BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ PHAN NGỌC TIẾN NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ PHAN NGỌC TIẾN NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh lý học Mã số: 62 72 04 05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS PHẠM ĐÌNH LỰU TP Hồ Chí Minh – Năm 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác PHAN NGỌC TIẾN MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời camđđoan Trang Mục lục Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Kháng thể 1.2 Kháng thể đơn dòng 15 1.3 Đại cương Alpha-fetoprotein 28 Chương 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein người 40 2.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ chuột Lou 53 2.3 Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng AFP người tạo đònh lượng nồng độ AFP huyết .57 Chương 3: KẾT QUẢ 65 3.1 Kết tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng Alphafetoprotein 65 3.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ chuột Lou 79 3.3 Kết ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng AFP người tạo đònh lượng nồng độ AFP huyết 85 Chương 4: BÀN LUẬN 101 KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC 135 PHỤ LỤC 138 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ab: Antibody Ag: Antigen AFP: Alpha-fetoprotein AFP-L: hệ thống đònh lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU FTi3-1-A8: lần thực kỹ thuật hoà hợp tế bào lần thứ 3, đóa nuôi cấy thứ 3, vò trí giếng A8 FTi3-3-B4-H6: lần thực kỹ thuật hoà hợp tế bào lần thứ 3, đóa nuôi cấy thứ 3, vò trí giếng A8, vò trí giếng H6 có tế bào sau pha loãng giới hạn Ig: Immunoglobulin KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể MARG1: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma1 chuột cống MARG2a: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2a chuột cống MARG2b: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2b chuột cống MARG2c: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2c chuột cống MARL: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ lamda chuột cống MARK: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ kappa chuột cống DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các đặc tính lớp kháng thể 13 Bảng 1.2: Các đặc tính lớp kháng thể chuột cống LOU 16 Bảng 1.3: Các dòng tế bào ung thư để tạo tế bào lai 21 Bảng 1.4: Các giá trò nồng độ AFP huyết xác đònh kỹ thuật MEIA đối tượng bệnh lý người bình thường 37 Bảng 1.5: Tương quan mức tăng AFP máu mẹ với nguy thai bò dò tật .38 Bảng 2.6: Sơ đồ nồng độ AFP chuẩn từ 0-500ng/ml .55 Bảng 2.7: Sơ đồ nồng độ thấp từ 0-5ng/ml AFP chuẩn .56 Bảng 2.8: Sơ đồ thứ tự mẫu huyết đònh lượng AFP AFP-L 60 Bảng 2.9: Sơ đồ thứ tự mẫu huyết đònh lượng AFP hệ thống đònh lượng AFP hãng MaximBiotech 62 Bảng 3.10: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy 67 Bảng 3.11: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy .68 Bảng 3.12: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy .69 Bảng 3.13: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy 70 Bảng 3.14: Kết đònh isotype kháng thể giếng có tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng AFP, sử dụng kháng nguyên AFP Viện Pasteur Tp.HCM 72 Bảng 3.15: Kết đơn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng AFP 73 Bảng 3.16: Kết phản ứng kháng thể đơn dòng với AFP hãng Calbiochem 79 Bảng 3.17: Kết mật độ quang (DO) tương ứng với nồng độ AFP AFP-L .80 Bảng 3.18: Kết mật độ quang (DO) tương ứng