BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC PHẠM THỊ NHẬT TRINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC HAI LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI RÁNG (DRYNARIA) HỌ DƯƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC PHẠM THỊ NHẬT TRINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC HAI LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI RÁNG (DRYNARIA) HỌ DƯƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) Chuyên ngành : Hoá học Hợp chất thiên nhiên Mã số : 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS.TSKH Nguyễn Công Hào TS Phan Thanh Thảo THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Phạm Thị Nhật Trinh DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây bổ cốt toái Hình 1.2: Cây tắc kè đá Hình 4.1: Tương quan HMBC nhóm 3- metyl-2- butenyl 62 Hình 4.2: Sự ghép spin proton vòng C 63 Hình 4.3: Tương quan HMBC nhóm 4- metyl-3- pentenyl 65 Hình 4.4: Tương quan HMBC nhóm hexyl, vinyl, nối đôi trans 66 Hình 4.5: Tương quan HMBC vòng A 75 Hình 4.6: Tương quan HMBC vòng benzen với nối đôi vòng DFC II 77 Hình 4.7: Tương quan HMBC vòng thơm nối đôi vòng DFC III 79 Hình 4.8 : Tương quan HMBC khung anthraquinon DFA VI 89 Hình 4.9: Tương quan HMBC DFM V 95 Hình 4.10 : Tương quan HMBC khung anthraquinon DBH I 97 Hình 4.11: Khung DBA IV 111 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các hợp chất phân lập từ chi Drynaria 16 Bảng 1.2: Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR số khung flavonoid 25 Bảng 1.3: Độ dịch chuyển hóa học 13C NMR số khung flavonoid 26 Bảng 3.1: Khối lượng loại cao hiệu suất (so với cao etanol ban đầu) hai đối tượng khảo sát 34 Bảng 3.2: Kết sắc ký cột silica gel cao eter dầu hỏa (50,0 g)-Drynaria fortunei 35 Bảng 3.3: Kết sắc ký cột silica gel cao clorofrom (20,4 g)-Drynaria fortunei 35 Bảng 3.4: Kết sắc ký cột silica gel cao etyl acetat (20,0 g)-Drynaria fortunei 36 Bảng 3.5: Kết sắc ký cột silica gel cao metanol (143,0 g)-Drynaria fortunei 36 Bảng 3.6: Kết sắc ký cột silica gel cao hexan (47,0 g)-Drynaria bonii 36 Bảng 3.7: Kết sắc ký cột silica gel cao cloroform (18,7 g)-Drynaria bonii 37 Bảng 3.8: Kết sắc ký cột silica gel cao etyl acetat (10,2 g)-Drynaria bonii 37 Bảng 3.9: Kết sắc ký cột silica gel cao metanol (110,0 g)-Drynaria bonii 38 Bảng 3.10 Khối lượng hiệu suất hợp chất phân lập 41 Bảng 3.11: Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hoá 56 Bảng 3.12 Kết thử nghiệm cao chiết đến phát triển tế bào MG63 57 Bảng 3.13 Kết thử nghiệm chất tinh khiết đến phát triển tế bào MG63 58 Bảng 3.14: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 60 Bảng 4.1: So sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DFH III với phổ 1H-NMR 13C-NMR bakuchiol 66 Bảng 4.2: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DFH IV với phổ 1HNMR 13C-NMR citrostadienyl acetat 69 Bảng 4.3: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DFH VB với phổ 1HNMR 13C-NMR citrostadienol 71 Bảng 4.4: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DFH VI với phổ 1HNMR 13C-NMR myristin 73 Bảng 4.5: Số liệu phổ NMR DFCII, DFCIII DFCV 81 Bảng 4.6: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DFA III với phổ 1HNMR 13C-NMR cycloeucalenol 85 Bảng 4.7: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DFA V với phổ 1HNMR 13C-NMR cycloartanol 