Đang tải... (xem toàn văn)
Thử tính kháng khuẩn của FLAVONOID trên ADN GYRASE của STAPHYLOCOCCUS AUREUS
I HC QUC GIA THNH PH H CH MINH TRNG I HC KHOA HC T NHIấN KHOA SINH HC Vế TH HNG HNH TH TNH KHNG KHUN CA FLAVONOID TRấN ADN GYRASE CA STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHểA LUN C NHN KHOA HC NGNH SINH HC CHUYấN NGNH: SINH HểA NGI HNG DN KHOA HC PGS TS TRN CT ễNG Tp H Chớ Minh, 2012 I HC QUC GIA THNH PH H CH MINH TRNG I HC KHOA HC T NHIấN KHOA SINH HC TH TNH KHNG KHUN CA FLAVONOID TRấN ADN GYRASE CA STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHểA LUN C NHN KHOA HC NGNH SINH HC CHUYấN NGNH: SINH HểA NGI HNG DN KHOA HC PGS TS TRN CT ễNG Tp H Chớ Minh, 2012 LI CM N tai khúa lun ny c thc hin ti phũng thớ nghim Vi Sinh Cụng Ngh Dc, Khoa Dc, i hc Y Dc Tp HCM, di s hng dn ca: PGS.TS Trn Cỏt ụng v ThS V Thanh Tho Kớnh gi n PGS TS Trn Cỏt ụng v Th.S V Thanh Tho li bit n chõn thnh vỡ s quan tõm, kiờn nhn v tn tỡnh hng dn, to iu kin thun li cho em hon thnh khúa lun tt nghip ny Kớnh gi n Quý Thy Cụ trng i hc Khoa Hc T Nhiờn Tp HCM lũng bit n v nhng kin thc quý bỏu ó truyn t cho em, l nn tng thc hin tai Gi n ch Nguyn Th Linh Giang, anh Nguyn Minh Thỏi, cỏc anh ch cựng cỏc bn Phũng thớ nghim Vi sinh Cụng ngh Dc li cm n v s nhit tỡnh giỳp v mi mt tụi hon thnh tt tai ny Cui cựng, xin cm n gia ỡnh ó luụn bờn cnh v l ngun ng lc giỳp tụi vt qua khú khn Xin chõn thnh cm n ! Sinh Viờn Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa MC LC CH VIT TT .ii DANH MC HèNH iii DANH MC BNG .iii T VN .iv CHNG TNG QUAN vi 1.1 S LC V TèNH TRNG KHNG KHNG SINH vii 1.2 TNG QUAN V STAPHYLOCOCCUS AUREUS xi 1.3 TNG QUAN V FLAVONOID xiii 1.4 ENZYM ADN GYRASE (TOPOISOMERASE II) xix 1.5 PHNG PHP XC NH HOT TNH KHNG KHUN xxiv CHNG VT LIấU VA PHNG PHP NGHIấN CU .xxvi 2.1 I TNG NGHIấN CU xxvii 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU .xxx CHNG KT QU V BN LUN xxxviii 3.1 ng cong sinh trng ca MRSA, MSSA xxxix 3.2 Xỏc nh hot tớnh khỏng khun ca cỏc cht th .xli 3.3 Kt qu chit tỏch s b enzym gyrase xliv 3.4 Kt qu tỏch chit plasmid xliv 3.5 Th nghim tớnh siờu xon gyrase xlvii CHNG KT LUN V NGH l 4.1 Kt lun li 4.2 ngh li TI LIU THAM KHO .lii i Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa CH VIT TT ADN ARN ATCC CFU DMSO MHA MIC LB TSA TSB MRSA MSSA MHA MHB SDS BLB OD VRSA Acid Desoxyribonucleic Acid Ribonucleiic American Type Culture Collection Colony froming unit n v hỡnh thnh khun lc Dimethylsulfoxid Mụi trng thch Muller-Hinton Nng c ch ti thiu Mụi trng Luiria-Bertani Mụi trng Tryptic Soy Agar Mụi trng Tryptic Soy Broth Staphylococcus aureus khỏng methicillin Staphylococcus aureus nhy methicillin Thch Mueller-Hinton Mueller-Hinton broth Natri Dodecyl Sulfat Bacillus Lysic Buffer Optical density - Mt quang Staphylococcus aureus khỏng vancomicin ii Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa DANH MC HèNH Hỡnh 1.1 Hỡnh nh Staphylococcus aureus .xi Hỡnh 1.2 Ngun gc flavonoid xiv Hỡnh 1.3.Khung c bn flavonoid xiv Hỡnh 1.4 Khung chalcon xv Hỡnh 1.5 Hot ng ca topoisomerase II ti chc ba chộp xx Hỡnh 3.6 Cac chõt th s dung tai xli Hỡnh 