TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH SVTH: Nhóm LỚP: Thứ 2, Tiết 10-11 TP.HCM, ngày tháng 10 năm 2015 Phân tích vi sinh thực phẩm Danh sách nhóm STT Họ Và tên Trần Thị Mỹ Dung Nguyễn Hoàng Việt Bùi Thị Thanh Hương Khương Thị Thảo Nguyễn Thị Vân Anh Thái Thị Tuyết Hà GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh MSSV 2022130063 2022130030 2022130033 2022130062 2022130038 2022130001 Phân Công Tổng hợp word, tìm tài liệu Chỉnh sửa word Tìm tài liệu Tìm tài liệu Tìm tài liệu Tổng hợp power point, báo cáo Phân tích vi sinh thực phẩm Mục lục ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC Tổng quan nấm men nấm mốc Nấm men nấm mốc nhóm vi sinh vật đa dạng, có 400,000 loài nấm men nấm mốc mô tả Đây nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào lớp vỏ chitin, có nhân bào quan khác Tất loài nấm men nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp lượng từ môi trường bên ngoài, vi sinh vật thường xuyên phân lập từ thực phẩm hay nguồn giàu dinh dưỡng khác Ta phân biệt nấm men nấm mốc theo khái niệm sau: − Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành hệ chằng chịt phát triển − nhanh gọi khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm Nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng mờ bề mặt môi trường thạch nấm Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm để tạo nên khuẩn lạc nuôi cấy môi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty Trong thực phẩm sinh trưởng phát triển nấm men, nấm mốc làm thay đổi màu thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc thực phẩm, số tạo độc tố gây ngộ độc − thực phẩm Quá trình tăng trưởng nấm men nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố từ môi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng khoảng 20 – 28 0C, số nhóm ưa lạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến tăng trưởng Hầu hết loài nấm men nấm mốc nấm men phát GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm triển tốt chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, số loài tăng trưởng chất có nước hoạt tính thấp khoảng 60 – 70% Nấm mốc nấm men tăng trưởng vùng pH từ - 9, pH thích hợp nằm khoảng – 6,5 Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, số phát triển điều kiện vi hiếu khí Một số loài tiếp nhận oxy nguyên tử từ chất chúng, dù dạng nào, oxy vẫn nguyên tố cần thiết cho trình phát triển nấm mốc nấm men Mật độ nấm men nấm mốc mẫu xác định chung dạng tổng nấm men nấm mốc kỹ thuật pha loãng, trãi hộp đếm khuẩn lạc môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) Môi trường DRBC sử dụng cho loại mẫu thực phẩm thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn 0.95 thịt, trứng, sản phẩm sữa ( trừ sữa bột ) rau quả, loại pate tươi… Môi trường DG18 sử dụng cho loại mẫu thực phẩm thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ 0.95 khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ sản phẩm đậu đỗ, bột mì, hạch, gia vị… Trong thực phẩm, có diện mốc men, chúng phát triển làm thay đổi màu thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc thực phẩm, số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm Phương pháp định lượng tổng nấm men nấm mốc 2.1 Phương pháp 1: Phương pháp truyền thống 2.1.