Đang tải... (xem toàn văn)
ứng dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bt( bacillus thuringiensis var )
Báo Cáo Tiểu Luận BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Bt (Bacillus thuringiensis) GVHD: Phạm Minh Tuấn NHÓM TP.HCM, THÁNG NĂM 2012 GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận MỞ ĐẦU Hiện nay, phát triển nông nghiệp nước ta vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học hàng lọat biện pháp trồng lúa vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với mục đích khai thác, chạy theo suất sản lượng Chính vậy, với canh tác làm cho đất đai ngày thoái hóa, dinh dưỡng bị cân đối, cân hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật đất bị phá hủy, tồn dư chất độc hại đất ngày cao, nguồn bệnh tích lũy đất nhiều dẫn đến phát sinh số dịch hại không dự báo trước Chính vậy, xu hướng quay trở lại nông nghiệp hữu với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học, phân bón hữu canh tác trồng xu hướng Việt Nam nói riêng giới nói chung Hiện chế phẩm sử dụng nhiều vùng trồng rau Đà Lạt, Vĩnh Phúc, Thanh Trì, Hải Dương, Hà Tây, Đông Anh Việt Nam Nhiều thập kỉ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) phát huy tác dụng tích cực việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ trồng, nhiên gây tác dụng không mong muốn ảnh hưởng xấu đến môi trường sống, ô nhiễm lương thực, thực phẩm, gây ngộ độc chết người Do vậy, việc sử dụng tác nhân sinh học virut, vi khuẩn, vi nấm hay hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để phòng trừ sâu bệnh cho trồng hữu ích cần thiết, thuốc trừ sâu vi sinh lựa chọn Trong thuốc trừ sâu BT thuộc nhóm thuốc trừ sâu vi sinh có nhiều ưu điểm trồng an toàn môi trường nhiều người lựa chọn GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận MỤC LỤC I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung thuốc trừ sâu .4 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học 1.2.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học 1.2.2 Phân loại thuốc trừ sâu sinh học .6 1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Bt 1.3.1 Lịch sử 1.3.2 Phân loại 1.3.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) 1.3.4 Đặc điểm tinh thể độc chế tác động vi khuẩn Bacillus thuringenisis .10 1.3.5 Tính an toàn thuốc sinh học Bt 15 II QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU BT .18 2.1 Tuyển chọn chủng 18 2.2 Lên men 18 2.3 Thu hồi sản phẩm tạo chế phẩm kỹ thuật 20 2.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 21 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành tinh thể Cry .22 III ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BT 23 3.1 Ưu điểm 23 3.2 Hạn chế cách khắc phục 23 IV KẾT LUẬN 25 GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung thuốc trừ sâu Đa số thuốc trừ sâu dùng sản xuất nông nghiệp chất hữu tổng hợp Thuốc trừ sâu lân hữu cơ, thuốc trừ sâu Pyrethroid (Cúc trừ sâu tổng hợp), thuốc điều hoà sinh trưởng côn trùng, (như Atabron, Nomolt…), thuốc trừ sâu Cacbamat, hợp chất hữu khác (Padan, Trebon, Confidor, Regent,…) Một số loại thuốc trừ sâu hợp chất hoá học người tổng hợp ra, chúng chế phẩm chứa vi sinh vật độc tố vi sinh vật tạo có tác dụng trừ sâu: Bacterine, Xentari, NPV, Beauverine,… Ngoài có số thuốc trừ sâu có nguồn gốc thực vật: Fortenone (Rotenone) chế từ rễ ruốc cá, thuốc trừ sâu Nimbecidine chế từ hạt Neem (Xoan Ấn Độ) Thuốc trừ sâu thường tác động đến sâu hại giai đoạn sâu non (ấu trùng) Sâu non tuổi nhỏ dễ mẫn cảm với thuốc, dễ bị thuốc gây độc Trưởng thành nhiều loại sâu hại dễ bị thuốc gây độc (rầy nâu, bọ xít, bọ cánh cứng, …) Thuốc trừ sâu thường có hiệu giai đoạn nhộng Đa số thuốc trừ sâu tổng hợp hữu tác động đến hệ thần kinh côn trùng, có tác động tiếp xúc, vị độc, xông hơi, diệt côn trùng tương đối nhanh: Thuốc trừ sâu lân hữu cơ, Cacbamat, cúc trừ sâu, … Một số thuốc trừ sâu có tác động chủ ngăn cản lột da sâu non ấu trùng hiệu lực trừ sâu thể chậm hơn: Atabron, Nomolt, Applaud… Có loại thuốc trừ sâu lại tác động chủ yếu đến hệ tiêu hoá, phá huỷ vách ruột côn trùng: Thuốc trừ sâu BT Thuộc nhóm thuốc trừ sâu có hợp chất không gây độc trực tiếp cho sâu hại lại góp phần hạn chế đáng kể tác hại chúng đến mùa màng, chất dẫn rụ Methyl Eugenol không gây độc trực tiếp cho côn trùng có tác dụng thu hút nhiều loại ruồi đục trái từ xa di chuyển đến nơi có phun thuốc khiến cho số lượng côn trùng bị nhiễm độc tăng cao (bẫy ruồi đục Vizubon D), từ mà làm tăng hiệu thuốc trừ sâu Hoặc việc sử dụng bẫy Pheromone đồng ruộng vào thời điểm GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận côn trùng trưởng thành rộ ngăn cản ghép cặp để giao phối chúng, khiến cho chúng không sinh sôi phát triển Sự hiểu biết chế tác động thuốc trừ sâu đến sâu hại sở xây dựng kế hoạch dùng luân phiên thuốc trừ sâu ruộng vườn chuyên canh nhằm ngăn ngừa khắc phục tượng kháng thuốc sâu hại Tính độc thuốc trừ sâu người động vật có ích thay đổi nhiều tuỳ theo nhóm thuốc, loại thuốc, dạng thành phần Có thuốc độc với người động vật máu nóng: BT, Applaud, Nomolt, … chúng khuyến khích sử dụng trừ sâu rau xanh, trái cây, … có thuốc có độ độc cấp tính tương đối cao người động vật máu nóng: Methomyl, … lại có thuốc có tính độc cao với ong cá thiên địch sâu hại: Thiodan, … 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học 1.2.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học chế phẩm sinh học sản xuất từ loại thảo dược hay chủng vi sinh vật nuôi cấy môi trường dinh dưỡng khác theo phương pháp thủ công, bán thủ công phương pháp lên men công nghiệp để tạo chế phẩm có chất lượng cao, có khả phòng trừ loại sâu, bọ gây hại trồng nông, lâm nghiệp Thật loại thuốc trừ sâu sinh học bà nông dân sử dụng từ lâu đời kinh nghiệm sống Ví dụ như: sầu đâu (xoan đào), thuốc cá, mủ đu đủ, mủ xương rồng, mủ vú sữa bà sử dụng từ bao đời để diệt sâu bọ, cua, ốc cắn phá trồng Tuy nhiên, việc sử dụng loại cây, để diệt trừ sâu bọ gây hại đòi hỏi nhiều công sức thời gian Để khắc phục khó khăn đó, nhà khoa học giới đầu tư nghiên cứu để chiết xuất hoạt chất, tạo thành dòng sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, chủ yếu trừ sâu, trừ nấm bệnh kích thích sinh trưởng khuẩn Bacillus thuringiensis (BT), nấm Trichoderma, hoạt chất Azadirachtin, bột neem (chiết xuất từ neem - xoan đào), Karanjin - chiết xuất từ hoa đào Ấn Độ, Matrine - chiết xuất từ khổ sâm, Saponin - bã trà, abamectin, emamectin benzoate hoạt chất sản xuất để diệt trừ sâu, bọ hoạt chất Methylamine avermectin GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận 1.2.2 Phân loại thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học Thành phần giết sâu có thuốc sinh học vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) chất vi sinh vật tiết (thường chất kháng sinh), chất có cỏ (là chất độc dầu thực vật) Với thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học chia thành hai nhóm là: - Nhóm thuốc vi sinh: Thuốc trừ sâu vi sinh bao gồm vi sinh vật (ví dụ: vi khuẩn, nấm, virút động vật nguyên sinh) thành phần hoạt hóa Thuốc trừ sâu vi sinh kiểm soát nhiều loài gây hại khác hoạt chất đặc hiệu cho loài gây hại mục tiêu Ví dụ: có loại nấm kiểm soát số loại cỏ dại, loại nấm khác tiêu diệt số loại côn trùng Các loại thuốc trừ sâu vi sinh sử dụng nhiều loài phụ chủng Bacillus thuringiensis, hay Bt - Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu chất độc có cỏ dầu thực vật 1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Bt 1.3.1 Lịch sử Lần vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp phát loài vi khuẩn gây bệnh cho tằm đặt tên Bacillus bombycis Sau vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức Berline phát loài vi khuẩn loài sâu xám Thuringia vùng Địa Trung Hải đặt tên Bacillus thuringiensis (viết tắt Bt) Sau đến khoảng kỷ 20, người ta phát nhiều chủng Bt ký sinh nhiều loài sâu khác sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông Từ vi khuẩn Bt chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng nông nghiệp nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học Bt lần phát vào