3.7 Kt qu khỏng MRSA v MSSA ca cỏc cht th xli Hỡnh 3.8 MIC ca cỏc cht th vi MRSA xlii Hỡnh 3.9 MIC ca cỏc cht th vi MSSA xlii Hỡnh 3.10 MIC ca ofloxacin i vi MRSA v MSSA xliii Hỡnh 3.11 Kt qu in di cỏc mu protein trờn gel polyacrylamide xliv Hỡnh 3.12 in di plasmid trờn gel agarose xlv Hỡnh 3.13 Thỏo xon plasmid bng NaOH xlv Hỡnh 3.14 Thỏo xon plasmid bng H2O2 xlvi Hỡnh 3.15 Plasmid c thỏo xon bi topoisomerase I va tinh chờ xlvii Hỡnh 3.16 Th nghim tớnh siờu xon plasmid ca enzym gyrase xlviii DANH MC BNG Bng 1.1 Cu trỳc c bn mt vi flavonoid t trng [21] xiv iii Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa Bng 3.2 Tng trng ca MRSA, MSSA theo thi gian xxxix Bng 3.3 Kt qu nh tớnh s b hot tớnh khỏng khun cỏc chalcon xli Bng 3.4 Kt qu xỏc nh MIC ca cỏc cht th xlii T VN Phỏt minh thuc khỏng sinh l mt nhng t phỏ ln ca y hc hin i Nh ú, rt nhiu cn bnh nhim trựng ó tr nờn cú th kim soỏt c mt cỏch hu hiu Tuy nhiờn, s gia tng tip th v s dng thuc khỏng sinh ó khin hin tng vi khun khỏng thuc tr thnh mt nghiờm trng y hc hin i Tc phỏt trin ca cỏc loi thuc khỏng vi khun mi cng khụng th bt kp sc cng ca vi khun khỏng thuc Rt nhiu nh khoa hc ó bt u lo lng v nú, v h rt n lc tỡm cỏch gii quyt nan gii ny Ti Vit Nam, hin tng khỏng thuc ca vi khun l mt thỏch thc ln cho cụng tỏc chm súc v bo v sc khe Theo thụng bỏo ca trung tõm theo dừi s khỏng khỏng sinh ca vi khun Antibiotic Susceptibility Test Surveillance (ASTS) thng gp Vit Nam, nm 2004 [11]: cú 15.262 chng vi khun c phõn lp ti c s (bnh vin v vin), i din cho Bc, Trung, Nam ca Vit Nam Kt qu phõn lp cho thy ti mi ni cng khỏc [11] Trong cỏc loi vi khun khỏng thuc thng gp, chng nguy him cú mc khỏng cao, thng l yu t gúp phn lm tht bi iu tr ti bnh vin l Satphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli v Streptococcus faecalis Cỏc hóng dc phm v cỏc c quan nghiờn cu khp th gii ang n lc tỡm kim cỏc cht khỏng khun mi chng li chỳng Mi nm u cú vi khỏng sinh mi c chp nhn gúp phn y lựi bnh truyn nhim Mc dự vy, cú c mt khỏng sinh mi cn nhiu thi gian nghiờn cu v chi phớ cao Do ú, mt xu hng mi ngy l phi hp nhng khỏng sinh cú sn thiờn nhiờn tỡm tỏc dng chng li vi khun Phng phỏp ny giỳp tit kim thi gian v chi phớ Bờn cnh ú vic s dng cỏc hp cht cú ngun gc t thiờn nhiờn cng trỏnh c nhng c tớnh ca thuc chỳng c s dng trờn c th ngi iv Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa Flavonoid l mt hp cht t nhiờn phõn b rng rói thc vt Nhng nm gn õy nghiờn cu, sng lc cỏc cht khụng phi l khỏng sinh cú ngun gc t dc liu, cỏc nh khoa hc ó phỏt hin apigenin, luteolin, v dn cht flavon cú hot tớnh khỏng khun Staphylococcus aureus khỏng methicillin [22] Staphylococcus aureus l nguyờn nhõn gõy mt s bnh nhim trựng trờn ngi v ng vt Mc dự hin ó phỏt hin nhiu khỏng sinh mi nhng chỳng khụng tỏc ng trờn Staphylococcus aureus khỏng methicillin Vancomycin l phng k cui cựng iu tr Staphylococcus aureus khỏng a thuc, nhng gn õy ó cú bỏo cỏo Staphylococcus aureus khỏng vancomycin [19] Do ú, vic nhim khun ang l nghiờm trng lõm sng v vic nghiờn cu nhng khỏng khun mi v xỏc nh c ch tỏc ng ca chỳng l mc tiờu ca vic nghiờn cu khoa hc liờn tc v