CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Định nghĩa probiotic Probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa “sự sống” Khái niệm probiotic xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, sách “Kéo dài sống” ông đưa 1908 Ông cho người nông dân Bulgary sống lâu nhờ họ tiêu thụ sản phẩm lên men từ sữa Thuật ngữ “probiotic” sử dụng Lily Stillwell [57] năm 1965 để mô tả “những chất” tiết vi sinh vật kích thích phát triển vi sinh vật khác Năm 1974, Parker phát triển định nghĩa này, ông cho probiotic “những vi sinh vật chất mà giúp cân hệ vi khuẩn đường ruột”[69] Sau vào năm 1989, Fuller thay đổi định nghĩa này, ông cho probiotic “thực phẩm bổ sung vi sinh vật sống mà ảnh hưởng có ích lên vật chủ cách cân hệ vi sinh vật đường ruột nó” Định nghĩa nhấn mạnh vai trò khả sống vi sinh vật [32] Năm 1998 Salminen định nghĩa probiotic “những thực phẩm chứa vi khuẩn sống ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ”[77] Trái lại, năm 2002 Marteau định nghĩa probiotic hoàn chỉnh “probiotic chế phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay thành phần tế bào vi sinh vật mà ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ” Một vài định nghĩa mô tả xác hoạt động probiotic phòng trị bệnh dựa khả chữa số bệnh đường ruột probiotic, xem nhân tố trị bệnh [92] 1.1.2 Các chế phẩm probiotic thông dụng Vi sinh vật probiotic thường đề cập nghiên cứu chủ yếu vi khuẩn lactic (LAB) Tuy nhiên, chế phẩm probiotic sử dụng sớm Bacillus subtilis B.subtilis sử dụng qua đường uống để phòng chữa rối loạn tiêu hoá sau dùng kháng sinh, mà nhiều trường hợp dẫn đến tiêu chảy B.subtilis có tác dụng hồi phục hệ vi sinh vật tự nhiên ống tiêu hoá người sau dùng kháng sinh kéo dài bị bệnh Các chế phẩm B.subtilis bán hấu Châu Âu, người ta biết chế tác dụng chúng Bào tử B.subtilis qua rào chắn đường tiêu hoá, phần bào tử nảy mầm ruột non sinh sôi đường ruột Một số tác dụng lâm sàng B.subtilis biết làm tác nhân kích thích miễn dịch số bệnh Ngoài ra, số chế phẩm khác dùng nấm men (Saccharomyces boulardii) Biolactine ,.[3]., chủng Echerichia coli Nissle 1917 đến sử dụng trường hợp nhiễm khuẩn đường ruột ví dụ probiotic LAB [27] Các sản phẩm probiotic phối hợp nhiều chủng vi khuẩn lactic (thường là: L.acidophilus, L.sprorogenes, L.kefir, Streptococcus faecalis ) sử dụng chủng vi khuẩn (như L.acidophilus hay L.sprorogenes…) liệu pháp tốt cho trường hợp rối loạn đường tiêu hoá, giúp trì hệ vi sinh vật có lợi cho tiêu hoá, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu nhiều trường hợp bệnh khác nhờ tác dụng thể người [8, 40] Bảng : Các vi sinh vật AAFCO chấp nhận sử dụng chế phẩm thức ăn cho động vật Mỹ.[80] Aspergillus niger Lactobacillus curvatus Aspergillus oryzae Lactobacillus delbruekii Bacillus coagulans Lactobacillus farciminis Bacillus lentus Lactobacillus fermentum Bacillus lichenformis Lactobacillus helveticus Bacillus pumilus Lactobacillus lactis Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum Acteroides amylophilus Lactobacillus reuteri Bacteroides capillosus Leuconostoc mesenteroides Bacteroides ruminocola Pediococus acidilactici Bacteroides suis Pediococcus cerevisiae Bifidobacterium adolescentis Pediococcus pentosaceus Bifidobacterium animalis Propionibacterium Bifidobacterium bifidum Freudenreichii Bifidobacterium infantis Propionibacterium shermanii Bifidobacterium longum Saccharomyces cerevisiae Bifidobacterium thermophilum Enterococcus cremoris* Lactobacillus acidophilus Enterococcus diacetylactics* Lactobacillus brevis Enterococcus faecium* Lactobacillus buchneri Enterococcus intermedius* Lactobacillus bulgaricus Enterococcus lactis* Lactobacillus casei Enterococcus therniophilus* Lactobacillus cellobiosus * : Trước gọi Streptococcus Những chủng vi khuẩn tiêu thụ đặn với số lượng lớn chế phẩm probiotic : sữa bột trẻ em, thực phẩm lên men, dược phẩm 1.1.3 Một số ứng dụng khác Sản phẩm probiotic lactic ghi nhận sữa lên men dùng cho người Metchnikoff phát sử dụng chủng Lactobacillus bulgaricus để len men sản phẩm từ sữa, nhằm kéo