với giá trò thấp nồng độ AFP, AFP-L 83 Bảng 3.19: Kết nồng độ AFP mẫu huyết đònh lượng hệ thống đònh lượng AFP-L 85 Bảng 3.20: Giá trò trung bình nồng độ AFP mẫu huyết hệ thống đònh lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột Lou 86 Bảng 3.21: Kết DO tương ứng với nồng độ AFP chuẩn hãng Maxim Biotech 87 Bảng 3.22: Kết nồng độ AFP mẫu huyết đònh lượng hệ thống đònh lượng AFP cuả hãng Maxim Biotech 88 Bảng 3.23: Giá trò trung bình nồng độ nồng độ AFP mẫu huyết đònh lượng hệ thống đònh lượng AFP cuả hãng Maxim Biotech 89 Bảng 3.24: Kết nồng độ AFP mẫu huyết đònh lượng hệ thống đònh lượng AFP hãng Abbott 90 Bảng 3.25: Giá trò trung bình nồng độ AFP mẫu huyết đònh lượng hệ thống đònh lượng AFP hãng Abbott 91 Bảng 3.26 a: Bảng kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết hai hệ thống đònh lượng AFP-L Maxim Biotech 92 Bảng 3.26 b: Bảng so sánh kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết hai hệ thống đònh lượng AFP-L Maxim Biotech 93 Bảng 3.27: Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết u gan hai hệ thống đònh lượng AFP-L Maxim Biotech 94 Bảng 3.28: Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết hai hệ thống đònh lượng AFP-L Abbott .95 Bảng 3.29 a: Bảng kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết u gan hai hệ thống đònh lượng AFP-L Abbott .97 Bảng 3.29 b: Bảng so sánh kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết u gan hai hệ thống đònh lượng AFP-L Abbott 97 Bảng 4.30: Các dòng tế bào ung thư để tạo tế bào lai 101 Bảng 4.31: Chuột LOU/C allotype chuỗi nhẹ kappa 106 Bảng 4.32: So sánh với hệ thống đònh lượng AFP 111 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Sự di chuyển lớp kháng thể điện di protein Hình 1.2: Cấu trúc lónh vực chuỗi nặng chuỗi nhẹ Hình 1.3: Cấu trúc phân tử kháng thể Hình 1.4: Cấu trúc phân tử AFP người 29 Hình 1.5: Cấu trúc phân tử AFP Albumin người .29 Hình 3.6: Tạo khối u tế bào lai ổ bụng chuột 74 Hình 3.7: Tạo dòch báng ổ bụng chuột .74 Hình 3.8: Điện di protein dòch báng ổ bụng chuột lần 75 Hình 3.9: Điện di protein dòch báng ổ bụng chuột lần 75 Hình 3.10: Điện di protein dòch báng ổ bụng chuột lần 76 Hình 3.11: Máy sắc ký 77 Hình 3.12: Kháng thể đơn dòng kháng AFP bảo quản 78 Biểu đồ 3.1: Đường biểu diễn kết sắc ký 77 Biểu đồ 3.2: Giá trò trung bình nồng độ AFP hai hệ thống đònh lượng AFP-L Maxim Biotech nhóm người bình thường 98 Biểu đồ 3.3: Giá trò trung bình nồng độ AFP hai hệ thống đònh lượng AFP-L Maxim Biotech nhóm người có HBsAg (+) 99 Biểu đồ 3.4: Giá trò trung bình nồng độ AFP ba hệ thống đònh lượng AFP-L, Maxim Biotech Abbott ởû nhóm người viêm gan siêu vi B cấp 100 Biểu đồ 4.5: Kết sắc ký lực dùng kháng thể đơn dòng kháng kháng thể đơn dòng chuột cống 108 Sơ đồ1.1: Sản xuất kháng thể đơn dòng .15 Đồ thò 3.1: Đồ thò nồng độ AFP chuẩn DO tương ứng AFP-L 81 Đồ thò 3.2: Đường cong chuẩn hệ thống đònh lượng AFP-L .82 Đồ thò 3.3: Đường biểu diễn DO tương ứng với giá trò thấp nồng độ AFP AFP-L 84 Đồ thò 3.4: Đường cong chuẩn hệ thống đònh lượng AFP hãng Maxim Biotech 87 Đồ thò 4.5: Đường cong chuẩn hệ thống đònh lượng AFP-L .110 124 26 Nguyễn Lê Trang, Vũ Quang Huy, Dương thị Lưu, Nguyễn thò Diễm Hồng (1992), “Tinh chế alpha protein thai (alpha-fetoprotein)”, Công trình nghiên cứu Y Học Quân Sự, Học Viện Quân Y, (2), tr 59-64 27 Nguyễn Lê Trang, Lạc Ngọc Thêm, Nguyễn Thò Nguyệt Thu, Bạch Khánh Hoà, Nguyễn thò Thuỳ, Đỗ Kỳ Dung, Nguyễn thò Lảng, Nguyễn trọng Hiếu (1998), “Chế tạo sinh phẩm để