ng dng t nghiờn cu T thc t ú, chỳng tụi tin hnh thc hin ti: TH TNH KHNG KHUN CA FLAVONOID TRấN ADN GYRASE CA STAPHYLOCOCCUS AUREUS Vi cỏc mc tiờu c th nh sau: - Kho sỏt ng cong tng trng xỏc nh thi gian thu nhn ADN gyrase - Tỏch chit s b ADN gyrase - Th hot tớnh ADN gyrase cú mt cht khỏng khun flavonoid v Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa CHNG TNG QUAN vi Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa 1.1 S LC V TèNH TRNG KHNG KHNG SINH 1.1.1 nh ngha khỏng sinh v mt s khỏi nim liờn quan Theo quan nim c, khỏng sinh l nhng cht hay hp cht cú cu trỳc húa hc xỏc nh, chit xut t vi sinh vt (vi khun, x khun, vi nm) dựng vi liu lng nh (hng àg) cú tỏc ng ngn s phỏt trin cỏc vi sinh vt khỏc nh ngha ny Waksman a vo nm 1940 phõn bit cỏc loi thuc mi c khỏm phỏ l penicillin (mt sn phm ca loi nm Penicillum) vi cỏc cht sulfamid tng hp ó c phỏt hin vo nhng nm 30 Sau ú cỏc cht khỏng khun khỏc c bỏn tng hp t tỏc nhõn t nhiờn hay tng hp ton phn thỡ nh ngha ny khụng cũn phự hp na [31] Ngy nay, khỏi nim khỏng sinh c dựng ch nhng hp cht cú ngun gc t nhiờn, bỏn tng hp hay tng hp cú tỏc ng khỏng khun nng thp [27] Chớnh vỡ vy m phm vi tỡm kim cỏc khỏng sinh mi c m rng nhiu Ch mt s ớt khỏng sinh c s dng nh tỏc nhõn húa tr liu, cũn a s nhng khỏng sinh khỏc thỡ c tớnh cao hoc khụng cú tỏc ng c th ngi v ng vt Ngoi ra, mt s khỏng sinh c s dng khụng nhm mc ớch iu tr, vớ d nisin c dựng lm cht bo qun thc phm [31] 1.1.2 Tỡnh trng khỏng khỏng sinh Khỏng sinh l mt nhng phỏt hin quan trng nht i vi sc khe ngi th k XX, giỳp cu nhiu mng sng iu quan trng hin l bo v s hiu qu ca khỏng sinh iu tr nhiu bnh vi khun gõy ngi Khi penicillin c s dng rng rói chin tranh th gii ln th hai, penicillin l mt phộp mu, nhanh chúng lm bin mt nhng vt thng nhim khun Tuy nhiờn, ch nm sau cỏc cụng ty bt u sn xut hng lot vo nm 1943, cỏc loi vi khun khỏng thuc cng xut hin [9] S khỏng khỏng sinh l mt thng gp i vi vi khun S khỏng khỏng sinh vụ cựng nguy him vỡ cú th to ra cỏc chng vi khun khỏng thuc (ln thuc) cng ng Mt s khỏng sinh t rt hu hiu iu tr nghim khun nh ampicillin, tetracillin, chloramphenicolhin ó b khỏng bi cỏc vi khun cú th n 90 - 95% Vỡ vy, khỏng khỏng sinh ang l vii Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa ra, cựng vi sn phm ca quỏ trỡnh trao i cht ó c ch s phỏt trin ca vi khun nờn s lng t bo sinh ớt hn s lng t bo mt i Vy thi gian ti u thu nhn gyrase ca MRSA l 12 14 gi 12 Log (CFU/ml) 11 10 8 12 16 20 24 Thụứ i gian (giụứ ) Biu 3.1 ng cong tng trng ca MRSA Nhn xột: Tng t ng cong tng trng MRSA, i vi MSSA: Pha tim phỏt ca MSSA din khong thi gian rt ngn gi u, vi khun tng sinh rt nhanh v nhanh chúng i vo pha cp s 11 Log (CFU/ml) 10 8 12 16 20 24 Thụứ i gian (giụứ ) Biu 3.2 ng cong tng trng ca MSSA Pha cp s ca MSSA din 14 gi tip theo, lng t bo t cc i sau 14 gi Pha cõn bng din 14 22 gi Sau 22 gi l pha suy vong ca vi khun Vy thi gian ti u thu nhn gyrase ca MSSA l 12 14 gi Võy da vao ng cong tng trng ca MRSA, MSSA, cho thy thi gian ti u thu nhn enzyme gyrase t 12 14 gi xl Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa 3.2 Xỏc nh hot tớnh khỏng khun ca cỏc cht