năm 1901 Nhật Bản nhà sinh vật học Shigente Ishiwarti, ông tìm nguyên nhân gây chết đột ngột số sâu tơ Shigente Ishiwarti phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gọi Bacillus Sotto Năm GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận 1911, Bernard - người Đức, tìm thấy xưởng bột mì Thuringia, giống vi khuẩn ký sinh thể côn trùng, có sức trừ sâu mạnh, gọi khuẩn Thuring 1971, chế phẩm Bt nghiên cứu Với thành tựu di truyền học công nghệ sinh học, người ta phát nhiều chủng Bt có khả ký sinh mạnh, sản xuất chế phẩm có hàm lượng độc tố tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu mở rộng phổ tác dụng nhiều loài sâu hại thuộc nhiều côn trùng nhiều vùng khí hậu khác Đã xác định có tới 150 loài sâu hại bị nhiễm chủng Bt, bao gồm toàn loài sâu hại có Việt Nam Hiện thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học giới nước ta Ngoài việc dùng làm thuốc trừ sâu, người ta tách số gen từ vi khuẩn Bt ghép vào hệ thống gen để tạo giống kháng sâu giống kháng sâu xanh, giống lúa kháng sâu đục thân, sâu lá, giống ngô kháng sâu… Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis var.) nghiên cứu từ năm 1971 Hơn 20 chế phẩm Bt nhập nội địa cho kết tốt phòng thí nghiệm đồng số sâu hại đồng ruộng sâu xanh bướm trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo Các lọai sản phẩm thương mại có thị trường nhiều Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận Hình Sản phẩm Bt thị trường 1.3.2 Phân loại Thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi sinh vật (Bacillus thuringiensis var.) , phổ diệt rộng hữu hiệu với lọai sâu sâu lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp … Có nhiều loại thuốc Bacillus thuringiensis thị trường giới như: - Bacilus thuringiensis var aizawai kiểu serotype, hoạt chất dạng bào tử tinh thể, chế biến thành dung dịch đặc, dùng trừ ấu trùng mọt hại kho tàng - Bacillus thuringiensis var israelensis (tên khác: Teknar) hoạt chất dạng tinh thể ôendotoxin tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var israelensis, Serotype (H-14) Thuốc gia công nhiều dạng dung dịch, bột thấm nước dùng trừ muỗi, ấu trùng ruồi - Bacillus thuringiensis var kurstaki (tên khác Bakthane, Agritol, Bactospeine plus, Biotrol ), hoạt chất dạng bào tử tinh thể ô-endotoxin tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner, var kurstaki, Serotype H-3a 3b Thuốc gia công thành nhiều dạng bột thấm nước, sữa huyền phù, dung dịch đặc dùng trừ ấu trùng Lepidoptera sâu khoang, sâu tơ, sâu xanh nhiều loại sâu khác hại rau, màu ăn trái - Bacillus thuringiensis var morrisoni, hoạt chất dạng bào tử tinh thể ô-endotoxin tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var morrisoni, serotype 8a 8b Thuốc gia công thành dạng bột khô tan nước bột thấm nước, dùng trừ ấu trùng Lepidoptera hại rau, màu, ăn trái, cảnh, công nghiệp - Bacillus thuringiensis var San Diego (tên khác: Myx 1850), dùng để trừ bọ cánh cứng cho khoai tây, cà chua, xanh 1.3.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) Bacillus thuringiensis, loài vi khuẩn đất điển hình phân lập vùng Thuringia, Đức Ở Việt Nam số 185 mẫu đất, bùn thu thập Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Ninh Bình phân lập 920 chủng Bacillus với đặc GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận điểm Gram +, hình que, bào tử không phình Chỉ có 295 chủng số có tinh thể hình tròn, tháp đôi, hình kim Các chủng Bacillus có tinh thể phân loại thành loài Bacillus thuringiensis (Bt) Bt có mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước, ao hồ… Hình dạng tinh thể (một đặc điểm quan trọng để phân loại Bt thành loài phụ) đa dạng Phần lớn chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình tháp đôi , số hình cầu số chủng có tinh thể với hình dạng khác Bt trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, gram dương (không màu nhuộm tẩy iôt cồn, kích thước 3-6 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, chứa tinh thể độc có khả diệt sâu Bt phát triển điều kiện nhiệt độ 15-45 0C thích