dài thời gian sử dụng chúng Sau đó, sản phẩm probiotic trở nên phổ biến phần động vật Vai trò sữa lên men phần dinh dưỡng người biết từ lâu Nhưng nhà khoa học quan tâm nhiều đến lĩnh vực sau sách "The Prolongation of Life " Ellie Metchinkoff xuất vào năm 1908 Trong đó, ông đề nghị người nên dùng nhiều sữa lên men chứa Lactobacilli để kéo dài tuổi thọ Tuổi thọ rút ngắn nhiễm độc thể, hệ vi sinh vật đường ruột tiết chất độc Các nông dân Bungary đối tượng nghiên cứu cho thấy tuổi thọ kéo dài nhờ dùng môt lượng lớn sữa chua ngày, thói quen dùng sữa chua giúp loại bỏ phản ứng bệnh lí, tình trạng sức khoẻ cải thiện nhờ vi khuẩn lactic có sữa chua Từ đó, nhà nghiên cứu bắt đầu tìm hiểu vai trò vi khuẩn lactic sức khoẻ người động vật [8, 40, 41] Vấn đề tiếp tục quan tâm nay, tiến kỹ thuật cho phép phân lập nuôi cấy vi sinh vật giúp cho việc xác định đặc tính trị liệu chúng Những vi sinh vật đem lại giá trị dinh dưỡng mà đem đến nhiều lợi ích khác Năm 1994, Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO) cho probiotic trở thành hệ thống phòng vệ miễn dịch quan trọng nhất, loại kháng sinh cho phép phổ biến (khi loại thuốc không hữu dụng, tượng kháng thuốc) [55] Các sản phẩm probiotic liệu pháp tốt cho trường hợp rối loạn đường tiêu hoá, trì hệ vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hoá, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu nhiều trường hợp bệnh khác nhờ tác dụng thể người : ngăn cản phát triển vi khuẩn gây bệnh, sản xuất kháng sinh bacteriocin, tăng cường tiêu hoá thức ăn, kích thích hoạt động hệ miễn dịch Ngoài ra, probiotic sử dụng chất hoạt hoá tăng trưởng nhờ có khả đồng hoá lactose, kháng khối u, kháng khuẩn làm giảm cholesterol Probiotic nghiên cứu nhiều điều kiện in vitro in vivo [41] Bên cạnh đó, hiệu tiêu hoá thức ăn động vật phụ thuộc vào vi sinh vật sống tự nhiên hệ tiêu hoá Do máy tiêu hoá người bình thường chứa 1014 tế bào vi sinh vật, gấp 10 lần tổng số tế bào mô thể cộng lại, điều cho thấy hiếu điều hoá vi sinh vật lên hoạt động thể [54] Trước người ta sử dụng kháng sinh thức ăn động vật để cải thiện sức khoẻ phòng bệnh cho động vật chăn nuôi công nghiệp Tuy nhiên, việc sử dụng chất làm cân hệ vi khuẩn đường ruột có lợi làm gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh dẫn đến gây bệnh cho người động vật Những năm gần đây, việc sử dụng sinh vật probiotic acid hữu chất thay kháng sinh thực phẩm quan tâm Sự thích nghi tự nhiên nhiều vi khuẩn lactic (LAB) môi trường ruột chất kháng khuẩn chúng tạo (acid hữu bacteriocin) cho LAB thuận lợi cạnh tranh so với vi sinh vật khác dùng làm probiotic Tiêu chuẩn lựa chọn vi khuẩn lactic probiotic bao gồm : có thể người, độ an toàn, khả sống sót/ độ acid phương tiện vận chuyển, tính chịu acid mật, bám vào biểu mô ruột, khả nhân rộng đường ruột, sản xuất L-lactic acid, sản xuất chất kháng vi trùng, khả kích thích hệ thống miễn dịch vật chủ khả ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng sản xuất vitamin, đồng hoá cholesterol lactose [8, 40] 1.1.4 Cơ chế hoạt động probiotics Kiểm soát triệu chứng kích thích ruột Kiểm soát bệnh nhiễm trùng đường ruột Ngăn chặn vi khuẩn gây bệnh nội sinh Chống lại hình thành tập đoà Cân miễn dịch Cân thành phần vi sinh vật đường ruột Thay đổi hệ thống miễn dịch Ngăn chặn vi khuẩn n gây bệnh ngoại sinh Tăng cường miễn dịch Giảm cholesterol Probiotics Cung cấp chuỗi acid béo ngắn vitamin cho biểu mô ruột Làm giảm dị ứng thực phẩm trẻ em Sự tiết muối mật Ảnh hưởng chế chuyển hoá Giảm mức độc tố/phản ứng đột biến đường ruột Thuỷ phân lactose Giảm tác nhân gây ung thư Cải thiện dung nạp lactose Hình 01: Kiểu tác động probiotic [74] Theo Salminen Ouwehand khả chủng probiotics ảnh hưởng tới sức khoẻ bao gồm chế sau [94]: - Bám chặt vào màng nhầy ruột vi sinh vật - Sản sinh chất kháng sinh vi sinh vật - Chống lại nhân tố gây bệnh chất gây ung thư - Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh - Tương tác với tổ chức lympho đường tiêu hoá (thay đổi khả miễn dịch) - Những thành phần có hại đường ruột (liên kết với độc tố quy định hoạt