cực ức chế dòng vi khuẩn với nghiệm thức 11 (tổ hợp vi khuẩn BM13, BM21 BM49) phân giải bã mía tạo đường kính vòng halo lớn 29 mm Điều cho thấy dòng vi khuẩn BM13 BM21 (có hoạt tính exgl mạnh) phối hợp với BM49 (có hoạt tính engl mạnh) hỗ trợ tích cực trình phân giải bã mía Theo Wang and McAllister (2002), hoạt động kết hợp engl exgl dẫn đến thay đổi đặc điểm bề mặt phân tử cellulose t làm cho tỷ lệ phân giải thay đổi nhanh chóng 3.2.2 Vi khuẩn cỏ trâu Kết có 15 dòng vi khuẩn phân lập t dịch cỏ trâu (VKDC trâu) Qua phân tích hoạt tính endoglucanase exoglucanase VKDC trâu, tuyển chọn dòng VKDC trâu TM11, TM9 TM17 có hai hệ enzim Engl Exgl mạnh dòng TM27 có hoạt tính Engl mạnh Kết định danh dòng VKDC trâu TM9, TM11, BM17 BM27, giải trình tự dòng vi khuẩn TM11, TM17 TM27 so sánh với ngân hàng gen NCBI bước đầu cho thấy dòng vi khuẩn tương đồng với Uncultured bacterium nbw138b09c1, Bacterium C6129 Uncultured bacterium aab40g11 mức đồng hình 88%, 94%, 94% Tương tự bố trí thí nghiệm phối hợp dòng VKDC bò, dòng VKDC trâu TM9, TM11, TM17, TM27 ký hiệu 1, 2, tổ hợp với tương ứng 15 nghiệm thức Kết 11 12g 21,3b 18de 0h 26,3a 21bc 0h 15,3f 11 12 13 14 15 16,3ef Nghiệm thức 10 de 18,7c 0h 12g 20bcd 0h 16,7ef DC 0h ĐK halo (mm) phân tích cho thấy tổ hợp hai dòng vi khuẩn TM9 TM11 phân giải bã mía mạnh với đường kính vòng halo phân giải bã mía tạo 26,3 mm (CV=11,45%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại (bảng 3.4) Bảng 3.4 Tổ hợp VKDC trâu phân giải bã mía 3.2.3 Vi khuẩn cỏ cừu Kết có 25 dòng vi khuẩn phân lập t dịch cỏ c u (VKDC c u) Phân tích hoạt tính endoglucanase exoglucanase VKDC c u tuyển chọn dòng vi khuẩn CD15, CD11, CD21 CD43 cho thấy có khả sinh tổng hợp Exgl mạnh thể với đường kính vòng halo phân giải bã mía 49,33 - 45 - 38,33 39,33 mm, dòng vi khuẩn CD43 có hoạt tính Engl mạnh với đường kính vòng halo phân giải CMC 56 mm Kết giải trình tự vùng 16S rDNA VKDC c u CD11, CD15, CD21 CD43 bước đầu xác định dòng vi khuẩn tương đồng với Betaproteobacteria, Bacterium MOBOSA51, Uncultured bacterium, Bacillus tequilensis TXJB 020 mức đồng hình 79%, 93%, 93%, 99% Tương tự bố trí thí nghiệm phối hợp dòng VKDC bò, dòng VKDC c u CD15, CD11, CD21, CD43 ký hiệu 1, 2, tổ hợp với tương ứng 15 nghiệm thức Kết phân tích cho thấy tổ hợp hai dòng vi khuẩn CD11 CD43 phân giải bã mía mạnh với đường kính vòng halo phân giải bã mía tạo 32 mm (CV=7,44%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại (bảng 3.5) 12 12 13 14 15,7ef 7,0i 15 10,7h 11 27,7b 6,0i 32,0a 15,3efg 16,7de Nghiệm thức 10 14,3fg 16,3de 18,0d 13,7g 20,7c 20,3c 0k ĐK halo (mm) DC 14,0fg Bảng 3.5 Tổ hợp VKDC c u phân giải bã mía 12 13 14 15 8,67k 5,33l 19,0cd 13,3 11 12,3hi Nghiệm thức 10 15,7ef 21,7b ghl 