hợp 29-30 0C Bào tử dạng hình oval, hình trứng dài 1,2 – 1,6 µm Hình Vi khuẩn Bacillus thuringiensis GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page Báo Cáo Tiểu Luận Hình Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trưởng thành tế bào vi khuẩn có bào tử hình trứng tinh thể độc hình trám Hình Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) bào tử (spore) 1.3.4 Đặc điểm tinh thể độc chế tác động vi khuẩn Bacillus thuringenisis a Đặc điểm tinh thể độc Dựa vào chế tác động diệt côn trùng người ta xác định có loại độc tố: - Nội độc tố endotoxin, gọi tinh thể độc crystal: cry I, cry II, cry III, cry IV Hầu hết chủng Bt có nhiều gen tiền độc tố Cơ sở gây bệnh cho côn trùng gen Cry khác Gen Cry chia thành lớp chính: Cry I, II, III, IV GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 10 Báo Cáo Tiểu Luận Hình 6: Helicoverpa armigera Hình 7: Lymantria dispa Hình Bộ cánh cứng Coleoptera Hình Bộ cánh Diptera GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 12 Báo Cáo Tiểu Luận Năm 1955, C.L Hannay P.C Fitz James xác định chất protein có liên quan đến độc tính vi khuẩn Tinh thể độc Bt có dạng hình thoi, hình trám, hình tháp mang chất Protein có độc tính cao với nhiều loại côn trùng, chiếm 30% trọng lượng khô tế bào Khi nhuộm xanh metylen fusin đỏ độc tố bắt màu kính hiển vi đối pha tinh thể độc Tinh thể độc bền vững nhiệt độ cao, có trọng lượng phân tử 5000 đơn vị bào tử có tinh thể độc Trong trình bảo quản để lâu Bt hoạt tính tinh thể độc bị biến dạng phân huỷ Chất focmandehit 20% tia tử ngoại làm hoạt tính tinh thể độc Hình 10 Bào tử Bt tinh thể độc Bản chất hóa học tinh thể: tinh thể độc có nhiều loại acid amin, có hai loại có tỉ lệ cao acid glutamic acid asparaginic Trong tinh thể có chứa lượng lớn nguyên tố C, N, H, O, S Ngoài chứa 19 nguyên tố khác P Các phân tử có khối lương lớn có độc tính loại có phân tử lượng nhỏ độc tính Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố dạng hòa tan, chẳng hạn tinh thể B thuringensis sotto 65oc sau hoạt tính dạng khác hoàn toàn độc tính - Ngoại độc tố (anpha) exotoxin, gọi phospholipaza Thực chất loại men liên quan đến phân hủy phospholipit dẫn đến côn trùng chết - Ngoại độc tố (beta) exotoxin, gọi ngoại độc tố bền nhiệt Chúng có khối lượng phân tử thấp (707-850) Sau 15 phút 120oc hoạt tính Chúng tác động lên côn GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 13 Báo Cáo Tiểu Luận trùng làm cản trở việc tổng hợp ARN thông tin Chúng có tác động cộng hưởng với nội độc tố, sau nội độc tố phá biểu bì ruột giữa, chúng nhanh chóng xâm nhiễm vào huyết tương máu đến quan làm thay đổi trình trao đổi chất làm cho côn trùng mau chết - Ngoại độc tố (gamma) exotoxin, gọi độc tố tan nước chúng có khối lượng phân tử thấp 200-2000, có số acid amin tự do, tan nước, mẫn cảm với ánh sáng đặc biệt hoạt lực 15 phút 600 trở lên b Cơ chế tác động Hình 11 Cơ chế tác động tinh thể độc sâu Khi phun lên cây, protein độc tố dạng tinh thể diệt loại sâu hại định Tác động tinh thể lên côn trùng phức tạp Tác động điển hình làm liệt đường ruột xoang miệng Cụ thể sau sâu hại ăn phải tinh thể tiền độc tố, tác dụng loại men tiêu hoá dịch ruột sâu, tiền độc tố bị hoà tan thành phân tử nhỏ có hoạt tính độc GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 14 Báo Cáo Tiểu Luận Các độc tố bám vào màng vi mao ruột, tạo lỗ rò nước chảy vào, làm sâu mọng nước, ngừng ăn chết Sau ăn tinh thể 1-7 tằm dâu bị liệt toàn thân tế bào thượng bì Sau ăn phút, tinh thể xuất thượng bì ruột sâu xanh bướm cải Một số tế bào bị tách rời, biến đổi, chất bên chảy màng (như sâu độc thân) làm tăng tính thấm thẩu Kali chứng minh tăng K+ máu bạch huyết nguyên nhân gây tê liệt đường ruột toàn thân tằm dâu Sự thay đổi tác động tinh thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố Chẳng hạn bình thường, vào ruột trước ruột giữa, pH cao (>7.0) thể chế giải độc, tinh thể vỡ làm nhiễm độc máu Hiện tượng thấy phổ biến tằm, sâu róm, bướm cải…Tuy nhiều trường hợp tinh thể độc vỡ ra, số loài sâu có chế tự giải