động chuyển hoá vi sinh vật đường ruột) [90, 71] 1.1.5 Hoạt tính probiotic Các hoạt tính thường quan tâm khảo sát trước nghiên cứu thêm tính hữu ích khác probiotic bao gồm: 1.1.5.1 Chịu pH thấp Trước sử dụng chủng probiotic, cần phải đáng giá khả chịu đựng chúng áp lực đường ruột đặc biệt điều kiện acid Các nhà khoa học chứng minh: probiotic phải trải qua trình tiêu hoá khắc nghiệt 90 phút trước giải phóng từ bao tử vào ruột Ngoài ra, vi khuẩn probiotic phải chống lại enzyme đường miệng lysozyme, acid tiêu hoá, tính độc mật điều kiện áp lực ruột kết Thời gian cho hành trình từ dày báo cáo khoảng 90 phút Tuy nhiên, trình tiêu hoá có thời gian xảy lâu nên vi khuẩn probiotic phải chống lại điều kiện áp lực dày với pH thấp đến khoảng 1,5 Do chủng chọn lọc để sử dụng vi khuẩn probiotic cần phải chịu môi trường pH thấp 90 phút, gắn vào biểu mô phát triển đường ruột trước chúng bắt đầu cung cấp lợi ích cho sức khoẻ Khả chịu acid tính chất để sàng lọc muốn tuyển chọn dòng probiotic [28] Các stress đến vi sinh vật bao tử, với pH khoảng 1,5 đến Sống sót pH 3,0 nồng độ 1000mg/l xem khả chống đỡ đối acid tối ưu chủng probiotic [30] Một số thí nghiệm xác định khả chịu acid số dòng Lactobacillus Bifidobacteria tách chiết từ hồi tràng người Các kết sau so sánh trực tiếp với khả chịu acid dòng Lactobacillus thu từ nhóm nghiên cứu độc lập Bảng 2: Khả sống sót dòng Lactobacillus ruột người gái trị pH khác [80] Chủng Nguồn trích pH dẫn L.casei 161 L.acidophilus 1748 L.paracasei 212.3 L.salivarius Thời gian (phút) 30 Log10 CFU/L ND ND 60 UCC 1,2 ND ND Arla 2,5 1,2 9250 ND 9290 ND 8550 ND 8510 ND AUA 2,5 1,2 8350 9030 8170 3370 7090 6290 ND Các nghiên 2,5 1,2 8600 9000 8610 8930 8520 4240 8600 ND UCC118 cứu 2,5 9570 9580 9620 9550 ND: Không xác định, UCC: Đại học Cork, Cork, Ireland, AUS: Arla, Stockholm, Thụy Điển, Arla: Đại học Nông nghiệp Athens, Athens, Hy lạp Sự sống sót dòng vi khuẩn ước định ban đầu cách bổ sung khoảng 109 – 1011 CFU Lactobacilli vào môi trường MRS pH từ 2,0 đến 3,4 [16] 1.1.5.2 Chịu mật Sau qua dày, vi khuẩn đến vùng ruột, muối mật vào khu vực tá tràng số lượng vi khuẩn giảm Khả chịu đựng muối mật tính cần thiết vi khuẩn có hoạt tính probiotic [45] Vi khuẩn Gram dương nhạy cảm với muối mật acid mật vi khuẩn Gram âm Ngoài ra, nhảy cảm mật phụ thuộc vào nguồn gốc mật Hấu hết Lactobacillus phân lập từ người có khả chịu nồng độ sinh lý mật người [28] Khi acid mật liên kết amid với amino acid glycine hay taurine (một loại amino acid trung gian tạo thành trình chuyển hoá protein) tạo nên acid-muối mật tương ứng: acid glycocholic-muối mật glycocholate, acid taurocholic-muối mật taurocholate, acid glycodeoxycholic-muối mật glycodeoxycholate… hay gọi muối mật kết hợp Hình 02: Tuỳ vào nhóm R1 kết hợp tạo muối mật kết hợp tương ứng [80] Ở hầu hết sinh vật (bao gồm người), trình tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua tiêu thụ cholesterol Cơ thể tổng hợp khoảng 8mg cholesterol ngày dùng 4mg cholesterol để tổng hợp caid mật Tổng cộng có khoảng 20-30g acid mật tiết vào ruột ngày, khoảng 90% mật tiết tái hấp thu sử dụng lại [57] * Chức muối mật Muối mật có hai chức quan trọng tác dụng nhũ tương hoá hoà tan mỡ nước [4] Các nghiên cứu sơ xác định mức độ chịu mật số dòng Lactobacillus tách chiết từ hồi tràng Thí nghiệm thực cách môi trường rắn bổ sung mật bò, mật heo mật người để đạt nồng độ cuối từ 0,3% - 7,5% Môi trường trải vi sinh vật ủ điều kiện kỵ khí 370C ghi nhận khả phát triển sau 24-48 Bảng 3: Khả kháng số dòng Lactobacillus mật bò heo [80] Chủng L.casei 161 L.acidophilus 1748 L.casei F19 L.fermentum KLD L.paracasei 212.3 L.acidophilus 242 L.salivarius UCC118 Nồng độ phần trăm tối đa Mật bò Mật heo % 5,0 0,0 0,5 0,3 ND 0,0 ND 0,0 7,5 0,0 0,0 0,0 5,0 1,0 Thông thường mật bò sử dụng môi trường chọn lọc vi khuẩn đường ruột người hiệu lực tương tự muối mật người nồng độ trung bình 0,3% (w/v) [16] 1.1.5.3 Khả hấp thu cholesterol khỏi môi trường nuôi cấy probiotic 1.1.5.3.1 Tổng quan cholesterol * Cấu tạo: Cholesterol chất béo steroid, có màng tế bào tất