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 8275-1,2:2012 (ISO 21527-1,2:2008) dùng để định lượng nấm men nấm mốc sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn 0.95% hoạt độ nước nhỏ 0.95% 2.1.2 Nguyên tắc Chuẩn bị đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc qui định Tùy chọn vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định mẫu (nếu GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm sản phẩm dạng lỏng) huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm dạng khác), dung dịch pha loãng thập phân mẫu/huyền phù Có thể chuẩn bị đĩa bổ sung điều kiện, sử dụng dung dịch thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu Ủ đĩa cấy điều kiện hiếu khí 25⁰C ± 10C ngày Các đĩa thạch để ánh sáng khuếch tán từ ngày đến ngày, cần Đếm khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ kính phóng đại kính hiển vi (để phân biệt khuẩn lạc nấm men với khuẩn lạc vi khuẩn), cần Số lượng nấm men nấm mốc gam mililit mẫu tính từ số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu đĩa chọn mức pha loãng tạo khuẩn lạc đếm Nấm men nấm mốc đếm riêng, cần Xác định số lượng nấm men nấm mốc mẫu kỹ thuật pha loãng đổ đĩa, khối lượng mẫu xác định cấy trang môi trường DG18 ( Dichloran Glycerol Agar ) hay DRBC ( Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ) Sau ủ 250C 5-7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men nấm mốc riêng biệt GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm 2.1.3 Môi trường hóa chất Môi trường – Hóa chất Saline Pepton Water (SPW) DG18 DRBC HCl 10% NaOH 10% Mục đích Pha loãng mẫu Nuôi cấy nấm men nấm mốc Chỉnh pH Bảng Môi trường hóa chất 2.1.3.1 Dịch pha loãng 2.1.3.1.1 Yêu cầu chung Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (tất phần), TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm CHÚ THÍCH: bổ sung tác nhân hoạt động bề mặt natri poly (oxyetylen) sorbatitanmonooleat [0,05 % nồng độ khối lượng] vào dịch pha loãng để giảm màng bào tử nấm mốc bào tử dính Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) làm dịch pha loãng, trừ để chuẩn bị mẫu thử cụ thể 2.1.3.1.2 Thành phần canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng) Dịch thủy phân mô động vật thực vật enzym 1,0 g Nước 1000 ml Dịch thủy phân mô động vật thực vật enzyme (1,0g) hàm lượng để vi sinh vật phát triển không nhằm mục đích tăng sinh 2.1.3.1.3 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 250C, cần 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy 2.1.3.2.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) Thành phần GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm Sản phẩm thủy phân mô động vật thực vật 5,0 g enzyme D-Glucoza (C6H12O6) 10,0 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5 g Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g Rose Bengal 0,025 g Thạch từ 12 g đến 15 ga Chloramphenicol 0,1 g Nước cất nước loại ion 000 ml 2.1.3.2.2 Thạch dicloran glycerol 18% (nồng đồ khối lượng) (DG18) Thành phần Sản phẩm thủy phân casein enzym D-Glucoza (C6H12O6) Kali dihydro phosphat (KH2PO4) Magie sulfat (MgSO4.H2O) Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) Glycerol khan Thạch Chloramphenicol Nước cất nước loại ion a Tùy vào sức đông thạch 5,0 g 10,0 g 1,0 g 0,5 g 0,002 g 220 g từ 12 g đến 15 ga 0,1 g 000 ml  Vai trò thành phần môi trường Sản phẩm thủy phân mô động vật thực vật enzyme chứa phong phú chất đạm hữu cơ, cũng có số vitamin đường cung cấp chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển D-Glucoza (C6H12O6) nguồn vật chất cung cấp C trình sinh trưởng vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua loạt trình biến hoá hoá học phức tạp biến thành vật chất thân tế bào sản phẩm trao đổi chất Ngoài ra, nguồn C nguồn cung cấp lượng tốt cho vi sinh