độc, ngừng ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau thời gian định đường tiêu hóa phục hồi Các động vật có vú không bị ngộ độc ăn phải tinh thể chất pepsin ruột động vật (hoạt động thích hợp pH =2) làm tính độc tinh thể vi khuẩn Hình 12 Sâu chết trúng độc từ thuốc trừ sâu Bt 1.3.5 Tính an toàn thuốc sinh học Bt Các sản phẩm Bt sử dụng rộng rãi giới, chiếm đến 2% tổng sản lượng thị trường thuốc trừ sâu thị trường giới vào năm 1990 Protein Cry có tính đặc hiệu cao tới loài côn trùng có chủ đích Các protein Cry không ảnh hưởng tới loài sinh vật khác Trong gần 40 năm sử dụng rộng rãi toàn giới, chúng GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 15 Báo Cáo Tiểu Luận ta chưa tìm thấy ảnh hưởng xấu chúng tới sức khỏe người hay môi trường (EPA, 1998a; Mc Clontock et A; 1995) Kể từ năm 1961 đến năm 1998 Hoa Kỳ có 180 sản phẩm vi sinh Bt đăng ký kiểm định Tại châu Âu có 120 sản phẩm Theo khảo sát gần WHO tính an toàn sản phẩm vi sinh Bt khẳng định rằng: Không tồn mối nguy hiểm sản phẩm Bt tới người, động vật có xương sống khác tới sinh vật không chủ đích khác” (IPCS, 2000) - Sức khỏe người: Các nghiên cứu tính an toàn thuốc trừ sâu vi sinh Bt 40 năm chứng minh không tìm thấy dấu hiệu ảnh hưởng tới việc tăng cân, khám nghiệm lâm sàng hay tử thi.” (McClintock et al., 1995) Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Prôtectin Agency US-EPA) triển khai đánh giá độc tố chí protein Bt thử liều lượng cao Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), dự án thông tin thuốc trừ sâu số trường đại học Hoa kỳ cho thấy “Kết thử nghiệm 18 người ngày ăn gram Bt thương mại vòng ngày, ngày khác nhau… không gây chứng bệnh Những người ăn gram Bt/ngày ngày liên tục hòan toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh” Hơn nữa, mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy dịch vị dày (trong điều kiện phòng thí nghiệm) (Extoxnet, 1996) - Ảnh hưởng đến môi trường: Nước ngầm hệ sinh thái đất: Protein Bt tồn tương đối bền đất phân loại vào dạng bất động khả di chuyển thấm qua nước ngầm Protein không bền vững điều kiện đất axit, bị phân hủy nhanh chóng phơi ánh sáng mặt trời, tác động tia UV Các chuyên gia tiến hành nghiên cứu độc lập nhằm điều tra ảnh hưởng trồng Bt sinh vật đất loài côn trùng khác xem có ích nông nghiệp Kết cho thấy, chúng không gây ảnh hưởng bất lợi sinh vật đất đích công chúng, chí cá sinh vật GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 16 Báo Cáo Tiểu Luận xử lý Bt với liều lượng cao nhiều so với thực tế xảy điều kiện trồng trọt tự cho thấy thay đổi quần thể vi sinh vật đất cánh đồng có nguyên liệu thực vật Bt cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống (Donegan cộng sự, 1995), không quan sát thấy khác biệt cánh đồng trồng Bt không chuyển gen Bt (Donegan cộng sự, 1996 ) - Động vật côn trùng: Các thử nghiệm tiến hành chó, chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông chim cho thấy protein Bt không gây ảnh hưởng có hại Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến loài côn trùng có ích động vật ăn thịt ong mật bọ cánh cứng (Extoxnet, 1996) Năm 1999, có báo cáo ảnh hưởng có hại hạt phấn từ ngô Bt đến ấu trùng loài bướm Monarch Báo cáo gây mối quan tâm lo ngại rủi ro mà thực vật Bt gây sinh vật không cần diệt Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy ngô Bt gây ảnh hưởng không đáng kể quần thể bướm Monarch cánh đồng Nỗ lực nghiên cứu hợp tác nhà khoa học Hoa Kỳ Canada cung cấp thông tin để xây dựng trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn ảnh hưởng ngô Bt quần thể bướm Monarch Họ đến kết luận rằng, hầu hết giống lai thương mại, protein bt biểu với nồng độ thấp hạt phấn nghiên cứu phòng thí nghiệm cánh đồng cho thấy mật độ hạt phấn không gây ảnh hưởng có hại đồng ruộng - Tính an toàn trồng bảo vệ Bt chứng minh nhờ đặc tính sau: + Cây trồng bảo vệ Bt độc tố tới người không tìm thấy dấu hiệu dị ứng GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 17 Báo Cáo Tiểu Luận + Dựa hai tiêu chí (về lương thực thực