14,3fgh 15,3efg 6,33l 15,7ef 12,0i 26,7a 20,7bc 17,3de DC ĐK halo (mm) 3.2.4 Vi khuẩn cỏ dê Kết có 19 dòng vi khuẩn phân lập t dịch cỏ dê (VKDC dê) Phân tích hoạt tính Engl Exgl VKDC dê tuyển chọn dòng VKDC dê có dòng vi khuẩn DD9, DD13, DD7 có hoạt tính Exgl mạnh dòng vi khuẩn DD5 có hoạt tính Engl mạnh Dựa vào trình tự vùng 16S rDNA dòng vi khuẩn DD5, DD7, DD9 DD13 kết xác định trình tự dòng vi khuẩn DD5, DD7, DD9 cặp mồi 8F, 1492R (Turner et al., 1999) so sánh với ngân hàng gen NCBI bước đầu cho thấy dòng vi khuẩn tương đồng với Escherichia coli RW-29, Bacterium C3-3-1 Bacillus subtilis RC24 mức đồng hình 97%, 92% 94% Tương tự bố trí thí nghiệm phối hợp dòng VKDC bò, dòng VKDC dê DD9, DD5, DD7 DD13 ký hiệu 1, 2, tổ hợp với tương ứng 15 nghiệm thức Kết phân tích cho thấy tổ hợp hai dòng vi khuẩn DD9 DD7 phân giải bã mía mạnh với đường kính vòng halo phân giải bã mía tạo 26,7 mm (CV=8,80%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại (bảng 3.6) Bảng 3.6 Tổ hợp VKDC c u phân giải bã mía 13 3.2.5 Phân tích quan hệ di truyền VKDC B.subtilis-JCM1465 B.subtilis-NBRC13719 B.subtilis-S2O-JQ410786.1 CD43-B.tequilensis-TXJB020 BM49-Unculturedbacillus-Filt.171 VII CD15(ST-27F)Bacterium-MOBOSA51 B.subtilis-RC24-FJ263368.1 DD7-5-Bacterium-C3.3.1 DD9-6-B.subtilis-RC24 BM21-B.subtilis-S2O B.pumilus-ST312 B.cereus-MRS1 Butyrivibrio-fibrisolvens Lachnospira-multipara VI BM13-A.xylosoxidans-BL6 V CD11-3-Vi-Betaproteobacteria A.insuavis-LMG26845 A.xylosoxidans-LMG1863 BM97-8S-Unculturedbacterium IV DD5-3S-E.coli-RW29 CD21-7S-Unculturedbacterium TM11-9S-Unculturedbacterium-nbw138b09c1 TM17-6S-Bacterium-C6129 TM27-4S-Unculturedbacterium-aab40g11 I, II, III Ruminococcus-flavefaciens Bacteroides-ruminicola Fibrobacter-succinogenes Hình 3.1 Phả hệ mô tả tương quan di truyền dòng vi khuẩn * Chỉ số Boottrap ghi đầu nhánh; Thanh Scale: đơn vị đo khoảng cách di truyền Cây phả hệ (hình 3.1) gồm nhánh Nhánh I-III dòng vi khuẩn R flavefaciens, B ruminicola F succinogenes Nhánh IV gồm dòng vi khuẩn BM97, DD5, CD21, TM11, TM17 TM27 với hệ số Bootstrap 97 Điều cho thấy dòng vi khuẩn nhóm có quan hệ di truyền gần với Nhóm V xuất 02 dòng vi khuẩn BM13 CD11 có hệ số Bootstrap 65 so với 02 dòng vi khuẩn thuộc chi Achromobacter; Nhóm vi khuẩn thứ VI 02 dòng vi khuẩn có nguồn gốc t cỏ Butyrivibrio fibrisolvens Lachnospira multipara Nhóm thứ VII xuất dòng vi khuẩn CD43, BM49, CD15, DD7, DD9, BM21 có quan hệ gần gũi với dòng vi khuẩn B cereus MRS1 với hệ số Bootstrap 99 14 3.3 Tuyển chọn tổ hợp dịch VKDC phân giải xơ điều kiện in vitro in vivo 3.3.1 Ảnh hƣởng tổ hợp VKDC loài đến phân giải bã mía điều kiện in vitro 3.3.1.1 Ảnh hƣởng tổ hợp VKDC bò với trâu cừu dê Theo Trần C (1979) phân giải chất xơ chủ yếu dựa vào hoạt động hệ vi khuẩn sống quan tiêu hóa Vì với kết phân tích thành hóa học bã mía phân giải điều kiện thí nghiệm in vitro pháp phổ biến sử dụng việc đánh giá khả tiêu hóa gia súc, làm tiền đề cho việc thực phương pháp in vivo, in situ (Rine et al., 2006) Đối với trường hợp VKDC bò (BM13, BM21 BM49) phối hợp với VKDC trâu (TM9 TM11), kết bảng 3.7 cho thấy NT1 với 20% dịch cỏ bò (DDC bò) có bổ sung 6% VKDC bò (BM13:BM21:BM49 theo tỷ lệ 1:1:1) có hàm lượng VCK, cellulose, hemicellulose lignin bã mía phân giải nhiều 12,27; 2,86; 0,68; 2,53% (P[...]... Đồ và Trần Nhân Dũng 2015 Phân giải bã mía bằng vi khuẩn phân lập t dạ cỏ bò và c u trong điều kiện in vitro Kỷ yếu Hội nghị Toàn Quốc Chăn nuôi – Thú y tại Trường ĐHCT 28 – 29/4/2015 NXB Nông nghiệp p641 - p648 ISBN: 978-604-602019-6 4 Võ Văn Song Toàn, Đỗ Thị Cẩm Hường, Hồ Quảng Đồ và Trần Nhân Dũng 2013 Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn dạ cỏ bò để phân giải bã mía trong điều kiện in vitro... Lignin (%) 15,6 ± 1,51 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía mạnh từ dịch dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê 3.2.1 Vi khuẩn dạ cỏ bò Kết quả đã có 62 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ bò (VKDC bò) Qua phân tích hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC bò (bảng 3.2) đã tuyển chọn được 4 dòng VKDC bò trong đó BM13, BM21, BM97 có hoạt tính exoglucanase (Exgl) mạnh và BM49 có hoạt tính... 2014 Khảo sát khả năng phối hợp của vi khuẩn dạ cỏ dê với nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò để phân giải bã mía trong điều kiện in vitro Tạp chí NN & PTNT NXB Ministry of Agriculture and rural development 19: 63-69 ISBN: 1859-4581 2 Võ Văn Song Toàn, Bùi Thị Ngọc Hân, Nguyễn Lê Bảo Trân, Hồ Quảng Đồ và Trần Nhân Dũng 2014 Phân lập và tuyển chọn nấm men để lên men cồn bằng nguồn bã mía Tạp chí Khoa học trường Đại... lại (bảng 3.4) Bảng 3.4 Tổ hợp VKDC trâu phân giải bã mía 3.2.3 Vi khuẩn dạ cỏ cừu Kết quả đã có 25 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ c u (VKDC c u) Phân tích hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC c u đã tuyển chọn được 4 dòng vi khuẩn CD15, CD11, CD21 và CD43 cho thấy là có khả năng sinh tổng hợp Exgl mạnh thể hiện với đường kính vòng halo phân giải bã mía là 49,33 - 45 - 38,33 và. .. nấm men và VKDC trong quá trình lên men ehanol từ bã mía 2.2.3.1 Phối hợp nấm men với dịch VKDC đƣợc tuyển chọn ở bò Mẫu: 09 dòng nấm men D3, D7, D9, D11, D16, H6, H13, ST1 và CM4 (Phạm Thị Lê Trinh, 2014); VKDC bò BM13, BM21 và BM49 chọn t 2.2.1.3 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố là nấm men, nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn, không bổ sung nấm men và nghiệm thức đối chứng... 