vật Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : thành phần acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP… Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm Magie sulfat (MgSO4.H2O): thành phần trung tâm hoạt tính số emzyme, thành phần sắc tố quang hợp Môi trường có chứa dichloran rose bengal nên ức chế kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh , cho phép phát nấm mốc mọc chậm − Rose bengal chất dễ bị phân hủy ánh sáng, nên cần giữ môi trường − tối Glycerol khan có vai trò khử độc cho môi trường Với phương pháp bảo quản lạnh sâu, tế bào bị vỡ trình làm lạnh làm tan mẫu Để khắc phục nhược điểm người ta bổ sung Glycerol làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh Thạch dùng để làm rắn môi trường chất dinh dưỡng cho vi sinh vật sử dụng Cloramphenicol kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, diệt khuẩn nồng độ cao vi khuẩn nhạy cảm cao Nước thành phần thiếu môi trường nuôi cấy, yếu tố quan trọng định phát triển sinh vật Sự trao đổi chất, trình sinh tổng hợp cấu trúc tế bào, nghĩa phản ứng sinh hóa xảy môi trường nước môi trường nước hoạt động dinh dưỡng bị dừng lại, trạng thái khô chất dinh dưỡng thâm nhập vào tế bào 2.1.3.2.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Yêu cầu chung Hòa thành phần vào nước cách đun sôi để hòa tan, trừ chloramphenicol Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 5,6 ± 0,2 250C, cần Cho thêm 10 ml dung dịch chloramphenicol 1% (nồng độ khối lượng) etanol trộn Phân phối môi trường vào vật chứa có dung tích thích hợp Khử trùng 15 hấp áp lực 1210C Làm nguội môi trường nồi cách thủy trì nhiệt độ từ 44 0C đến 470C Làm nguội đến 500C phân phối lượng 15 ml vào đĩa Petri vô trùng GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm Để yên cho môi trường đông đặc làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất phần), cần Sử dụng bảo quản nơi tối thiểu TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất phần) sử dụng CẢNH BÁO - Không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, tiếp xúc với ánh sáng sinh sản phẩm gây độc cho tế bào làm ảnh hưởng đến kết định lượng 2.1.3.2.4 Phương pháp bổ sung chlortetracycline clohydric Việc phát triển mức vi khuẩn vấn đề (ví dụ: thịt tươi), khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50 mg/l) chlortetracycline (50 mg/l) Trong trường hợp nay, chuẩn bị môi trường sử dụng 50 mg chloramphenicol phân phối lượng 100 ml khử trùng Đồng thời chuẩn bị dung dịch Chlortetracycline clohydric 0,1 % (khối lượng) nước (vì dung dịch không ổn định nên phải chuẩn bị trước sử dụng) lọc để khử trùng Ngay trước sử dụng, thêm ml dung dịch cách vô trùng vào 100 ml môi trường đổ đĩa Không khuyến cáo sử dụng gentamicin việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế số loài nấm men 2.1.3.2.5 Phương án bổ sung nguyên tố với lượng vết Để cho nấm mốc thể hoàn toàn hình thái, cụ thể sắc tố chúng, cần đến nguyên tố với lượng vết mà DRBC Để nhận biết nấm mốc môi trường này, thêm dung dịch nguyên tố với lượng vết sau với ml 1li môi trường, trước hấp áp lực: g ZnSO 4.7H2O; 0,5 g CuSO4.5H2O; 100 ml nước cất nước loại ion 2.1.3.2.6 Phương án bổ sung Tergitol (đối với môi trường DRBC) Để tránh Mucoraceae mọc dày đĩa thạch, nên bổ sung Tergitol(1 ml/l) vào môi trường nuôi cấy GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh Phân tích vi sinh thực phẩm 2.1.4 Thiết bị dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ sử dụng lần để thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần có đặc tính kỹ thuật phù hợp Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: Tủ ấm, trì nhiệt độ 250C ± 10C Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa ml, chia vạch 0,1 mlít Nồi cách thủy, dụng cụ tương tự, có khả trì nhiệt độ 44 0C đến 470C Máy đo pH, có độ xác 0,1 đơn vị pH 250C Chai, bình ống nghiệm, để đun sôi bảo quản môi trường nuôi cấy pha loãng dung dịch Đĩa Petri vô trùng, thủy tinh chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ khuếch đại từ 250 lần đến 000 lần) Que dàn mẫu, thủy tinh chất dẻo (đường kính nhỏ mm dài 80 mm) Đường kính không vượt mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vào que kết thúc dàn mẫu Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt khuẩn lạc/tế bào nấm men nấm mốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần) 2.1.5 Thực hành Cân 10g/25g mẫu rắn hút 10ml/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Pepton Water Đồng mẫu máy Stomacher 60 giây Pha loãng Dịch mẫu [ 10-1] 0.1 ml DRBC DG18 0.1 ml 0.1 ml DRBC DG18 DRBC DG18 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 10 Dịch mẫu [ 10-2] 0.1 ml DRBC DG18 Phân tích vi sinh thực phẩm Dàn dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch que dàn mẫu vô trùng khô bề mặt thạch Ủ 250C/3-5 ngày Đọc kết Chọn đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc/mầm/chồi hai độ pha loãng liên tiếp Tính biểu thị kết Hình Quy trình định lượng tổng nấm men-nấm mốc 2.1.5.1 Các bước tiến hành Bước Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Mục đích: chuẩn bị mẫu cho giai đoạn trình phân tích thực xác hơn, chuyển vi sinh vật mẫu ban đầu vào dung dịch pha loãng, đồng mẫu, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, không nhằm mục đích tăng sinh Cân xác 10g/25g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10ml/25ml mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ±5%, cho vào túi nhựa vô trùng ( bình tam giác ) Cho dung dịch pha loãng SPW 90/225ml (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào túi nhựa ( bình tam giác ) chứa mẫu SPW tạo môi trường đẳng trương không làm tổn thương vi sinh vật Đồng mẫu dung dịch pha loãng SPW máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dung dịch pha loãng 2÷3 phút Việc giúp phóng thích vi sinh vật mẫu bên trộn với dung dịch pha loãng mẫu, để bước phân tích xác Để vi sinh vật không bị tổn thương thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha loãng suốt trình thao tác phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 11 Phân tích vi sinh thực phẩm Do bào tử lắng xuống nhanh pipet, nên để pipet tư nằm ngang (không để đứng) làm đầy với thể tích huyền phù dung dịch pha loãng thích hợp Lắc huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng máy vortex để tránh phần tử có vi sinh vật lắng xuống Bước Pha loãng mẫu Mục đích: dung dịch sau pha loãng có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng phân lập vi sinh vật thành khuẩn lạc riêng biệt Từ gián tiếp xác định mật độ tế bào hay bào tử có thực phẩm cũng phân lập để tạo dòng vi sinh vật Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng nhiệt độ thích hợp Trộn kỹ máy vortex 5-10 giây để thu dung dịch pha loãng 10 -2 (đối với loại mẫu làm từ nguyên chất thu dung dịch pha loãng 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5 ,… thu lượng vi khuẩn thích hợp Bước Cấy ủ mẫu Cấy: thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường sống sang môi trường thuận lợi cho phát triển chúng Ủ mẫu: trình đảm bảo trì điều