mô thể, đặc biệt nhiều mô thần kinh, sỏi mật, thể vàng buồng trứng vận chuển huyết tương động vật Hầu hết cholesterol nguồn gốc từ thức ăn mà tổng hợp bên thể Cholesterol đào thải qua đường ruột, tác dụng vi khuẩn tạo coprosterol [57] 10 - Kết quả: Đối với chế phẩm đông khô sử dụng sữa gầy làm vật liệu đông khô chủng sống sót 100% ( chủng L.garviae (PS14, PS23, PS60,PS95), Ent.Raffiinosus – PS99, Lact.Murinus-PS86); chủng sống sót 60 – 70% (Lact.Reuteri – PS77 Lact.Murinus-PS87); Lact.Murinus-PS85 sống sót 48%; Ent.Raffinonus-PS7 sống sót 81% chủng (L.garviae-PS22 PS48) khoảng 3%-4% sống sót Đối với chế phẩm sấy phun sử dụng sữa gầy 20% + 0.5% cao nấm men làm chất bảo quản 19 chủng sống sót 100% L.garviae (PS14, PS22, PS23, PS48, PS60, PS95) Lact.Murinus (PS85, PS87, PS7, PS77); Lact Murinus-PS86 sống sót 64% chủng Ent.Raffinonus-PS99 sống sót 55% Nghiên cứu “Hiệu probiotic trẻ tiêu chảy cấp” năm 2007[80] - Theo nhà nghiên cứu Italy: Không phải tất chế phẩm probiotic thị trường hiệu tiêu chảy cấp trẻ em Hiệu chúng phụ thuộc vào chủng loại vi khuẩn - Trong thử nghiệm ngẫu nhiên 571 trẻ em từ – 36 tháng bị tiêu chảy cấp điều trị bù nước đường uống Các bệnh nhân sau chọn ngẫu nhiên bù nước đường uống (n = 92) dùng chế phẩm probiotic sau: · Lactobacillus GG (100) · Saccharomyces boulardii (91) · Bacillus clausii (100) · Hỗn hợp loại L delbrueckii var bulgaricus, Streptococcus thermophilus, L acidophilus, and Bifidobacterium bifidum (97) · Enterococcus faecium SF68 - Nhìn chung, bệnh nhân dùng Lactobacillus GG hỗn hợp chủng vi sinh rút ngắn thời gian tiêu chảy so với bệnh nhân sử dụng bù nước đường uống (thời gian trung bình nhóm dùng 48 Lactobacillus GG 78,5 giờ, nhóm dùng hỗn hợp chủng vi sinh 70 so với nhóm sử dụng bù dịch đường uống 115, giờ) Hơn nữa, số lần tiêu ngày đáng kể ngày thứ nhóm điều trị với Lactobacillus GG hỗn hợp chủng vi khuẩn so với dùng bù dịch đường uống Ba chế phẩm probiotic lại cho kết tương tự Nghiên cứu “Sữa chua phòng chống bệnh miệng” Nhật Bản năm 2008 - Theo nhà nghiên cứu Nhật Bản, ăn thường xuyên sữa chua đồ ăn hay đồ uống có chứa axit lactic (loại trừ sữa bơ) cách tốt bảo vệ sức khỏe miệng - Các nhà khoa học Trường Đại học Kyushu Fukuoka (Nhật Bản) cho biết, bệnh viêm chân bệnh kinh niên vi khuẩn, có liên quan đến triệu chứng thiếu hụt lợi hay người lớn Ngoài việc đánh súc miệng thường xuyên, hiệu giảm thiểu tình trạng bệnh hạn chế - Nghiên cứu tiến hành đánh giá tình trạng bệnh viêm chân 942 người (bao gồm đàn ông phụ nữ) độ tuổi 40-79 lượng hấp thụ sữa, bơ đồ ăn chứa axit lactic Kết cho thấy người bị bệnh viêm chân ăn thức ăn có chứa axit lactic Còn người bị bệnh viêm chân không ăn thức ăn chứa axit lactic ăn lượng 55 gram sữa chua hay uống đồ uống chứa axit lactic ngày - Như vậy, giải pháp hợp lý cho bệnh nhân bị viêm chân mãn tính tác động vi sinh vật Probiotic có đồ ăn chứa axit lactic Probiotic vi sinh vật dạng sống, ví dụ khuẩn Lactobacillus có nhiều sữa chua có lợi cho sức khỏe 49 1.5 PROBIOTIC TRONG QUÁ KHỨ, HIỆN TẠI VÀ TƯƠNG LAI Vào năm 1989, công ty ban bố dự án nghiên cứu ảnh hưởng tốt sức khoẻ LAB nhằm mục đích xác định dạng nuôi cấy probiotic sử dụng cho sản xuất Những nghiên cứu dựa chủng có nguồn gốc từ người mà sử dụng công nghiệp nhiều năm Đầu tiên người tình nguyện, họ kiểm tra khả sống sót vi khuẩn vận chuyển đến ruột kết Tiếp theo, kiểm tra khả bám dính thành ruột người chứng minh khả tồn vi khuẩn ruột hoạt động chống lại bám dính vi khuẩn gây bệnh Những nghiên cứu người tiêu thụ sản phẩm sữa lên men ngày phân họ người ta tìm thấy vi khuẩn L.acidophilus Điều chứng tỏ chủng có khả kháng với acid dày muối mật Những vi sinh vật mà bám dính vào tế bào Caco-2 đường ruột người có khả cản trở bám dính Salmonella spp, Yersinia spp, E.coli Sự bám dính phụ thuộc vào calcium yêu cầu chất có protein tiết dịch nuôi cấy Ngoài ra, chất protein hoạt động chống lại vi khuẩn gây bệnh L.acidophilus tiết Ở Châu Âu va Mỹ có tuyên bố khả chống lại vi khuẩn gây bệnh kích thích hệ thống miễn dịch vi khuẩn probiotic Vào năm 1970 phân lập L.acidophilus NCFM Và vi khuẩn có khả sống sót vận chuyển tới ruột kết, có khả bám dính với tế bào Caco-2 invitro theo đường chuyển hoá protein trung gian giảm mức enzyme hoạt động phân Vào năm 1983 phân lập Lactobacillus casei GG, kháng acid muối mật, bám dính tế bào biểu mô invitro Giống L.acidophilus sản sinh chất protein với hoạt tính kháng khuẩn hoạt động chống lại S.typhimurium để cản trở bám dính với tế bào Caco-2 invitro 50 Về khả tiêu thụ sản phẩm probiotics Nhật Bản nước đứng đầu, thứ hai Châu Âu thứ ba Mỹ Năm 1991, phủ Nhật cấp giấy phép cho phép tiêu thụ thực phẩm chức Vào năm 1930 L.casei Shirota phân lập công ty Yakult Honsha sản xuất nhiều sản phẩm probiotics Ví dụ, vào năm 1982 Mil-Mil E sản phẩm yogurt chứa bifidobacteria sản xuất cung cấp vitamin A, C, D E Ở Nhật bắt đầu sản xuất yogurt vào năm 1977 Ở Nhật Châu Âu thực phẩm đồ uống có chứa probiotics phát triển nhanh, ước tính 70 sản phẩm Ở Nhật thực phẩm chức chiếm khoảng 5% Vào năm 1995, công ty Yakult –Hnsha mở rộng thị trường sang nước Châu Âu Sản phẩm probiotic đánh giá ốtt chứa vi khuẩn L.acidophilus, L.casei, Bifidobacteria spp chúng có nguồn gốc từ người, sống điều kiện acid dày, muối mật có khả cư trú ruột kết [34, 40, 47, 61, 70, 83] Nhằm phát triển sản phẩm probiotic nhà khoa học đề xu hướng nghiên cứu tương lai: - Nghiên cứu chế hoạt động probiotic đường ruột phát triển dụng cụ chuẩn đoán, mồi sinh học cho việc đánh giá probiotic - Kiểm tra ảnh hưởng probiotic bệnh nhiễm trùng đường ruột, bệnh nhiễm trùng , bệnh dị ứng - Đảm bảo tính ổn định sống sót sản phẩm probiotic - Đánh giá vai trò probiotic nhóm người tiêu thụ 51 CHƯƠNG II THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM PROBIOTIC DẠNG THỨC UỐNG LÊN MEN TỪ GẠO LỨC 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus từ giống sưu tập khoa Hoá trường Đại Học Bách Khoa Hồ chí minh Chủng L acidophilus nhân giống sữa gầy, mật độ 109 tế bào/ml, bảo quản lạnh nhiệt độ 50C 2.1.2 Dụng cụ thiết bị  Dụng cụ: - Khay hấp - Muỗng, thau - Lọ thuỷ tinh lớn, nhỏ - Đĩa petri - Ống nghiệm, giá để ống nghiệm - Erlen, becher - Đèn cồn, que cấy, đũa thuỷ tinh - Pipette, pipetteman  Thiết bị : - Cân điện tử, tủ lạnh, tủ sấy - Thiết bị chuẩn độ - Máy xay nhuyễn thực phẩm - Lò viba, nồi hấp - Tủ ấm 300C - Bình nuôi cấy kỵ khí - Túi tạo trường vi hiếu khí 52 2.1.3 Vật liệu hoá chất  Vật liệu : - Gạo lức : Gạo lức (Brown rice) loại gạo xay bỏ vỏ trấu, giữ lại nguyên mầm cám hạt gạo bên Gạo lức loại ngũ cốc có giá trị, thành phần có chứa nhiều chất dinh dưỡng nguyên tố vi lượng Không chúng nguyên liệu có chứa nhiều thành phần mang dược tính cao Gạo lức sử dụng đề tài nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic gạo lức đỏ sở sản xuất Xuân Hồng Thành phần dinh dưỡng gạo lứt (100g) Dinh dưỡng Năng lượng tổng Protêin Lipit tổng Glucid Chất béo no Chất béo không no (đơn) Chất béo không no (đa) Cholesterol Tổng chất xơ Tro Nước Đơn vị Kcal g g g g g g mg g g g Gạo lức 370.000 7.940 2.920 77.240 0.584 1.056 1.044 0.000 3.500 1.530 10.370 Gạo trắng 365.000 7.130 0.660 79.950 0.180 0.206 0.177 0.000 1.300 0.640 11.620 Thành phần acid béo (mg/100g) Acid béo Lauric acid (12:0) Myristic acid (14:0) Palmitic acid (16:0) Stearic acid (18:0) Palmitdeic acid (16:1) Oleic acid (18:0) Linoleic acid (18:2/w-6) Linolenic acid (18:3/w- Gạo lức Gạo trắng 0.011 0.498 0.052 0.010 1.046 1.000 0.044 0.003 0.004 0.161 0.012 0.002 0.203 0.146 0.031 3) 53 Thành phần vitamin chất khoáng Dinh dưỡng Natri Kali Cali Phosphor Magie Sắt Kẽm Đồng Mangan Vitamin A Alpha tocopherol Ascorbic acid Thamin Riboflanb Niacin Vitamin B6 Folacin Vitamin B12 Đơn vị mg Gạo lức 7.000 Gạo trắng 5.000 mg mg mg mg mg mg mg mg IU mg mg mg mg mg mg mcg mcg 223.000 23.000 333.000 143.000 1.470 2.020 0.277 3.743 0.000 0.680 0.000 0.401 0.093 5.091 0.509 20.000 0.000 115.000 28.000 115.000 25.000 4.310 1.090 0.220 1.088 0.000 0.110 0.000 0.576 0.049 4.192 0.164 8.000 0.000 Một số sản phẩm chế biến từ gạo lức: Hiện thị trường có nhiều sản phẩm chế biến từ gạo lức: bún gạo lức khô, bánh