đònh lượng alpha-fetoprotein”, Kỷ Yếu Hộ Nghò Khoa học Y Dược, Hội Y Dược Học Tp Hồ Chí Minh, tr 409-412 28 Nguyễn Lê Trang, Nguyễn thò Thuỳ (2000), “Báo cáo nghiệm thu đề tài: Sản xuất sinh phẩm đònh lượng AFP, ứng dụng sàng lọc dò tật thai”, Sở Khoa Học Công Nghệ Môi trường Tp Hồ Chí Minh 29 Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học tập 1, nhà xuất tự điển bách khoa, Hà Nội, tr.303-306 TIẾNG ANH: 30 Abbas A K., Lichtman A H., Poder J S (1994), “Antibody and antigens”, Cellular and Molecular Immunology, W.B Sauders Company, A division of Harcourt Brace Company, USA 31 Abbott laborarory diagnostic division (1992), In tumor marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8 32 Abelev G.I (1963), “AFP in ontogenesis and its association with malignant tumors”, Adv Cancer Res, No14, pp 295-358 33 Aitken D.A., Wallace E.M., Crossley J.A., (1996), “Dimeric inhibin-A as a marker for Down’s syndrome in early pregnancy”, New England of Journal Medicine, pp 1231-1236 125 34 Aitken D.A., McCaw G., Crossley J.A (1993), “First-trimester biochemical screening for fetal chromosome abnormalities and neural tube defects”, Prenatal Diagnosis, (13), pp 681–689 35 Annual report of International Agency for Research on Cancer (1969), Lyon 36 Alpert E., Hershberg R., Schur P.H (1971), Alpha-fetoprotein in human hepatoma, Improved detection in serum and quatitative studies using a new sensitive techniques, USA 37 Audibert F., Dommergues M., Benattar C., Taieb J., Thalabard J.C., Frydman R (2001), “Screening for Down’s syndrome using firsttrimester ultrasound and second-trimester maternal serum markers in a low-risk population: a prospective longitudinal study”, Ultrasound Obstetric Gynecology, pp 26–31 38 Ball O., Rose E., Alpert E (1990), “Biological variation of Alphafetoprotein levels in normal adults”, Gastrenterology, 98, pp 273 39 Bazin H (1990), Rat hybridomas and rat monoclonal antobodies, CRC press, pp 6-191 40 Benn P.A., Clive J.M., Collins R (1997), “Medians for second-trimester maternal serum alpha-fetoprotein, human chorionic gonadotropin, and unconjugated estriol; differences between races or ethnic groups”, Clinical Chemistry, pp 333–337 41 Bogart M., Pandian M.R., Jones O.W (1987), “Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in pregnancies with fetal chromosome abnormalities”, Prenatal Diagnosis, pp 623-630 42 Canick J., Knight G.J., Palomaki G.E., (1998), “Low second trimester maternal serum unconjugated estriol in pregnancies with Down’s syndrome”, British Journal of Obstetric Gynaecology, pp 330-333 43 Chao A S., Chung C L., Wu C D., Chang S D., Cheng P J C., Lin Y T., Soong Y K (1999), “Second trimestermaternal serum screening using alpha fetoprotein, free beta human chorionic gonadotropin and maternal 126 age specific risk: Result of chromosomal abnormalities detected in screen positive for Down syndrome in an Asian population”, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica’, pp 393-397 44 Christiansen M., Oxvig C., Wagner J.M (1999), “The proform of eosinophil major basic protein: a new maternal serum marker for Down syndrome”, Prenatal Diagnosis, pp 905–910 45 Cuckle H.S., Holding S., Jones R (1996), “Combining inhibin A with existing second trimester markers in maternal serum screening for Down’s syndrome”, Prenatal Diagnosis, pp 1095-1100 46 Cuckle H (1995), “Improved parameters for risk estimation in Down’s syndrome screening”, Prenatal Diagnosis, pp 1057–1065 