02 dòng vi khuẩn BM13 và CD11 và có hệ số Bootstrap 65 so với 02 dòng vi khuẩn thuộc chi Achromobacter; Nhóm vi khuẩn thứ VI là 02 dòng vi khuẩn cũng có nguồn gốc t dạ cỏ đó là Butyrivibrio fibrisolvens và Lachnospira multipara Nhóm thứ VII xuất hiện 6 dòng vi khuẩn CD43, BM49, CD15, DD7, DD9, và BM21 có quan hệ gần gũi với dòng vi khuẩn B cereus MRS1 với hệ số Bootstrap là 99 14 3.3 Tuyển chọn tổ... ăn trong suốt 4 giai đoạn (mỗi giai đoạn là 15 ngày) diễn ra thí nghiệm đã góp phần hỗ trợ tích cực bò tăng khả năng phân giải xơ, tiêu hóa protein và giúp bò tăng trọng nhanh 4.7 Tuyển chọn nấm men và VKDC để lên men ehanol từ bã mía Kết quả lên men ethanol có sự kết hợp các dòng nấm men với các dòng VKDC được tuyển chọn ở bò (bảng 3.14) Bảng 3.14 Kết hợp nấm men với VKDC bò để lên men ethanol +VK+ST1... 3 nhân tố nhiệt độ (25, 30 và 35oC) pH (5,6 và 7), thời gian (5, 6 và 7 ngày) Giai đoạn đường hóa được chuẩn bị tương tự như tiểu mục 2.2.3.1 Kết thúc giai đoạn này bình ủ được sử dụng trực tiếp để bổ sung thêm nấm men D11 vào để tiến hành lên men Giai đoạn lên men ethanol được chuẩn bị tương tự như tiểu mục 2.2.3.1 Theo dõi: Số mL khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men, và hàm lượng ethanol (g/L)... engl và exgl sẽ dẫn đến thay đổi đặc điểm bề mặt của phân tử cellulose t đó sẽ làm cho tỷ lệ phân giải thay đổi nhanh chóng 3.2.2 Vi khuẩn dạ cỏ trâu Kết quả đã có 15 dòng vi khuẩn được phân lập t dịch dạ cỏ trâu (VKDC trâu) Qua phân tích hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của VKDC trâu, đã tuyển chọn được 4 dòng VKDC trâu trong đó TM11, TM9 và TM17 có cả hai hệ enzim là Engl và Exgl mạnh và dòng... 6,41% Bảng 3.3 cho thấy có thể có sự tương tác tích cực hoặc ức chế giữa các dòng vi khuẩn với nhau trong đó nghiệm thức 11 (tổ hợp vi khuẩn BM13, BM21 và BM49) phân giải bã mía và tạo đường kính vòng halo lớn nhất là 29 mm Điều này cho thấy 2 dòng vi khuẩn BM13 và BM21 (có hoạt tính exgl mạnh) phối hợp với BM49 (có hoạt tính engl mạnh) đã hỗ trợ tích cực nhau trong quá trình phân giải bã mía Theo Wang ... chọn vi khuẩn cỏ bò, trâu, c u, dê (2) Tuyển chọn vi khuẩn cỏ để phân giải bã mía điều kiện in vitro in vivo (3) Tuyển chọn nấm men để kết hợp với vi khuẩn cỏ bò để lên men ethanol t bã mía Những... nhai lại cung cấp cho trình lên men cồn từ bã mía 1.2 Mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu - Tuyển chọn tổ hợp VKDC ứng dụng chăn nuôi GSNL - Tuyển chọn tổ hợp VKDC-nấm men để lên men ethanol t bã mía. .. 1: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải xơ bã mía từ dịch cỏ trâu, bò, cừu dê 2.2.1.1 Phân lập vi khuẩn có nguồn gốc từ dịch cỏ (VKDC) Dịch cỏ loài gia súc nhai lại (bò, trâu, c u dê) dùng để