87 Bảng 4.8: So sánh số liệu phổ NMR DFM II với phổ tương ứng liquiritin 91 Bảng 4.9: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR tương quan HMBC DFM V 95 Bảng 4.10: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DBH III với phổ 1HNMR 13C-NMR -tocopherol 99 Bảng 4.11: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DBH IVB với phổ H-NMR 13C-NMR 24-metylencycloartan-3β-ol 101 Bảng 4.12: So sánh số liệu phổ 13C-NMR DBH IVC với phổ 13C-NMR triphyllol 104 Bảng: 4.13: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR tương quan HMBC DBC I 106 Bảng 4.14: Bảng so sánh số liệu phổ 13C-NMR DBM V với phổ 13C-NMR etyl β-D-fructopyranosid 116 Bảng 4.15a: Bảng so sánh số liệu phổ 13C-NMR DBM VI với phổ 13C-NMR 1-O--D-glucopyranosyl-(2S, 3R , 4E, 8Z)-2-[(2-hydroxyoctadecanoyl) amino]-4,8octadecadien-1,3-diol 119 Bảng 4.15b: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR DBM VI với phổ 1H-NMR 1-O--D-glucopyranosyl-(2S, 3R, 4E, 8Z)-2-[(2-hydroxyoctadecanoyl) amino]-4,8octadecadiene-1,3-diol 120 Bảng 4.16: tổng hợp chất phân lập từ bổ cốt toái tắc kè đá 121 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Qui trình điều chế cao phân lập hợp chất từ bổ cốt toái 39 Sơ đồ 3.2: Qui trình điều chế cao phân lập hợp chất từ tắc kè đá 40 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic H-NMR Ara Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy proton Arabinose Đường arabinose Đường allose All CFU Colony Forming Unit Số đơn vị khuẩn lạc DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Gốc tự DPPH EI-MS Elecron impact mass spectrometry Phổ khối lượng bắn phá electron Electron Spray Ionization Mass Phổ khối lượng phun mù điện spectrometry tử EtOH Ethanol Etanol Gal Galactose Đường galactose GC-MS Gas chromatography- mass Sắc ký khí ghép khối phổ ESI-MS spectrometry GlcUA glucuronide Acid glucuronic Glu Glucose Đường glucose HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua Coherence liên kết MeOH Methanol Metanol MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu ODS Octadecylsilyl silica gel Silica gel C-18 HSQC P-HPLC Preparative high performance liquid Sắc ký lỏng cao áp điều chế chromatography Rha Rhamnose Đường rhamnose Rp 18 Reversed phase C-18 Silica gel pha đảo C-18 SC Scavenging capacity Khả bắt gốc tự SKC Sắc ký cột Stt Số thứ tự TLC Thin layer chromatography Sắc ký mỏng CTPT Công thức phân tử TLTK Tài liệu tham khảo s Singlet Mũi đơn m Multiplet Mũi đa t Triplet Mũi ba d Doublet Mũi đôi dd Doublet of doublet Mũi đôi đôi ddd Doublet of doublet of doublet Mũi đôi đôi đôi brs Broad singlet Mũi đơn rộng MG-63 MG-63 cell Tế bào tạo xương MG-63 DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium Môi trường DMEM DMSO Dimethyl sulfoxide Dung môi DMSO MỞ ĐẦU Việc sử dụng thuốc dân gian có truyền thống lâu đời giới Khi quan sát giới tự nhiên loài người nhận thấy, thảm thực vật có ích cho họ, ốm đau họ biết sử dụng loài thực vật để chữa bệnh, biết tránh loài có tác dụng độc Ban đầu kinh nghiệm vận dụng qui luật giá trị tài nguyên để chữa bệnh Dần dần hình thành y học mà ngày nhà khoa học gọi y học cổ truyền dân tộc, tri thức thảm tài nguyên dược liệu gọi thực vật học dân tộc, hiểu biết tác dụng cỏ gọi dược lý học dân tộc [5,7] Khoa học ngày phát triển, người sâu khám phá giới tự nhiên Các nhà khoa học nhận thấy “sinh vật nhà hóa