Đang tải... (xem toàn văn)
Từ rất xa xưa, người ta đã chú ý đến khả năng phát quang tự nhiên của đom đóm và sứa biển. Sự phát quang này không bị kích thích do nhiệt độ mà nó diễn ra một cách bình thường nên được gọi là sự phát quang lạnh. Ông Shimomura làm việc tại đại học Nagoya – Nhật Bản và sau đó ông đã cùng với ông Frank Johnson tại đại học Princeton, New Jersey – Hoa Kỳ tỏ ra rất tò mò về chất mà gây nên sự phát quang đó. Hai ông đã kiên nhẫn và bắt hơn 10,000 con sứa biển để nghiên cứu, chỉ “đổi lấy” vài milligram nhóm chất mà hai ông đang tìm hiểu. Đến năm 1962, hai ông đã cô lập thành công chất hóa học tạo huỳnh quang aequorin có ở loài sứa jellyish Aequorea victoria sống ở vùng nước lạnh biển bắc Thái Bình Dương, protein đó được đặt tên là GFP (green fluorescent protein). Các nghiên cứu sâu hơn vào thời gian sau đó đã giúp hai ông xác định được ba phân tử amino acid gọi là chromophore có trong GFP là thành tố quan trọng cho sự phát quang tự nhiên này. Mang tính nghệ thuật, sự phát quang rực rỡ của GFP cũng dần được con người ứng dụng trong kỹ nghệ làm đồ chơi và những phẩm sáng tạo có màu khác. Tiêu biểu là việc chuyển gen GFP phát sáng vào loài lan Denbrobium Burana White.
CHỦ ĐỀ : CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG GFP CHO HOA PHONG LAN Thành viên : Nguyễn Mạnh Tường Vũ Tú Anh Trần Thị Ngọc Kiều Phạm Thị Ngọc Anh MỞ ĐẦU Từ xa xưa, người ta ý đến khả phát quang tự nhiên đom đóm sứa biển Sự phát quang không bị kích thích nhiệt độ mà diễn cách bình thường nên gọi phát quang lạnh Ông Shimomura làm việc đại học Nagoya – Nhật Bản sau ông với ông Frank Johnson đại học Princeton, New Jersey – Hoa Kỳ tỏ tò mò chất mà gây nên phát quang Hai ông kiên nhẫn bắt 10,000 sứa biển để nghiên cứu, “đổi lấy” vài milligram nhóm chất mà hai ông tìm hiểu Đến năm 1962, hai ông cô lập thành công chất hóa học tạo huỳnh quang - aequorin - có loài sứa jellyish Aequorea victoria sống vùng nước lạnh biển bắc Thái Bình Dương, protein đặt tên GFP (green fluorescent protein) Các nghiên cứu sâu vào thời gian sau giúp hai ông xác định ba phân tử amino acid gọi chromophore có GFP thành tố quan trọng cho phát quang tự nhiên Mang tính nghệ thuật, phát quang rực rỡ GFP dần người ứng dụng kỹ nghệ làm đồ chơi phẩm sáng tạo có màu khác Tiêu biểu việc chuyển gen GFP phát sáng vào loài lan Denbrobium Burana White A.Gen GFP gì? GFP (green flourescent protein) protein gồm 238 acid amin với khối lương 26,9 kDa GFP tự nhiên tách chiết từ sứa hấp thu ánh sáng xanh dương tối đa bước sóng 395nm với đỉnh nhỏ 470nm phát ánh sáng xanh lục với đỉnh phát sáng 508nm, vai nhỏ 540 nm B Phương pháp : I/Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Vectơ Ti - Plasmid Agrobacterium tumefaciens : A.tumefaciens loại vi khuẩn gây bệnh khối u thực vật sống đất, lĩnh vực biến nạp gen sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo thực vật mang gen có đặc tính mong muốn Ti – plasmid có kích thước khoảng 200 – 800 kbp Trên Ti – plasmid có đoạn T – DNA (tumor DNA) giới hạn bờ phải bờ trái Trình tự nucleotid bờ phải bờ trái tương tự T – DNA đoạn có kích thước 25 kb chứa gen tổng hợp opine đoạn chuyển vào tế bào thực vật gắn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ gây bệnh Vùng tiêu hóa opine: Các tế bào khối u có đặc tính tổng hợp “opine” Vùng tiêu hóa opine chứa gen mã hóa protein tham gia trình tiêu hóa opine, làm nguồn dinh dưỡng cho Agrobacterium Vùng vir: Chứa gen vir mã hóa cho protein đóng vai trò cho trình nhận biết, tiếp cận hình thành khối u Agrobacterium Có khoảng 25 gen nhận biết đơn vị phiên mã VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirF, VirG nằm vùng gen vir Ti – plasmid Vùng T – regions: Vùng DNA chuyển vào tế bào thực vật, có kích thước khoảng 10 – 30 kbp, nhỏ 10% Ti - plasmid Ti – plasmid chứa hay nhiều vùng T – region T - region xác định bờ phải (right border) bờ trái (left border) Các border dài 25 bp có độ tương đồng cao Bất DNA định vị chuỗi “border” chuyển vào DNA gọi T – DNA (transferred DNA) ORI: Vùng mã hóa chức chép khởi đầu chép Cơ chế xâm nhiễm Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật : Bản chất tự nhiên vi khuẩn A.tumefaciens xâm nhập vào vị trí tổn thương gây khối u vị trí tổn thương đó.Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành chất độc có chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon) Chất có tác dụng làm lành vết thương, vừa kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti- plasmid Vir protein tạo T-strand từ vùng T-DNA Tiplasmid Sau vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật ,T-strand số protêin vir vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển Trong tế bào thực vật , T-strand tương tác với protein vir tạo thành phức hệ (T-complex) Phức hệ vào nhân tế bào, T-DNA chèn vào gen thực vật biểu gen quan tâm Quy trình : Quá trình chuyển gen thực qua bước sau : - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm (gen phát sáng GFP) - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cDNA từ thư viện genomic DNA) - Chọn vectơ chuyển gen (Ti – plasmid Agrobacterium tumefaciens, gắn thêm promoter CaMV35S) - Biến nạp vào mô tế bào thực vật - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen đánh giá mức độ biểu chúng thử nghiệm in vitro 4 Ưu, nhược điểm : ➢ Ưu điểm : Số gen biến nạp chuyển vào tế bào thực vật thấp Do vậy, giảm tối thiểu không biểu gen chuyển, tăng khả chuyển gen bền vững, hiệu chuyển gen cao Tránh hình thành chuyển gen khảm Kĩ thuật đơn giản,dễ thực Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền ➢ Nhược điểm : Hiệu chuyển gen mầm thấp II/ Phương pháp chuyển gen súng bắn gen: Cơ chế : Súng bắn gen bao gồm hai buồng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không DNA ngoại lai gắn vào hạt tungsten có đường kính nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại khác vàng bạc sử dụng không thường xuyên giá đắt) Các hạt đặt đĩa mặt bên súng Sự bùng nổ khí helium 1000psi làm cho đĩa bắn phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ viên đạn rời khỏi nòng súng Một chắn làm dừng đĩa lại hạt vàng hay tungsten phóng phía tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào phóng thích phân tử DNA Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp biểu gen phân phối Các tế bào biến đổi di truyền sử dụng để tạo thực vật bao gồm sửa đổi di truyền mong muốn tất tế bào chúng Ưu , nhược điểm : ➢ Ưu điểm : Có thể áp dụng hầu hết loại tế bào, mô Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản mặt kĩ thuật Có thể sử lí lượng mẫu lớn thờii gian ngắn Vectơ mang gen tái tổ hợp cấu tạo đơn giản, cần lượng nhỏ plasmid Biểu tạm thời gen biến nạp quan sát thấy sau vài ngày biến nạp ➢ Nhược điểm : Nhiều gen biến nạp chuyển vào tế bào lúc gây khó khăn cho kiểm tra, phân tích biểu gen Hiệu chuyển gen thấp Đòi hỏi thiết bị đắt tiền III/ Kiểm tra mức độ biểu gen: Kiểm tra có mặt promoter CaMV-35S hệ gen lan chuyển gen phương pháp PCR: sử dụng cặp mồi 35S cho đoạn promoter Sự xuất băng có kích thước đoạn khẳng định có mặt gen ngoại lai GFP hệ gen vật chủ Đoạn CaMV-35S promoter điều khiển hoạt động gen GFP Để xác định có mặt đoạn promoter này, tiến hành làm phản ứng PCR với cặp mồi 35S1/35S2 để nhận trình tự đặc trưng Nếu mẫu DNA có phản ứng dương tính (có băng) chứng tỏ promoter 35S chuyển thành công GFP tự nhiên tách chiết từ sứa hấp thu ánh sáng xanh dương tối đa bước sóng 395nm với đỉnh nhỏ 470nm phát ánh sáng xanh lục với đỉnh phát sáng 508nm, vai nhỏ 540 nm Sự phát sáng ổn định GFP hoạt động protein thứ cấp, nhận lượng từ aequorin hoạt hóa Quá trình phát sáng gfp trình tự xúc tác không cần có mặt cofactor hay enzyme Tài liệu tham khảo: Công nghệ gen – Đái Duy Ban Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam – Lê Trần Bình Tạp chí khoa học công nghệ Webside: luanvan.net.vn, http://itb.ac.vn (Viện sinh học nhiệt đới) ... T-DNA chèn vào gen thực vật biểu gen quan tâm Quy trình : Quá trình chuyển gen thực qua bước sau : - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm (gen phát sáng GFP) - Phân lập gen (PCR sàng... chuyển gen bền vững, hiệu chuyển gen cao Tránh hình thành chuyển gen khảm Kĩ thuật đơn giản,dễ thực Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền ➢ Nhược điểm : Hiệu chuyển gen mầm thấp II/ Phương pháp chuyển gen. .. mặt promoter CaMV-35S hệ gen lan chuyển gen phương pháp PCR: sử dụng cặp mồi 35S cho đoạn promoter Sự xuất băng có kích thước đoạn khẳng định có mặt gen ngoại lai GFP hệ gen vật chủ Đoạn CaMV-35S