kiện thuận lợi cho hoạt động phát triển vi sinh vật Mục đích: − − − − Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu Tiến hành nhân giống vi sinh vật cách nhanh chóng Bảo tồn giống khiết Nghiên cứu đặc tính sinh học hệ thống sinh học chúng Dùng pipet vô trùng chuyển 0.1 ml mẫu thử lỏng 0.1 ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC DG18 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 12 Phân tích vi sinh thực phẩm Dùng pipet vô trùng để chuyển 0.1ml dung dịch pha loãng thập phân thứ (10-1) ( sản phẩm dạng lỏng) 0.1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 ( sản phẩm dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC DG18 thứ hai Để thuận cho việc định lượng lượng nhỏ nấm men nấm mốc, lấy lượng đến 0.3ml dung dịch pha loãng 10-1 mẫu mẫu thử dạng lỏng, dàn ba đĩa Lặp lại thao tác với dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng cho dung dịch pha loãng Dàn dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa que dàn mẫu vô trùng dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường Có thể sử dụng kỹ thuật cấy phương pháp đổ đĩa trường hợp tương đương kết phải đánh giá cách so sánh với kết cấy bề mặt đĩa Phương pháp cấy bề mặt cho kết định lượng cao Kỹ thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho tế bào tiếp xúc tối đa với oxi không khí tránh nguy bị bất hoạt nhiệt chồi nấm Các kết phụ thuộc vào loại nấm Ủ đĩa chuẩn bị môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thảng đứng tủ ấm 25±1 0C 3-5 ngày Khuyến cáo ủ đĩa túi chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trường hợp nấm mốc lan đĩa Bước Đếm chọn lọc khuần lạc để khẳng định Mục đích: chọn lọc loại vi sinh vật cần định lượng để đếm, thu thập số liệu để tính toán Đếm đĩa khoảng thời gian ủ từ 3-5 ngày Chọn đĩa chứa 150 khuẩn lạc đếm chúng Nếu đĩa có nấm mọc nhanh đếm khuẩn lạc sau ủ ngày đếm lại sau ủ ngày Tiến hành kiểm tra kính hiển vi để phân biệt tế bào nấm men nấm mốc vi khuẩn từ lạc khuẩn, cần Đếm khuẩn lạc nấm men nấm mốc riêng rẽ, cần GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 13 Phân tích vi sinh thực phẩm Để nhận biết nấm men nấm mốc, chọn vùng phát triển nấm lấy để kiểm tra kính hiển vi cấy môi trường phân lập nhận dạng thích hợp 2.1.5.2 Kết 2.1.5.3 Tính toán kết Tổng số nấm men nấm mốc 1g mẫu (X) tính theo công thức X= (CFU/g hay CFU/ml) C: tổng số khuẩn lạc nấm men nấm mốc đếm đĩa độ pha loãng liên tiếp V: thể tích dịch cấy đĩa, tính mililit n1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ n2: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ d: Hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ Làm tròn số kết có tới số có nghĩa ( chẳng hạn 2864 làm tròn 2900) a x 10n biểu thị theo công thức: a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1.0 đến 9.9 n: số mũ phù hợp 10 2.1.5.4 Biểu thị kết Ví dụ cách tính tổng nấm men, nấm mốc: 10-2 10-3 83 13 97 Số khuẩn lạc nấm men nấm mốc đếm hai độ pha loãng liên tiếp là: Độ pha loãng Số khuẩn lạc − − Ở độ pha loãng d=10-2: đếm 83 khuẩn lạc 97 khuẩn lạc Ở độ pha loãng d=10-3: đếm 13 khuẩn lạc khuẩn lạc, ta có X= = Làm tròn kết 9.1 x 104 CFU/g 2.2 Phương pháp 2: phân lập nấm men, nấm mốc ưa khô Phân lập nấm men, nấm mốc chịu thẩm thấu (osmophilic) phát triển nồng độ đường cao Để có gốc giống cần phải điều chỉnh hoạt độ nước GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 14 Phân tích vi sinh thực phẩm (aw) việc pha loãng (diluent) môi trường phân lập nước pha loãng có 50% (W/w) glucose Môi trường