th 3.2.1 nh tớnh cỏc cht khỏng khun Tin hnh nh tớnh cỏc cht th chalcon, N14, N15, N5 v ofloxacin lờn hai chng MRSA, MSSA Phng phỏp th c tin hnh nh mc 2.2.4 Hỡnh 3.6 Cac chõt th s dung tai Kt qu nh tớnh s b c xỏc nh bng vũng c ch s phỏt trin ca vi khun trờn b mt thch Hỡnh 3.7 Kt qu khỏng MRSA v MSSA ca cỏc cht th ofloxacin; chalcon; N14; N15; N5; chng DMSO Bng 3.3 Kt qu nh tớnh s b hot tớnh khỏng khun cỏc chalcon Cht th ng kớnh vựng c ch (d=mm) MRSA MSSA Chalcon 1,3 0,05 1,40,05 N14 1,8 0,01 1,90,01 N15 1,5 0,01 1,30,01 N5 0 Ofloxacin 3,50,15 4,30,15 Nhõn xet: xli Khúa lun c nhõn khoa hc Chuyờn ngnh sinh húa Cac cht th u cú vũng c ch trờn MRSA, MSSA, ú vũng c ch ca chalcon, N14, N15 ng kớnh gn bng khong 1,3 1,9 mm i vi khỏng sinh ofloxacin cú vũng khỏng khun tng i ln nm khong 3,5 mm i vi MRSA v 4,3 mm i vi MSSA Cht N5 khụng khỏng MRSA, cng nh MSSA, chỳng tụi dựng cht ny nh l mt chng õm thớ nghiờm c ch gyrase 3.2.2 Xỏc nh MIC ca cht th v khỏng sinh Sau nh tớnh s b hot tớnh khỏng khun cỏc cht th, tin hnh xỏc nh nng c ch ti thiu (MIC) cua cac chõt: chalcon, N14, N15, ofloxacin Chng õm l N5 v chng DMSO Cỏc cht th c pha loóng bc hai thnh dóy nng 1024-8 àg/ml Hỡnh 3.8 MIC ca cỏc cht th vi MRSA Hỡnh 3.9 MIC ca cỏc cht th vi MSSA Bng 3.4 Kt qu xỏc nh MIC ca cỏc cht th xlii Khúa lun c nhõn khoa hc Vi khun Chuyờn ngnh sinh húa MIC (àg/ml) ca cỏc cht th nghim chalcon N14 N15 N5 Ofloxacin MRSA 32 32 64 >1024 1024 [...]... hóa 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Tách chiết ADN gyrase từ Staphylococcus aureus và thử tính kháng khuẩn flavonoid trên ADN gyrase 2.1.1 Các chất thử trên ADN gyrase - Mẫu flavonoid được cung cấp bởi bộ môn Hóa dược – Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh (xem bảng 2.1) - Bột kháng sinh ofloxacin mua của công ty Sigma Bảng 2.1 Các dẫn chất flavonoid dùng trong thử nghiệm STT Danh pháp 1 Công thức Kí... võng mạc [4] Tác dụng của flavonoid trên vi khuẩn đã được chứng minh Flavonoid có tác dụng yếu trên MRSA, nhưng khi phối hợp một số kháng sinh sẽ làm giảm MIC của các kháng sinh này do các flavonoid làm tăng tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Trên E coli sản sinh ESBL (Extended Spectrum β-Lactamase) cũng có tác dụng tương tự [5] [6] Chalcon tuy là một nhóm phụ của flavonoid nhưng gần đây... nucleid của vi khuẩn, vì vậy có thể giải thích cơ chế ức chế sinh tổng hợp ADN, ARN của flavonoid [18] Ohemeng và cộng sự đã sàng lọc được 14 loại flavonoid ức chế ADN gyrase của Staphylococcus epidermidis, S aureus, E coli, S typhymurium và Stenotrohpomonas maltophilia Gần đây, Plaper và cộng sự đã báo cáo rằng quercetin có tác dụng trên tiểu đơn vị gyrB của ADN gyrase E coli, ức chế hoạt động ATPase của. .. chế enzym ADN gyrase, ngăn sự sao chép nhiễm sắc thể, không cho vi khuẩn sinh sản như ciprofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, perfloxacin [11] Với tình trạng lạm dụng kháng sinh, sử dụng kháng sinh bừa bãi của người dùng thuốc và cả thầy thuốc gây ra tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Chính vì vậy nghiên cứu những kháng khuẩn mới và xác định cơ chế tác