phẩm) trồng Bt an toàn cho tiêu thụ + Các protein Cry gần độc tố tới sinh vật không chủ đích, ngoại trừ loài côn trùng có quan hệ gần gũi với vật chủ đích, + Protein Cry,các marker trồng Bt không tìm thấy rủi ro tới môi trường II QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU BT 2.1 Tuyển chọn chủng - Chọn chủng tự nhiên có độc lực cao: Phân lập từ đất côn trùng Ở Việt Nam có khoảng 10 chủng Bacillus thurigensis phân lập để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Mỗi chủng VSV chứa vài gene tổng hợp protein gây độc với lọai sâu định - Tạo giống gây đột biến công nghệ gen: Để sản xuất chế phẩm diệt nhiều lọai sâu, người ta tiến hành xác định ( có chọn lọc ) đọan gene dùng kĩ thuật chuyển gene để đưa vào chủng Bt Chủng giống Bt sau cấy vào bình lên men, điều kiện nhiệt độ thích hợp (28-30 độ C) Sau khoảng 52-54 thu hoạch dịch thể chứa tinh thể protein độc tố sâu hại 2.2 Lên men - Nhân giống cho nuôi cấy vi khuẩn: Mục đích: Tạo lượng giống hoạt hoá nhằm giúp giai đoạn pha lag phát triển nhanh Nếu lag kéo dài: tốn thời gian, môi trường Thời gian pha lag phụ thuộc: lượng giống, trạng thái sinh lý giống: + Tỷ lệ giống chọn: – 10% GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 18 Báo Cáo Tiểu Luận + Giống vi khuẩn tiếp vào vi khuẩn giai đoạn phát triển log, tế bào chuyển hoá mạnh Cuối pha log bắt đầu xảy tạo bào tử, kéo dài pha lag - Thành phần môi trường: Thành phần Bột đậu tương Bột khô lạc Bột ngô Nước chiết ngô Tinh bột Bột cá Pepton Glucose Rỉ đường Cao nấm men K2PO4 K2HPO FeSO4.7H2O MgSO4.7H2O MnSO4.7H2O ZnSO4.7H2O CaCO4 (NH4)2SO4 22 10 10 1 0.02 - 22.5 20 15 1.5 - 30 30 45 0.02 0.3 0.02 0.02 - Hàm lượng (g/l) 40 14 20 16.7 7.5 30 18.6 0.75 - 18 25 - 36 40 - 20 - 2.16 1.1 - - 10 20 - - 1 - 0.7 - Bảng 1: Thành phần môi trường nuôi cấy Bt Có hai phương pháp sản xuất chế phẩm Bt lên men bán rắn lên men chìm - Phương pháp lên mem chìm Phương pháp coi tốt để sản xuất chế phẩm Bt thương mại Chuẩn bị môi trường lên men: Hoà trộn thành phần môi trường nước; trùng; làm nguội bơm vào thiết bị lên men Quá trình lên men: Nhiệt độ: 28 – 34oC pH: pHBĐ = 6,8 – 7,2; pHQT 5,5 – 5,6 Hoặc giữ không đổi cách sử dụng NaOH; NH4OH H2SO4 GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 19 Báo Cáo Tiểu Luận Bổ sung dầu phá bọt polypropylen, glycol, silicon dầu thực vật tinh chế môi trường giàu protein Điều khiển lượng oxy hoà tan thích hợp Dừng lên men đạt tỷ lệ tách bào tử tự lớn nhất: 36– 96 - Phương pháp nuôi cấy bán rắn Chuẩn bị môi trường lên men: Cám, nước dung dịch dinh dưỡng, muối khoáng trộn lẫn trùng Giống nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm máy lắc Quá trình lên men: Nhiệt độ: 30oC Độ ẩm môi trường: 50 – 70% Độ ẩm không khí nuôi cấy: 80 – 100% Kết thúc lên men thường sau 48 giờ; không khí ẩm thay không khí khô để giảm độ ẩm sản phẩm xuống 4% 2.3 Thu hồi sản phẩm tạo chế phẩm kỹ thuật Sau khoảng 52-54 thu hoạch dịch thể chứa tinh thể protein độc tố sâu hại - Điều chỉnh pH dịch lên men 4,1 H2SO4 5M - Ly tâm liên tục dịch lên men ≥ 8000g < 35ºC, khuấy trộn liên tục thùng lên men - Lấy mẫu - Bổ sung từ từ chất phân tán với tỷ lệ 2% 1% gum arabic 5% lactoza đảo trộn phút để đảm bảo không vón cục - Sấy phun đến hàm lượng nước 6-7% - Sàng qua lỗ < 50µm, nghiền cục kích thước lớn < 35ºC - Thử hoạt tính sản phẩm GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 20 Báo Cáo Tiểu Luận Thành phần Phần trăm (w/w) Vai trò Dịch lên men ly tâm 97 Tác nhân sinh học Dung dịch Bevaloid 211 Chất phân tán 40% Gum arabic Chất bảo vệ sấy Bảng 2: thành phần chế phẩm kỹ thuật 2.