thạch chứa 35-60% glucose cho phép tìm lại gốc giống chịu khô hanh (xerotolerant strains) không xảy phát triển điều kiện loại trừ gốc giống hư hỏng tiềm tàng mặt hàng có lượng đường cao mứt kẹo, a w môi trường giảm đòi hỏi ủ ấm kéo dài nhiều tuần Cách làm Chuẩn bị mẫu đồng 10-1 loạt mấu thực phẩm pha loãng dung dịch glucose 50% (W/W) Một ước số phù hợp mẫu đồng pha loãng trải bề mặt cao nấm men, mạch nha 40% (W/W) thạch glucose Ủ ấm đĩa nuôi nấm mốc 20-25 ⁰C đĩa nuôi nấm men 25-30⁰C, nấm men phải tới tuần Đếm khóm nấm men nấm mốc tính toán ước lượng gam 2.3 Phương pháp 3: Đếm nấm men nấm mốc phương pháp màng khô hoàn nước (Phương pháp Petrifilm TM) 2.3.1 Nguyên tắc Phương pháp sử dụng đĩa cấy chứa môi trường khô bổ sung kháng sinh, thuốc nhuộm để tăng khả quan sát phát triển chất tạo đông tan nước lạnh Các dung dịch huyền phù chưa pha loãng pha loãng cho vào đĩa với lượng ml/đĩa Dàn dung dịch huyền phù diện tích khoảng 30 cm2 Có thể dùng chất tạo đông để làm đông đặc đĩa, ủ ấm đếm nấm men nấm mốc 2.3.2 Thuốc thử Trong trình phân tích, sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác − Nước pha loãng, dung dịch nước đệm phosphat: Cho 34 g KH 2PO4 vào 500 ml nước đựng bình định mức lít Dùng natri hydroxit để chỉnh pH đến 7,2 pha loãng nước đến vạch Khử trùng dung dịch 15 nồi hấp áp lực GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 15 Phân tích vi sinh thực phẩm 121 °C Bảo quản dung dịch gốc tủ lạnh Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng pha loãng cách dùng pipet lấy 1,25 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức I pha loãng nước đến vạch Phân phối 90 ml ± ml 99 ml ± ml dung dịch vào chai Khử trùng chai 15 nồi hấp áp lực − − − − − 121 °C Kali dihydro phosphat (KH2PO4) Natri hydroxit (NaOH), dung dịch M (40 g/L) Dung dịch clotetraxyclin Dung dịch cloramphenicol Chất tạo đông tan nước lạnh 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường thiết bị, dụng cụ sau đây: − Đĩa đếm nấm men nấm mốc: Các đĩa chứa chất dinh dưỡng bổ sung clotetraxyclin, cloramphenicol, chất tạo đông tan nước lạnh thuốc nhuộm màu nhạy với phosphataza (5-brom-4-clo-3-indolyl phosphat) để tăng khả quan sát phát triển nấm men nấm mốc Khoanh tròn vùng phát triển − đĩa có ba mươi ô vuông cm x cm màng mỏng1) Que dàn mẫu chất dẻo, để dàn huyền phù lên khắp vùng phát triển đĩa − Pipet, dùng cho huyết học pipet dạng xylanh phân phối 1,0 ml − Dụng cụ đếm khuẩn lạc, loại chuẩn loại có độ khuếch đại tương đương 1,5 lần − Bộ trộn: Bộ trộn có tốc độ cao từ 10 000 vòng/min đến 12 000 vòng/min loại túi nhu động − Binh định mức 1l − Nồi hấp áp lực 2.3.4 Chuẩn bị 2.3.4.1 Yêu cầu chung Bảo quản túi đĩa đựng đĩa đếm nấm men nấm mốc chưa mở nhiệt độ °C Sau mở, để đĩa chưa sử dụng vào lại túi Đóng kín túi cách gấp GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 16 Phân tích vi sinh thực phẩm cuộn đầu mỏ Bảo quản túi đựng đóng kín lại nhiệt độ °C, nơi khô Các đĩa sau mở dùng tháng Để đĩa đếm nấm men nấm mốc tiếp xúc với nhiệt độ cao 25 °C độ ẩm tương đối cao 50 % ảnh hưởng đến tính đĩa Sau sử dụng, đĩa vẫn chứa khuẩn lạc nấm men và/hoặc nấm mốc mà phát triển được, nên trước thải bỏ cần khử trùng hấp áp lực 15 121 °C 2.3.4.2 Chuẩn bị huyền phù thử nghiệm Chuẩn bị huyền phù từ sản phẩm thực phẩm điều kiện vô trùng với độ pha loãng 1/10 lớn nước Trộn trộn túi nhu động đổ đĩa Chuẩn bị dung dịch pha loãng tiếp theo, cần 2.3.5 Cách tiến hành Đặt đĩa đếm nấm men nấm mốc lên bề mặt mặt pbẳng Nhấc màng mỏng phía ra, giữ pipet vuông