tráng gạo lức , snack gạo lức, bột dinh dưỡng gạo lức, cháo gạo lức muối mè …hoặc gạo lức thô dùng để nấu cơm Dưới hình ảnh số sản phẩm chế biến từ gạo lức: 54 Bột gạo lứt Tinh chất gạo lứt Snack gạo lứt - Bột lứt Bánh gạo lứt Thức ăn cho người ăn kiêng làm từ gạo lứt Đường tinh sạch: Sử dụng đường saccharose tinh luyện công ty cổ phần đường Biên Hoà - Nước vô trùng  Hoá chất: - NaOH 0,1N KOH 0,1N - Phenolphtalein 2.1.4 Môi trường thuốc thử - Nước pepton - Thạch MRS (de Man, Rogosa, Sharpe agar with Sorbic acid) - Dung dịch Oxy Già H2O2 3% - Dung dịch Tetramethyl - p – phenylenediamine dihydrochloride 1% (dung dịch thử oxydase) - Dung dịch acid sorbic - Bộ thuốc nhuộm Gram 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 55 Gạo lức xử lý, ngâm Hấp chín Đường tinh (150g/l dịch gạo lức) Giống Lactobacillus acidophilus, (5-8% dịch lên men) Xay nhuyễn Dịch lên men Lên men Bổ sung hương liệu Nước vô trùng (tỷ lệ gạo lức hấp chín nước 1:8) - Kỵ khí - Thời gian : 24 - Nhiệt độ: phòng - Màu - Mùi Đóng chai Bảo quản (nhiệt độ mát) 2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu * Xử lý, ngâm: Mục đích: Rửa loại bỏ tạp chất lẫn gạo lức Bên cạnh, nhà khoa học nghiên cứu đưa kết luận, trình ngâm enzyme gạo lức hoạt hoá cung cấp tối đa chất dinh dưỡng Tiến hành: Vo ngâm gạo lức nước khoảng 2giờ trước chế biến 56 * Hấp chín : Mục đích: Để hạt gạo lức chín, nở mềm phục vụ cho trình Tiến hành: Vớt gạo lức sau ngâm, để vào khay có đục lỗ đem hấp chín * Xay nhuyễn : Mục đích: Để tạo hạt tinh bột nhỏ hơn, tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho trình lên men Tiến hành: Sau hấp chín bổ sung vào nước vô trùng đường tinh vào xay nhuyễn Tỉ lệ gạo lứt hấp chín nước vô trùng 1:8 Hàm luợng đường bổ sung vào dịch gạo lứt hấp chín nước vô trùng 150g/l Chú ý : máy xay phải sạch, tránh bị nhiễm, dùng cồn lau khử trùng máy trước sử dụng * Lên men : Mục đích: Đây trình quan trọng định tạo sản phẩm Tạo môi trường điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát triển Tiến hành: Bổ sung 5-8% Lactobacillus acidophilusen/ 100ml dịch lên men, đậy nắp kín Lên men kỵ khí Thời gian lên men 24 nhiệt độ phòng * Bổ sung hương liệu : Mục đích: Tăng cường độ cảm quan cho sản phẩm Tiến hành: Tính toán số liệu bổ sung chất màu (dâu, sôcôla, cam…), bổ sung hương (dâu, sôcôla, cam…) * Đóng chai bảo quản: Sau bổ sung hương liệu, sản phẩm đạt yêu cầu đem đóng chai bảo quản nhiệt độ mát 2.2.3 Các phương pháp sử dụng trình nghiên cứu 57 2.2.3.1 Kiểm tra tổng số vi khuẩn L.acidophilus phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: cho phép xác định số tế bào vi sinh vật sống diện mẫu tế bào sống có khả phân chia tạo khuẩn lạc môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp Cách tiến hành : a) Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1, 10-2, 10-3 - Hút xác 10ml dịch mẫu cho vào bình nón chứa sẵn 90ml nước pepton Lắc 2-3 phút, thu dung dịch mẫu thử 10-1 - Hút xác ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn ml nước pepton Lắc 2-3 phút, thu dung dịch 10-2 - Tiếp tục làm tương tự vậy, ta thu dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3 b) Tiến hành xác định: Bước : Nuôi cấy mẫu - Ghi ký hiệu mẫu nồng độ dung dịch mẫu thử lên đĩa thạch MRS - Dùng pipet vô trùng hút xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử đậm độ nhỏ lên bề mặt đĩa thạch MRS hong khô Dùng que láng vô trùng, láng cho dung dịch mẫu thử phân bố mặt thạch Mỗi mẫu thực phẩm phải nuôi cấy đậm độ Mỗi đậm độ pha loãng phải nuôi cấy đĩa thạch MRS vô trùng riêng - Để đĩa thạch mặt phẳng ngang vòng 15 phút để dung dịch mẫu thấm hết vào bề mặt thạch Sau lật sấp đĩa để vào tủ ấm 3O ± 1o C điều kiện vi hiếu khí 48 Lưu ý: Để tạo khí trường vi hiếu khí tiến hành sau: 58 Cách 1: Sử dụng túi tạo khí trường vi hiếu khí Với bình nuôi cấy có dung tích 3-3,5 lít cần túi, bình nuôi cấy có dung tích 7– lít cần túi Mỗi túi tạo khí cho vào 10 ml nước cất nước máy, sau cho túi tạo khí vào bình nuôi cấy đậy nắp lại thật chặt, để vào tủ ấm 300C 48 Cách 2: Sử dụng bình nến Các đĩa