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm - Hiệu lực diệt sâu, kích thước hạt, độ ẩm, pH, độ thấm ướt, độ phân tán, độ tạo huyền phù, độ nhớt… - Hiệu lực sinh học Số lượng tế bào bào tử tự do: Số lượng tê bào bào tử: đếm kính hiển vi quang học số lượng bào tử tự do: đếm số khuẩn lạc môi trường thạch Hiệu lực diệt sâu: Liều lượng gây chết ấu trùng côn trùng: LC50 LC95 Liều thử 25-50 ấu trùng, Thời gian 24 giờ, số lần lặp lại 4-6 lần Trọng lượng phân tử protein tinh thể: Xác định phương pháp điện di gel polyacrylamid (PAGE GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 21 Báo Cáo Tiểu Luận 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành tinh thể Cry Hình 13 Động học trình phát triển, tạo bào tử tinh thể độc - Nhiệt độ thích hợp: 25 – 35oC; Topt = 30oC - pH thích hợp: 7,0; pH cao thấp làm biến tính tinh thể - Lượng oxy đưa vào môi trường phải tuỳ theo giai đoạn: Giai đoạn sinh trưởng thiếu oxy: tích luỹ sinh khối giảm mạnh Giai đoạn tạo bào tử hình thành tinh thể độc: thừa oxy lượng bào tử không thay đổi lượng tinh thể tạo thành giảm mạnh - Tác động axit amin: Lơxin izolơxin ức chế sinh trưởng hình thành bào tử Bt Nếu có mặt thêm valin tác dụng ức chế bị Có mặt treonin serin ức chế sinh trưởng hình thành bào tử Bt Nếu có mặt hai axit amin lúc tác dụng ức chế bị Tác dụng ức chế serin có mặt metionin Chất kháng sinh erythromycin nồng độ thấp chưa đủ ức chế sinh trưởng Bt, cản trở hình thành bào tử GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 22 Báo Cáo Tiểu Luận III ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BT 3.1 Ưu điểm Kết thử nghiệm cho thấy chế phẩm Bt diệt gần 90% sâu hại, so với gần 80% thuốc hoá học - Không gây ô nhiễm môi trường - Bt có hiệu lực cao sâu kháng loại thuốc gốc lân, carbamat,… - Tinh thể độc Bt tạo hoà tan dịch dày người nên thuốc trừ sâu sinh học Bt hoàn toàn vô hại người, sinh vật khác - Không độc với cá, ong mật loài thiên địch - Thời gian cách ly ngắn 3.2 Hạn chế cách khắc phục - Chỉ diệt sâu non chúng ăn lá, không diệt trứng, nhộng bướm - Dễ bị phân huỷ tia cực tím có ánh mặt trời - Có tác động vi độc, không tiếp xúc - Hạn chế lớn phát tác chậm, 48 tiếng sau ăn độc tố sâu chết Tác động thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu chậm thuốc trừ sâu vi sinh thường có trình gây bệnh nhiễm bệnh vào thể sâu thời gian ủ bệnh phải 1-3 ngày Thuốc vi sinh có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao Việt Nam Cách khắc phục: - Nên ý phun sớm từ sâu non từ 1-3 ngày tuổi - Nên phun vào lúc chiều mát - Cần phun ướt hai mặt GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 23 Báo Cáo Tiểu Luận GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 24 Báo Cáo Tiểu Luận IV KẾT LUẬN Mặc dù có nhược điểm ko thể tránh khỏi hiệu thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phủ nhận.Với đặc tính không gây hại cho môi trường sinh vật có lợi chế phẩm sinh học thuốc trừ sâu Bt nên sử dụng rộng rãi để thay sản phẩm hóa học Hiện thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học giới nước ta diệt nhiều loại côn trùng gây hại cho trồng Thuốc trừ sâu Bt công cụ diệt sâu bệnh thực vật Vấn đề khai thác khả giảm thiệt hại mùa màng tăng sản lượng lương thực trở nên cấp bách dân số toàn cầu tăng lên nhanh chóng diện tích đất canh tác lại giảm đáng kể Cùng với kỹ thuật canh tác nông nghiệp thích hợp, công nghệ kháng côn trùng Bt đem lại nhiều lợi ích cho loài người GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 25 Báo Cáo Tiểu Luận TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] vietbao.vn/Khoa-hoc/Dung-vi-khuan-lam-thuoc-tru-sau [2] www.slideshare.net/haucsk32/thuoc-tru-sau-bt [3] Phòng trừ sâu hại công nghệ vi sinh - Chu Thị Thơm, NXB Lao động, 2006 [4] http://www.wattpad.com/855399-vk-gay-benh GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 26 [...]... ko thể tránh khỏi nhưng hiệu quả của thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis là không thể phủ nhận.Với những đặc tính không gây hại cho môi trường và sinh vật có lợi thì chế phẩm sinh học thuốc trừ sâu Bt nên được sử dụng rộng rãi để thay thế các sản phẩm hóa học Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới cũng như ở nước ta... Luận III ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BT 3.1 Ưu điểm Kết quả thử nghiệm cho thấy các chế phẩm Bt diệt được gần 90% sâu hại, so với gần 80% của thuốc hoá học - Không gây ô nhiễm môi trường - Bt có hiệu lực cao đối với sâu đã kháng các