góc với đĩa cấy cẩn thận ml huyến phù thử nghiệm vào mảng mỏng Đậy màng mòng phía xuống chất cấy Dùng tay nhấc que dàn mẫu chất dẻo Dóng thẩng tâm que dán mẫu với tâm dĩa Dàn huyền phù cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa Không gạt que dàn mẫu từ bên sang bẽn màng mỏng Lấy que dàn mẫu để yên đĩa cho đông đặc lại Đặt đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng cao 20 đĩa Ủ đĩa năm ngày nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C Đếm đĩa sau giai đoạn ủ Các khuẩn lạc nhỏ có màu xanh lục trắng nhạt nấm men Các khuẩn lạc nấm mốc thường có màu xanh cũng có sắc tố tự nhiên chúng (ví dụ: màu đen, vàng, xanh lục), chúng có khuynh hướng lớn khuếch tán nhiều so với khuẩn lạc nấm men Để tính số nấm men nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men nấm mốc/đĩa (hoặc số lương trung bình khuẩn lạc/đĩa, đếm đĩa kép độ pha loãng) với hệ số pha loãng tương ứng Khi đếm khuẩn lạc đĩa kép độ GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 17 Phân tích vi sinh thực phẩm pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình khuẩn lạc cho độ pha loãng trước xác định trung bình số đếm nấm men nấm môc Các số đếm ước tính thực đĩa có nhiều 150 khuẩn lạc phải ghi số ước tính Trong việc đếm thế, xác định số đếm trung bình/1 cm2 nhân với 30 (diện tích phát triển khoảng 30 cm2) Với số lượng lớn khuẩn lạc nấm men làm cho toàn diện tích phát triển trở thành màu xanh Với số lượng lớn khuẩn lạc nấm mốc làm cho toàn diện tích phát triển trở thành màu xanh, màu đen, màu vàng Khi đó, có số đếm ước tính, pha loãng tiếp đổ đĩa huyền phù thử nghiệm để thu số đếm xác 2.3.6 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin đây: − − − − − − − − Mọi thông tin cần thiết để nhận biết hoàn toàn mẫu thử; Viện dẫn tiêu chuẩn phương pháp sử dụng; Kết đơn vị biểu thị kết quả; Ngày tháng lấy mẫu phương thức lấy mẫu (nếu có); Ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm; Ngày tháng thử nghiệm; Các điểm đặc biệt quan sát trình thử nghiệm; Mọi thao tác không qui định tiêu chuẩn này, coi tuỳ chọn, với chi tiết cố mà ảnh hưởng đến kết GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 18 Phân tích vi sinh thực phẩm Tài liệu tham khảo Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM, Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Trần Linh Thước, Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước, Thực Phẩm Và Mỹ Phẩm Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức, Nguyễn Văn Dịp, Vi sinh vật thực Phẩm, kỹ thuật kiểm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 7852:2008, Đếm nấm men nấm mốc phương pháp màng khô hoàn nước ( Phương pháp Petrifilmtm) Hoạt độ nước (ký hiệu aw) lượng nước tự tồn sản phẩm vật chất Nó xác định tỷ lệ áp suất bay nước vật chất chia cho áp suất bay nước tinh khiết điều kiện nhiệt độ Nước cất có hoạt độ nước 1,0 Khi nhiệt độ tăng aw tăng, ngoại trừ số sản phẩm tinh luyện với muốihoặc đường GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 19 [...]... bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các lạc khuẩn, nếu cần Đếm các khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng rẽ, nếu cần GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 13 Phân tích vi sinh thực phẩm Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp 2.1.5.2 Kết quả 2.1.5.3 Tính toán kết quả Tổng số nấm men và nấm mốc. .. tính tổng nấm men, nấm mốc: 10-2 10-3 83 13 97 8 Số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là: Độ pha loãng Số khuẩn lạc − − Ở độ pha loãng d=10-2: đếm được 83 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc Ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 13 khuẩn lạc và 8 khuẩn lạc, ta có X= = Làm tròn kết quả là 9.1 x 104 CFU/g 2.2 Phương pháp 2: phân lập nấm men, nấm mốc ưa khô Phân lập nấm men, nấm mốc. .. đoạn ủ Các khuẩn lạc nhỏ có màu xanh lục hoặc trắng nhạt là nấm men Các khuẩn lạc nấm mốc thường có màu xanh nhưng cũng có thể có sắc tố tự nhiên của chúng (ví dụ: màu đen, vàng, xanh lục), chúng có khuynh hướng lớn hơn và khuếch tán nhiều hơn so với các khuẩn lạc nấm men Để tính số nấm men và nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men và nấm mốc/ đĩa (hoặc số lương trung bình các khuẩn lạc/đĩa, nếu đếm... cao nấm men, mạch nha 40% (W/W) thạch glucose 3 Ủ ấm đĩa nuôi nấm mốc ở 20-25 ⁰C và đĩa nuôi nấm men ở 25-30⁰C, đối với nấm men phải tới 3 tuần 4 Đếm khóm nấm men và nấm mốc và tính toán ước lượng trong mỗi gam 2.3 Phương pháp 3: Đếm nấm men và nấm mốc bằng phương pháp màng khô có thể hoàn nước (Phương pháp Petrifilm TM) 2.3.1 Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường khô được bổ... hàng có lượng đường cao như mứt kẹo, a w của môi trường giảm có thể đòi hỏi ủ ấm kéo dài nhiều tuần Cách làm 1 Chuẩn bị mẫu đồng nhất 10-1 và một loạt mấu thực phẩm pha loãng ở dung dịch glucose 50% (W/W) 2 Một ước số phù hợp của mẫu đồng nhất và pha loãng trải trên bề mặt cao nấm men, mạch nha 40% (W/W) thạch glucose 3 Ủ ấm đĩa nuôi nấm mốc ở 20-25 ⁰C và đĩa nuôi nấm men ở 25-30⁰C, đối với nấm men phải... tiếp, thì tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm của nấm men và nấm môc Các số đếm ước tính có thể được thực hiện trên các đĩa có nhiều hơn 150 khuẩn lạc và phải được ghi là số ước tính Trong việc đếm như thế, xác định số đếm trung bình/1 cm2 và nhân với 30 (diện tích phát triển là khoảng 30 cm2) Với số lượng lớn các khuẩn lạc nấm men có thể làm... này ở nhiệt độ dưới 8 °C, nơi khô ráo Các đĩa sau khi đã mở chỉ được dùng trong một tháng Để các đĩa đếm nấm men và nấm mốc tiếp xúc với nhiệt độ cao hơn 25 °C và độ ẩm tương đối cao hơn 50 % có thể ảnh hưởng đến tính năng của đĩa Sau khi sử dụng, các đĩa vẫn còn chứa khuẩn lạc nấm men và/hoặc nấm mốc mà có thể phát triển được, nên trước khi thải bỏ cần được khử trùng bằng hấp áp lực 15 min ở 121 °C... phân thứ nhất (10-1) ( sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0.1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 ( sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18 thứ hai Để thuận cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0.3ml dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet... thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây: − Đĩa đếm nấm men và nấm mốc: Các đĩa chứa chất dinh dưỡng được bổ sung clotetraxyclin, cloramphenicol, chất tạo đông tan trong nước lạnh và thuốc nhuộm màu nhạy với phosphataza (5-brom-4-clo-3-indolyl phosphat) để tăng khả năng quan sát sự phát triển của nấm men và nấm mốc Khoanh tròn vùng phát triển trên − mỗi đĩa có ba mươi ô vuông 1 cm... dàn mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt thạch Ủ 250C/3-5 ngày Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc/mầm/chồi ở hai độ pha loãng liên tiếp Tính và biểu thị kết quả Hình 1 Quy trình định lượng tổng nấm men -nấm mốc 2.1.5.1 Các bước tiến hành Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Mục đích: chuẩn bị mẫu cho các giai đoạn tiếp theo trong quá trình phân tích thực hiện được chính xác hơn, chuyển