học tuyệt vời” giỏi nhà hóa học việc tổng hợp chất tự nhiên Qua hàng triệu năm, sinh vật tự tổng hợp chất để đáp ứng nhu cầu đặc biệt cho tồn hidrudin đĩa để chống đông máu Sau loài người sử dụng hợp chất để điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu Tương tự vậy, loài người thành công việc tìm kiếm thuốc vinblastin, vincristin từ dừa cạn, colchicin, conchamin từ loài tỏi, dẫn chất taxol từ thông đỏ Các chất chống oxy hóa màng tế bào -caroten có cà rốt, gấc Quinin artermisinin gần có ích cho loài người Trong năm cuối kỷ 20 đầu kỷ 21, bệnh cúm gia cầm trở thành vấn đề toàn cầu, lần chất có nguồn gốc thiên nhiên lại giúp cho loài người chống lại virus H5N1 Acid shikimic chiết xuất từ hoa hồi, sau bán tổng hợp thành oseltamivir phosphat có khả phòng chống lại bệnh [11,12] Việt Nam có nguồn tài nguyên động thực vật vô phong phú đa dạng Theo Phạm Hoàng Hộ Nguyễn Nghĩa Thìn, thực vật bậc cao có mạch thống kê 10.500 loài, dự đoán khoảng 12.000 loài [3,7] Số loài thuốc thống kê Việt Nam 3948 loài thuộc 307 họ thực vật, chiếm 37,6% số loài tự nhiên Dân tộc Việt Nam có truyền thống từ lâu sử dụng cỏ công tác phòng chữa bệnh Trong trình lịch sử khai thác sử dụng thuốc, nhân dân tích lũy nhiều kinh nghiệm sử dụng độc đáo, nhiều thuốc có hiệu điều trị cao Tuy nhiên nhiều kinh nghiệm, thuốc quý dân tộc thiểu số ứng dụng phạm vi hẹp cộng đồng đứng trước nguy bị lãng quên Những năm gần đây, nhu cầu phát triển kinh tế xã hội, môi trường tự nhiên nhiều khu vực bị hủy hoại nghiêm trọng làm thu hẹp vùng phân bố khả phát triển không loài thuốc Bên cạnh nhiều loài thuốc bị khai thác thường xuyên với khối lượng lớn để thỏa mãn thu nhập kinh tế người dân yêu cầu thị trường nước [11] Vì vậy, thông qua việc khảo sát đặc điểm hóa thực vật, dược tính … thuốc, bước lý giải thích việc trị bệnh thảo dược, đồng thời tiêu chuẩn hoá thuốc cổ truyền nhằm sử dụng cách hợp lý, có hiệu đồng thời góp phần bảo tồn thuốc dân tộc Chính việc nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày ý[15] Tại Việt Nam thuốc thuộc chi ráng, Drynaria thường dân gian sử dụng chữa trị bệnh phong thấp, nhức mỏi, đau gân xương, bong gân, gãy xương[6] … Tuy nhiên nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học loài nước giới không nhiều Với mục tiêu tìm hiểu thành phần hoá học thử nghiệm số hoạt tính sinh học, qua góp phần giải thích làm sáng tỏ chế trị bệnh thuốc cổ truyền, tiến hành khảo sát thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học chất phân lập từ số loài thuộc chi Drynaria Việt Nam Nội dung luận án: Phân lập hợp chất tinh khiết từ thân rễ bổ cốt toái tắc kè đá Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, chống oxy hóa hoạt tính kích thích thích tế bào tạo xương MG63 hợp chất phân lập CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chi Drynaria Chi Drynaria có từ 15 đến 19 loài, sống phân bố Châu Phi, Châu Á đến Tây Bắc Châu Úc, có phổ biến nhiều Trung Quốc, T Janssen H Schneider phân loại thành loài tiêu biểu sau [47] + Drynaria bonii + Drynaria laurentii + Drynaria descensa + Drynaria parishii + Drynaria involuta + Drynaria propinqua + Drynaria spasisora + Drynaria pleuridioides + Drynaria quercifolia + Drynaria rigidula + Drynaria delavayi + Drynaria volkensii + Dryaria mollis + Drynaria willdenowii + Drynaria sinica A + Drynaria fortunei + Drynaria sinica B 1.2 Mô tả thực vật Đối tượng nghiên cứu đề tài hai loài chưa khảo sát thành phần hóa học có công trình nghiên cứu thuộc chi Dyrania gồm: Drynaria fortunei (Kunze) J Sm Drynaria bonii H Christ 1.2.