thạch MRS cho vào bình nuôi cấy, ống nước nến cho vào bình, sau đậy nắp thật chặt để vào tủ ấm 300C 48 Bước 2: Xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic đậm độ - Chọn đĩa có không 150 khuẩn lạc đậm độ pha loãng liên tiếp để sơ đọc kết - Đếm ghi lại số khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn Lactic đậm độ: khuẩn lạc tròn nhỏ bóng, màu môi trường, màu trắng đục màu vàng kem; khuẩn lạc có kích thước to tròn lồi trắng đục (dễ nhầm với khuẩn lạc nấm men); đặc biệt khuẩn lạc toả mùi chua acid Lưu ý: Nhìn chung khuẩn lạc vi khuẩn Lactic có kích thước nhỏ nên cần sử dụng máy đếm khuẩn lạc để xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic Bước 3: Xác định vi khuẩn Lactic Từ khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn Lactic tiến hành nhuộm gram, thử nghiệm oxydase catalase (3) * Nhuộm Gram: vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn dài, dạng đơn, đôi xếp thành chuỗi Ngoài vi khuẩn Lactic có hình cầu cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám xếp thành chuỗi 59 * Thử nghiệm oxydase: Đặt miếng giấy lọc vô trùng vào đĩa petri vô trùng, lên lam kính vô trùng Nhỏ vài giọt thuốc thử Tetramethyl - p phenylendiamin dihydrochlorid 1% lên miếng giấy lọc Dùng que cấy Platin que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc (tốt khuẩn lạc không 48 giờ), mài kỹ lên phần giấy lọc nhỏ thuốc thử Lưu ý: - Trước làm phản ứng nên thử lại thuốc thử với hai chủng vi khuẩn có oxydase âm tính oxydase dương tính biết tuỳ theo phòng thí nghiệm Có thể dùng hai chủng chuẩn E.coli ATCC25922 (oxydase âm), Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 (oxydase dương) Đọc kết quả: Nếu xuất màu tím sẫm sau 10 giây oxidase (+) * Thử nghiệm catalase: Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc (tốt khuẩn lạc không 24 giờ) đặt lên lam kính vô trùng Nhỏ giọt dung dịch oxy già (H2O2) 3% phủ lên khuẩn lạc Đọc kết quả: Nếu thấy xuất bọt khí catalase (+) Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn Lactic: - Gram (+), hình trực khuẩn, cầu khuẩn cầu trực khuẩn - Oxydase (-) - Catalase (-) d) Tính kết quả: Để xác định tổng số vi khuẩn Lactic có 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn đĩa có không 150 khuẩn lạc đậm độ 60 pha loãng liên tiếp Sự phân bố khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha loãng cao số khuẩn lạc Tổng số vi khuẩn Lactic có 1g 1ml mẫu thử (N) tính theo công thức sau: ∑C N= V( n1+ 0,1xn2 )d Trong đó: ∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa chọn V: Thể tích cấy đĩa tính ml n1: Số đĩa đậm độ pha loãng thứ giữ lại n2: Số đĩa đậm độ pha loãng thứ hai giữ lại d: Hệ số pha loãng đậm độ pha loãng thứ Làm tròn kết thu đến hai chữ số có nghĩa (nếu số cần làm tròn nhỏ số đứng trước không thay đổi Nếu số cần làm tròn lớn số đứng trước tăng lên đơn vị, tiếp tục làm tròn hai chữ số có nghĩa) Số vi khuẩn Lactic có 1g 1ml thực phẩm biểu thị số thập phân từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10 n (trong n luỹ thừa tương ứng 10) 2.2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid lactic Nguyên tắc : dùng dung dịch kiềm chuẩn (NaOH hay KOH) để trung hoà acid lactic có mẫu, với phenolphtalein làm thị [8,12] Cách tiến hành : - Hút 10ml dịch lên men, bổ sung thêm 20ml nước cất vài giọt phenolphtalein 61 - Chuẩn độ NaOH 0,1N Ghi nhận số ml NaOH sử dụng 62 [...]... xuất ra lactic (đồng lên men) Con đường biến dưỡng pentose với kết quả là lactic acid, thêm vào các sản phẩm khác như acetic acid, ethanlo và CO2 (dị lên men) [19] 1.2.4.1 Lên men đồng hình Vi khuẩn lên men đồng hình gần như chuyển hoá hoàn toàn đường mà chúng sử dụng, đặc biệt glucose thành lactic acid Con đường lên men đồng hình bao gồm các phản ứng thuỷ phân glucose mà đầu tiên là từ hexose thành pyruvate... cấy + Giai đoạn chết ( không hoạt động và không mọc khi nuôi cấy) Dạng tiềm tàng có thể tồn tại trong những sản phẩm probiotic Theo Lahtinen (2005) cho rằng vi khuẩn probiotic trong những sản phẩm lên men có thể trở thành dạng tiềm tàng trong suốt quá trình bảo quản