47 Gillepsie J R., Uversky V N (2000), “Structure and function of αfetoprotein: a biophysical overview”, Biochimica et Biophysica Acta, Elsevier, 1480, 41-56 48 Harrison T.R (1993), Principles of internal medicine, 12th Edition, Vol 2, pp.1381-1383 49 Herman A., Weinraub Z., Dreazen E (2000), “Combined firsttrimester nuchal translucency and second-trimester biochemical screening tests among normal pregnancies”, Prenatal Diagnosis, pp 781–784 50 Hook E.A., Mutton D.E., Ide R., Alberman E., Bobron M (1995), “The natural history of Down’s syndrome conceptuses diagnosed prenatally that are not electively terminated”, American Journal of Human Genetics, pp 875–881 51 Hsieh T.T., Hsu J.J., Chen C.P (1995), “Down’s syndrome screening with AFP and free b hCG: an analysis of the influence of Chinese ethnic origin on screening parameter”, American Journal of Human Genetics, p 1632 52 Hsu J.J., Hsieh T.T., Hsieh F.J (1996), “Down syndrome screening in an Asian population using alpha-fetoprotein and free bhCG: a report of the 127 Taiwan Down Syndrome Screening Group”, Obstetric Gynecology, pp 943–947 53 Hsu J.J., Hsieh T.T., Soong Y.K., Spencer K (1997), “Comparison of Down’s syndrome screening strategies in Asians combining serum free beta-hCG and alpha-fetoprotein with maternal age”, Prenatal Diagnosis, pp.707–716 54 Johnson A.M., Palomaki G.E., Haddow J.E (1990), “Maternal serum afetoprotein levels in pregnancies among black and white women with fetal open spina bifida: a United States collaborative study”, American Journal of Obstetric Gynecololy, pp 328–331 55 Kemeny D.M (1991), A practiceal guide to Elisa, Department of Allergy Guy’s Hospital, London 56 Ko T.M., Tseng L.H., Hwa H.L (1996), “Cytogenetic analysis of amniotic fluid cells in 10,000 samples” Journal of Obstetrics and Gynecology Republic of China, pp 153–158 57 Kohler G (1984), “Derivation and diversification of monoclonal antibodies”, Nobel lecture, pp 228 -231 58 Kuppermann M., Feeny D., Gates E., Posner S.F., Blumberg B., Washington A.E (1999), “Preferences for women facing a prenatal diagnostic choice: long-term outcomes matter most”, Prenatal Diagnosis, pp 711– 716 59 Lambert-Messerlian G.M., Canick J.A., Palomaki G.E (1996), “Second trimester levels of maternal serum inhibin-A, total inhibin, inhibin precursor and activin in Down’s syndrome pregnancies”, Journal of Medicine Screen, pp.58- 62 60 Masseyeff R.F., Albert W H., Staines N.A (1993), Method of Immunological Analysis, Volume Sample and Agent, VCH 61 Maxim Biotech (2004), “Alpha-fetoprotein Enzyme Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA, USA 128 62 Merkatz I.R., Nitowsky H.M., Macri J.N (1984), “An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosome abnormalities”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 886894 63 Michailidis G.D., Spencer K., Economides D.L (2001), “The use of nuchal translucency measurement and second trimester biochemical markers in screening for Down’s syndrome”, British Journal of Obstetric Gynaecology, pp 1047–1052 64 Mizejewski G.J (2001), “Alpha-fetoprotein Structure and Function: Relevance to Isoforms, Epitopes, and Conformational Variants”, Experimental Biology and Medicine, pp 307-408 65 Norgaard-Pedersen B., Alfthan H., Arends J (1994), “A new simple and rapid dual assay for AFP and free beta hCG in screening for Down’s syndrome”, Clinical Genetics, pp 1–4 66 Ochshorn Y., Kupferminc M.J., Wolman I., Orr-Urtreger A., Jaffa