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm [13] Bộ: dương xỉ (Polypodiales) Họ: dương xỉ (Polypodiaceae) Tên khoa học: Drynaria fortunei (Kunze) J Sm Tên thông thường: cốt toái bổ, hộc quyết, thu mùn, co tạng tó (Thái Châu Quỳnh Nhai), co ín tó (Thái Điện Biên), Sáng viằng (Dao), đờ rờ (K’ho) Tên gọi khác: hầu khương, hồ tôn khương, thân khương, tổ rồng, tổ diều [11] Cây bổ cốt toái sống riêng hốc đá, mọc đám rêu, sống thân lớn đa, si Cây sống lâu năm có thân rễ dày mẫm, phủ nhiều vảy màu vàng, bóng Có hai loại lá: bất thụ không cuống, màu Phụ lục 166: Phổ ESI-MS DBM III linocaffein Phụ lục 167: Phổ H NMR DBM IV linocaffein Phụ lục 168: Phổ 13 C NMR DBM IV Phụ lục 169: Phổ DEPT DBM IV Phụ lục 170: Phổ HMBC DBM IV Phụ lục : Phổ HMBC DBM IV linocaffein Phụ lục 171: Phổ HSQC DBM IV Phụ lục 172: Phổ ESI-MS DBM IV ethyl β-D-fructopyranoside Phụ lục 173: Phổ H NMR DBM V ethyl β-D-fructopyranoside Phụ lục 174: Phổ 13C NMR DBM V Phụ lục 175: Phổ DEPT DBM V Phụ lục 176: Phổ HMBC DBM V Phụ lục : Phổ HMBC DBM V ethyl β-D-fructopyranoside Phụ lục 177: Phổ HSQC DBM V Phụ lục 178: Phổ ESI-MS DBM V Phụ lục 179: Phổ H NMR DBM VI Phụ lục 180: Phổ 13 C NMR DBM VI Phụ lục 181: Phổ DEPT DBM VI Phụ lục 182: Phổ HMBC DBM VI Phụ lục 183: Phổ HSQC DBM VI Phụ lục 184: Phổ APCI-MS DBM VI Phụ lục 185: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Phụ lục 185: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Phụ lục 186: Hoạt tính kháng oxi hóa Phụ lục 186: Hoạt tính kháng oxi hóa [...]... sao vàng Có thể cho vào nước đường nấu chín và phơi khô dùng dần 1.4 Thành phần hóa học Cho đến hiện nay chỉ có vài công trình nghiên cứu về thành phần hóa học loài Drynaria fortunei (Kunze) J Sm., riêng Drynaria bonii H Christ thì hoàn toàn chưa có một nghiên cứu nào Cả hai loài Drynaria này đều chưa được nghiên cứu ở Việt Nam Trong phần này chúng tôi trình bày thành phần hóa học của một vài loài thuộc. .. cương về hoạt tính chống oxi hóa, loãng xương và kháng vi sinh vật 1.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa[ 4,7,18] Oxi hóa là quá trình không thể thiếu đối với sinh vật hiếu khí Các nghiên cứu khoa học chứng tỏ rằng oxi vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa học Đồng thời với các quá trình đó, oxi tạo ra các chất trung gian là các gốc tự do, có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là dạng oxi hoạt. .. Năm 2001, Liu H C và cộng sự khi nghiên cứu độc tính tế bào và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chi t nước của cây bổ cốt toái nhận thấy ở nồng độ 10 µg/ml, dịch chi t không có độc tính tế bào nhưng có hoạt tính chống oxi hóa [62] 1.5.2 Drynaria quercifolia N Ramesh và cộng sự (2001) đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chi t MeOH và nhận thấy rằng dịch chi t này có khả năng ức chế 10... phần hóa học của một vài loài thuộc chi Drynaria đã được các tác giả ngoài nước nghiên cứu, vì giữa các loài cùng chi, cùng họ sẽ có những đặc điểm chung về hóa- thực vật 1.4.1 Drynaria propinqua Năm 1992, Liu Sonqing và cộng sự tại đại học dược Trung Quốc lần đầu tiên đã phân lập được một hợp chất flavanol glucosid mới là (-)-epiafzelechin 3-O-β-Dallopyranosid (1) và các hợp chất acid 4-O-β-D-allopyranosyl... (12); (-)-epiafzelechin (11) và β-sitosterol (7) [85] Năm 2006, Li F và cộng sự nhận thấy dịch chi t etanol, etyl axetat và butanol của thân rễ Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm có hoạt tính tạo xương Từ phân đoạn cao chi t butanol dựa theo thử nghiệm hoạt tính 2 hợp chất có tính tạo xương đã được phân lập là naringin (8) và neoeriocitrin (18) [59] Năm 2008, Xin Luan Wang và các cộng sự đã phân lập được... bền vững và được gọi chung là dạng oxi hoạt động Sự sản sinh ra nhiều dạng oxi hoạt động được loại bỏ bằng các chất chống oxi hóa tự nhiên Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxi họat động và các dạng chống oxi hóa Stress oxi hóa là hiện tượng mất cân bằng giữa việc sinh ra gốc tự do và hoạt tính bắt gốc tự do trong cơ thể sinh vật do ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài hay bên 22 trong... nguyên tắc hoạt động, chất chống oxi hóa được chia làm hai loại: chất chống oxi hóa bậc 1 (có tác dụng bao vây hoặc trung hòa các gốc tự do) và chất chống oxi hóa bậc 2 (ức chế hình thành gốc tự do) Ngoài ra, stress oxi hóa được xem là nguyên nhân dẫn đến nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác như tim mạch, alzheimer, lão hóa sớm, suy yếu hệ thống miễn dịch… Do vậy, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất... hệ chặt chẽ đến sự hư hại mô bị viêm và mô bị oxi hóa Bằng thực nghiệm đã chứng minh được các gốc tự do có liên quan đến sự xúc tiến khối u trong da chuột và các mô khác Khi các chất hoạt hóa khối u được áp dụng cục bộ vào da chuột đã sinh ra H2O2 trong biểu bì, điều này tương quan với khả năng xúc tiến khối u của các chất này Do đó các chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh có khả năng ngăn chặn sự gây... khương hoạt, độc hoạt, thiên hoa phấn, thổ phục linh, mỗi vị 12 g, cam thảo 4 g Sắc uống mỗi ngày một thang 20 + Bài thuốc chữa bong gân, tụ máu: bổ cốt toái tươi, bóc bỏ hết lông tơ và lá khô, rửa sạch, giã nhỏ, rấp nước, gói vào lá chuối nướng cho mềm, đắp vào chỗ đau, bó lại Thay thuốc bó nhiều lần trong ngày Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Trần Giáng Hương - Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu thử nghiệm. .. chất chống oxi hóa ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực Y-dược nhằm phát hiện những chất chống oxi hóa mang lại những tác dụng tốt có lợi cho sức khỏe con người, trong đó chất chống oxi hóa có nguồn gốc thiên nhiên được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính ít độc, dễ hấp phụ đối với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ 1.6.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật[ 2,5] Kháng sinh là những ... carboxymetyl-(-)-epiafzelechin sodium salt (15); naringin (8); (-)-epiafzelechin (48)4-carboxymetylepiafzelechin metyl ester (16) v (-)-epiafzelechin (48, 2O7)-epiafzelechin-(48)-epiafzelechin (17) Trong... mt hay hai loi thuc khỏng sinh m cũn khỏng li nhiu thuc khỏng sinh tỡnh hỡnh lm dng khỏng sinh hin Cn phi cú cỏc khỏng sinh mi cú tỏc dng hiu qu lờn cỏc vi khun khỏng thuc, s ú khỏng sinh t ngun... (-)-epiafzelechin 12 13 (-)-epiafzelechin 3-O--D-allopyranosid (-)- epiafzelechin 3-O-(6-O-acetyl)- -D-allopyranosid 14 15 4-carboxymetyl (-)-epiafzelechin 4-carboxymetyl (-)-epiafzelechin metyl