dài Vì vậy khi ta xác định tỉ lệ sống chết bằng phương pháp đếm đĩa thì có thể có những tế bào vi khuẩn còn sống nhưng ở dạng tiềm tạng... bệnh và được tìm thấy trong các sản phẩm từ sữa, thịt, hạt, nước, nước thải, bia, rượu vang, nước ép trái cây, hoa quả, dưa chua cũng như ở miệng, âm đạo, hệ thống dạ dày-ruột người và nhiều loài động vật [28] Các loài lactobacillus được chia thành ba nhóm dựa trên đặc điểm lên men : (1) nhóm lên men đồng hình bắt buột, (2) nhóm lên men dị hình tuỳ ý, (3) nhóm lên men dị hình bắt buột (Pot và ctv.,... hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chữa các bệnh tiêu chảy, táo bón Dựa vào khả năng lên men người ta chia làm hai nhóm là LAB đồng hình và LAB dị hình - Vi khuẩn len men lactic đồng hình tạo acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men glucose, các sản phẩm phụ là ethanol, acid acetic, CO 2, acetone Lên men đồng hình phân giải glucose theo con đường Embden29 Mayerhoff Các vi khuẩn thuộc nhóm... ruột Những cơ chế hoạt động của probiotic chống lại khối u có thể tóm tắt như sau [66]: - Khử độc những chất gây ung thư được đưa vào - Thay đổi môi trường của ruột và hoạt động chuyển hoá của vi khuẩn có thể tạo thành những chất gây ung thư 17 - Tạo thành những sản phẩm chuyển hoá (butyrate) mà những sản phẩm này thay đổi khả năng của tế bào chết khi nó chết - Sản sinh ra những chất ức chế sự phát triển... Lactobacillus[80] Đặc điểm Lên men pentose Nhóm (1) - Nhóm (2) + Nhóm (3) + CO2 từ glucose - + + CO2 từ glucose - + + FDP aldolase - + + Một vài đại diện L.acidophilus L.casei L.brevis 32 L.delbrueckii L.curvatus L.buchneri L.helveticus L.plantarum L.fermentum Đặc điểm Lên men pentose L.salivarius Nhóm (1) - L.sake Nhóm (2) + L.reuteri Nhóm (3) + CO2 từ glucose - + + CO2 từ glucose - + + FDP aldolase... Hầu hết probiotics thì ổn định trong một thời gian ngắn nhất định khi được bảo quản dưới điều kiện lạnh đông hay sấy khô Khả năng sống của vi khuẩn thì phụ thuộc vào hình thức sản xuất (dạng bột, dạng viên hay dạng nang) cũng như việc đóng gói (dạng chai hay túi nhôm…) Khi những vi khuẩn này bị đặt trong những điều kiện có O 2, độ ẩm nhiệt độ sẻ ảnh hưởng lên tế bào vi sinh vật Probiotics dạng lỏng... agar tế bào có hình hạt đậu, tồn tại dạng đôi hay chuỗi Vi khuẩn Gram dương, kị khý tuỳ ý, không di động, không sinh bào tử Nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp đòi hỏi phải có acid nicotinic, acid pentothenic, biotin và thiamin Lên men một số nguồn cacbonhydrat, lên men glucose tạo acid lactic D (-), ethanol và CO 2 vài chủng có khả năng oxi hoá và tạo acid acetic thay vì tạo ethanol Nhiệt độ cho thích hợp... phun tạo ra những bột dạng hạt mịn khô từ dung dịch sền sệt Không khí bên trong buồng sấy phun có thể nâng lên tới nhiệt độ 2000C Nhiệt độ ở đầu ra là nhiệt độ của sản phẩm khi nó rời khỏi buồng sấy phun, nó liên quan đến thời gian giữ những sản phẩm trong buồng sấy phun Phương pháp sấy phun này có thể sử dụng cho những sản phẩm polymer, chất có hoạt tính, muối vô cơ, sắc tố và một vài loại thực phẩm. .. chế phẩm probiotic có chứa L.rhamnosus GG giúp hạn chế hội chứng dị ứng thực phẩm Những đứa trẻ bị dị ứng với protein thịt bò và bị nổi vết chàm khi được cho ăn váng sữa đã thuỷ phân có bổ sung L.rhamnosus GG cho thấy sự cải thiện đáng kể những vết chàm dị ứng trên da, đồng thời giảm tiết α1- kháng trypsin và interferon – α, so với những đứa trẻ chỉ được cho ăn sữa đã thuỷ phân Trong một cuộc thử nghiệm ... tiêu thụ đặn với số lượng lớn chế phẩm probiotic : sữa bột trẻ em, thực phẩm lên men, dược phẩm 1.1.3 Một số ứng dụng khác Sản phẩm probiotic lactic ghi nhận sữa lên men dùng cho người Metchnikoff... nuôi cấy + Giai đoạn chết ( không hoạt động không mọc nuôi cấy) Dạng tiềm tàng tồn sản phẩm probiotic Theo Lahtinen (2005) cho vi khuẩn probiotic sản phẩm lên men trở thành dạng tiềm tàng suốt... lactic (đồng lên men) Con đường biến dưỡng pentose với kết lactic acid, thêm vào sản phẩm khác acetic acid, ethanlo CO2 (dị lên men) [19] 1.2.4.1 Lên men đồng hình Vi khuẩn lên men đồng hình