A.J., Yaron Y (2001), “First trimester PAPP-A in the detection of nonDown’s syndrome aneuploidy”, Prenatal Diagnosis, pp 547–549 67 O’Brien J.E., Dvorin E., Drugna A., Johnson M.P., Yaron Y., Evans M.I (1997), ”Race-ethnicity specific variation inmultiplemarker biochemical screening: alpha-fetoprotein, hCG and estriol” Obstetric Gynecololy, pp 355–358 68 Onda T., Kitagawa M., Takeda O (1996), “Triple marker screening in native Japanese women” Prenatal Diagnosis, pp 713–717 69 Organon Teknika (1991), “Microelisa principles, Miroelisa trouble shooting manual, Germany 70 Palomaki G.E., Knight G.J., McCarthy J.E (1997), “Maternal serum screening for Down syndrome in the United States: a 1995 survey”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 1046-1051 129 71 Palomaki G.E., Haddow J.E., Knight G.J (1995), “Risk-based prenatal screening for trisomy 18 using alpha-fetoprotein, unconjugated oestriol and human chorionic gonadotropin”, Prenatal Diagnosis, pp 713–723 72 Pettersson K., Alfthan H., Stenman U.H (1993), “Simultaneous dual-label assay of alpha-fetoprotein and free beta subunit of human chorionic gonadotropin by time resolved detection of fluorescent europium and samarium chelates”, Clinical Chemistry, (39) pp 2084–2089 73 Qin Q.P., Christiansen M , Nguyen T.H., Sørensen S., Larsen S.O., Nørgaard-Pedersen B (1997), “Schwangerschaftsp protein (SP1) as maternal serum marker for Down’s syndrome in first and second trimester”, Prenatal Diagnosis, pp 101–108 74 Roger N Taylor, Vincent A Przybyszewski, Edith Gary (1983), “Proficiency Testing Survey for Serum Alpha-Fetoprotein”, Journal of clinical microbiology, vol 17 (1), pp 100-105 75 Salonen R., Turpeinen U., Kurki L (1997), ”Maternal serum screening for Down’s syndrome on a population basis”, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, pp 817–821 76 Schuchter K., Hafner E., Stangl G., Ogris E., Philipp K (2001), “Sequential screening for trisomy 21 by nuchal translucency measurement in the first trimester and maternal serum biochemistry in the second trimester in a low-risk population”, Ultrasound Obstetric Gynecology, pp 23–25 77 Sell S (1985), Alpha-fetoprotein in cancer marker Sell S (ed): Diagnotic and developmental significance, Clifton, New Jersey, pp.249-293 78 Snijders R.J.M., Noble P., Sebire N., Souka A., Nicolaides K.H (1998), “UK multicentre project on assessment of risk of trisomy 21 by maternal age and fetal nuchal-translucency thickness at 10–14 weeks of gestation”, Lancet, pp 343–346 130 79 Sokal R.R., Rohlf F.J (1995), Biometry: the principles and practice of statistics in biological research 3rd edition, W H Freeman, New York , p 887 80 Spencer K., Spencer C.E., Power M., Moakes A., Nicolaides K.H (2000), “One stop clinic for assessment of risk for fetal anomalies: a report of the first year of prospective screening for chromosomal anomaliesin the first trimester”, Journal of Obstetric Gynaecology, pp 1271–1275 81 Spencer K., Carpenter P (1993), “Prospective study of prenatal screening for Down’s syndrome with free beta human chorionic gonadotrophin”, BMJ, pp 764-769 82 Spong C.Y., Ghidini A., Sherer D.M., Pezzullo J.P., Eglinton G.S (1997), “Angiogenin: a marker for preterm delivery in midtrimester amniotic fluid”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 415-418 83 Szklo M., Nieto J F (2000), “Reliability studies”, Epidemiology Beyond the Basics, An aspen publication Asoen Publisher, Gaidersburg, Maryland, pp.358-398 