động của chúng là mục tiêu của việc nghiên... được gen đột biến đề kháng từ bên ngoài Đặc điểm của loại đề kháng này là phát triển và thay đổi theo thời gian, cách sử dụng kháng sinh, có tính chất khu vực [9] 1.1.3 Nguyên nhân vi khuẩn đề kháng kháng sinh Nguyên nhân của sự đề kháng có thể do tự nhiên nhưng sự góp phần của con người cũng không kém phần quan trọng do việc sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh ngày cành một nhiều của người sử dụng... S .aureus đề kháng trung gian với vancomycin [35] xii Khóa luận cử nhân khoa học Chuyên ngành sinh hóa 1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus Sự đề kháng penicillin và cephalosporin là do S aureus có khả năng tiết βlactam Tính kháng thuốc được truyền bởi plasmid bằng cơ chế chuyển nạp hay giao phối [6] Kháng nafcillin, methicillin, oxacillin thì không phụ thuộc vào β-lactam (do Staphylococcus. .. trong lâm sàng và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh nhằm đánh giá tình hình kháng thuốc của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viên và cộng đồng Ngoài ra phương pháp này còn sử dụng xác định hoạt lực của một loại kháng sinh mới Giá trị MIC cần xác định là kết quả trung bình của 3 lần thử nghiệm: MIC= (n1+n2+n3)/3... khi các loại vi khuẩn bệnh viện kháng loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay đã xuất hiện một cách độc lập tại ít nhất ở tám quốc gia khác nhau [8] Có hại loại đề kháng kháng sinh • Đề kháng tự nhiên Là sự đề kháng của tất cả các chủng trong cùng một loài hoặc cùng một chi đối với một loại kháng sinh hay nói cách khác nó là phổ kháng sinh thông thường của một kháng sinh - Enterococcus đề kháng tự nhiên... chất flavonoid trên ADN gyrase của Ohenmeng và cộng sự Sự ức chế chuyển hóa năng lượng Haraguchi và các đồng nghiệp gần đây đã tiến hành khảo nghiệm hoạt động kháng khuẩn của hai retrochalcon (licochalcone A và C) từ rể cây cam thảo Những chất flavonoid này được chứng minh là có tác động ức chế đối với S aureus và Micococcus luteus nhưng không tác động trên vi khuẩn E coli Trong một thử nghiệm sơ bộ,... vật nuôi [8] 1.1.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Sản xuất enzym để phá hủy hoạt tính của thuốc Staphyloccoci kháng penicillin G là do sản xuất được β-lactam, một số trực khuẩn Gram (-) cũng sản xuất được enzym này Các vi khuẩn Gram (-) kháng được aminoglycoside là nhờ các enzym adenylylase, phosphorylase hay acetylase, còn kháng với chloramphenicol là do vi khuẩn tiết chloramphenicol acetyltransferase ... CA FLAVONOID TRấN ADN GYRASE CA STAPHYLOCOCCUS AUREUS Vi cỏc mc tiờu c th nh sau: - Kho sỏt ng cong tng trng xỏc nh thi gian thu nhn ADN gyrase - Tỏch chit s b ADN gyrase - Th hot tớnh ADN gyrase. .. sinh húa 2.1 I TNG NGHIấN CU Tỏch chit ADN gyrase t Staphylococcus aureus v th tớnh khỏng khun flavonoid trờn ADN gyrase 2.1.1 Cỏc cht th trờn ADN gyrase - Mu flavonoid c cung cp bi b mụn Húa dc... cỏc liờn kt gia cỏc nucleotide, ADN gyrase ni cỏc ADN quỏ trỡnh tng hp v to thnh cỏc vũng xon Cỏc flavonoid c ch mnh s tng hp ADN giai on nhõn ụi c ch enzym ADN gyrase C ch tỏc ng ny hiu qu trờn