loại thuốc gốc lân, carbamat,… - Tinh thể độc do Bt tạo ra không thể hoà tan trong dịch dạ dày của người nên thuốc trừ sâu sinh học Bt hoàn toàn vô hại... phải tinh thể là do chất pepsin trong ruột động vật (hoạt động thích hợp khi pH = 2) đã làm mất tính độc của tinh thể vi khuẩn Hình 12 Sâu chết do trúng độc từ thuốc trừ sâu Bt 1.3.5 Tính an toàn của thuốc sinh học Bt Các sản phẩm Bt được sử dụng rộng rãi trên thế giới, chiếm 1 đến 2% tổng sản lượng thị trường thuốc trừ sâu trên thị trường thế giới vào những năm 1990 Protein Cry có tính đặc hiệu cao... côn trùng Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 10 chủng Bacillus thurigensis được phân lập để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Mỗi chủng VSV chỉ chứa 1 hoặc 1 vài gene tổng hợp protein gây độc với 1 lọai sâu nhất định - Tạo giống bằng gây đột biến và công nghệ gen: Để sản xuất được chế phẩm diệt được nhiều lọai sâu, người ta tiến hành xác định ( có chọn lọc ) những đọan gene đó rồi dùng kĩ thuật chuyển gene... Theo cuộc khảo sát gần đây của WHO về tính an toàn của sản phẩm vi sinh Bt và đã khẳng định rằng: Không tồn tại mối nguy hiểm nào của sản phẩm Bt tới con người, động vật có xương sống khác hoặc tới các sinh vật không chủ đích khác” (IPCS, 200 0) - Sức khỏe con người: Các nghiên cứu về tính an toàn của thuốc trừ sâu vi sinh Bt trong hơn 40 năm đã chứng minh rằng không tìm thấy dấu hiệu ảnh hưởng nào tới... Lơxin và izolơxin ức chế sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Bt Nếu có mặt thêm valin thì tác dụng ức chế bị mất đi Có mặt treonin hoặc serin ức chế sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Bt Nếu có mặt của cả hai axit amin cùng một lúc thì tác dụng ức chế bị mất đi Tác dụng ức chế của serin mất đi khi có mặt của metionin Chất kháng sinh erythromycin ở nồng độ thấp chưa đủ ức chế sinh trưởng của Bt,... các sinh vật khác - Không độc với cá, ong mật và các loài thiên địch - Thời gian cách ly ngắn 3.2 Hạn chế và cách khắc phục - Chỉ diệt được sâu non khi chúng ăn lá, không diệt được trứng, nhộng và bướm - Dễ bị phân huỷ bởi tia cực tím có trong ánh mặt trời - Có tác động vi độc, không tiếp xúc - Hạn chế lớn nhất là phát tác chậm, 48 tiếng sau khi ăn độc tố thì sâu mới chết Tác động của thuốc trừ sâu. .. ăn độc tố thì sâu mới chết Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày Thuốc vi sinh có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao ở Việt Nam Cách khắc phục: - Nên chú ý phun sớm từ khi sâu non từ 1-3 ngày tuổi - Nên phun vào lúc chiều mát - Cần... + Dựa trên hai tiêu chí (về lương thực và thực phẩm) thì cây trồng Bt là an toàn cho tiêu thụ + Các protein Cry gần như không có độc tố tới các sinh vật không chủ đích, ngoại trừ các loài côn trùng có quan hệ gần gũi với vật chủ đích, + Protein Cry,các marker và cây trồng Bt không tìm thấy rủi ro tới môi trường II QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU BT 2.1 Tuyển chọn chủng - Chọn chủng tự nhiên... tới các loài sinh vật khác Trong gần 40 năm được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới, chúng GVHD: PHẠM MINH TUẤN Page 15 Báo Cáo Tiểu Luận ta chưa tìm thấy ảnh hưởng xấu của chúng tới sức khỏe con người hay môi trường (EPA, 1998a; Mc Clontock et A; 199 5) Kể từ năm 1961 đến năm 1998 tại Hoa Kỳ hiện có ít nhất 180 sản phẩm vi sinh Bt đã được đăng ký kiểm định Tại châu Âu có hơn 120 sản phẩm Theo cuộc ... chung thuốc trừ sâu .4 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học 1.2.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học 1.2.2 Phân loại thuốc trừ sâu sinh học .6 1.3 Thuốc trừ sâu sinh học. .. lại có thuốc có tính độc cao với ong cá thiên địch sâu hại: Thiodan, … 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học 1.2.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học chế phẩm sinh học sản xuất từ... Phân loại thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học Thành phần giết sâu có thuốc sinh học vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) chất vi sinh vật tiết