84 Taketa K (1990), “Alpha-fetoprotein revaluation in hepatology”, Hepatology, pp.1420-1432 85 Tararrinov Y.S (1964), Detection of embryo specific -globulin in blood serum of a patient with primary liver cancer, Voprosy Meditsinskoi Khim, Moskva, pp.10-90 86 Tijssen P (1985), Practice and Theory of enzyme immunoassa, University of Leiden, Elsevier, Amsterdam 87 Tul N., Spencer K., Noble P., Chan C., Nicolaides K.H (1999),”Screening for trisomy 18 by fetal nuchal translucency and maternal serum free beta-hCG and PAPP-A at 10–14 weeks of gestation”, Prenatal Diagnosis, pp 1035–1042 131 88 Van Lith J.M.M., Pratt J.J., Beehuis J.R (1992), “Second trimester maternal serum immunoreactive inhibin as a marker for fetal Down’s syndrome”, Prenatal Diagnosis, pp.801-806 89 Wald N.J., Rodeck C., Hackshaw A.K., (2003), “First and second trimester antenatal screening for Down’s syndrome: the results of the Serum, Urine and Ultrasound Screening Study (SURUSS)”, Journal of Medicine Screen, pp 56-104 90 Wald N.J., Cuckle H.S., Densem J.W (1988), “Maternal serum unconjugated oestriol as an antenatal screening test for Down’s syndrome”, British Journal of Obstetric Gynaecology, pp 334-341 91 Wald N.J., Cuckle H.S., Densem J.W., (1988), “Maternal serum screening for Down’s syndrome in early pregnancy”, British Medicine Journal, pp 883-887 92 Wald N.J., Cuckle H., Brock J.H (1977), “Maternal serum-alpha-fetoprotein measurement in antenatal screening for anencephaly and spina bifida in early pregnancy”, Lancet, pp 1323–1332 93 Wald N.J., George L., Smith D., Densem J.W., Pettersson K (1996), “Serum screening for Down’s syndrome between and 14 weeks of pregnancy”, British Journal of Obstetric Gynaecology, p 407 94 Waller D.K., Lustig L.S., Cunningham G.C., Golbus M.S., Hook E.B (1991), “Second trimester maternal serum alpha-fetoprotein levels and the risk of subsequent fetal death”, New England of Journal Medicine, pp 6-10 95 Weizel H.K (1979), Alpha-fetoprotein in Clinical Medicine in International workshop Hannover, Georg Thieme Publishers Stuttgant, pp 106-110 96 Wenstrom KD, Owen J, Davis RO, Brumfield C.G (1996), “Prognostic significance of unexplained elevated amniotic fluid alpha fetoprotein”, Obstetric Gynecology, pp 213-216 132 97 Williams M.A., Hickok D.E., Zingheim R.W., Luthy D.A., Kimelman J., Nyberg D.A (1992), “Elevated maternal serum alpha-fetoprotein levels and midtrimester placental abnormalities in relation to subsequent adverse pregnancy outcomes”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 1032-1037 98 Zola H (1988), Monoclonal antibodies: A manual of techniques, CRC Press, pp 23-70 133 PHỤ LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHO HUYẾT THANH ST T Họ tên Tuổi Giới tính VÕ NGỌC T 51 NAM NGUYỄN VĂN L 44 NAM VƯƠNG KIM L 40 NỮ NGUYỄN THỊ KIM L 45 NỮ NGUYỄN HOÀNG S 58 NAM NGUYỄN VĂN N 66 NAM TRẦN THỊ T 54 NỮ LÊ C 41 NAM PHAN VĂN T 53 NAM NGUYỄN THỊ 10 HOÀNG E 42 NỮ 11 NGUYỄN VĂN T 54 NAM 12 ĐINH VIỆT H 50 NAM 13 NGUYỄN THANH H 57 NAM 14 HUỲNH VĂN N 57 NAM 15 LÊ VĂN T 49 NAM 16 PHAN THỊ T 50 NỮ 17 NGUYỄN VĂN L 48 NAM 18 NGUYỄN VĂN T 47 NAM 19 KON V 50 NAM 20 NGUYỄN VĂN C 50 NAM 21 NGUYỄN T 61 NAM 22 PHAN X 71 NAM 23 NGUYỄN VĂN G 42 NAM 24 MAI NGỌC D 65 NAM 25 TRẦN VĂN S 48 NAM 26 NGUYỄN THỊ THU H 20 NỮ 27 HUỲNH VĂN K 38 NAM 28 HỒ XUÂN L 69 NAM 29 CAO THỊ MINH T 30 NỮ 30 NGUYỄN ĐINH C 30 NAM 31 NGUYỄN MINH L 58 NAM 32 HUỲNH THỊ L 39 NỮ 33 HỒ VĂN T 63 NAM 134 34 LÊ HỮU D 35 TRẦN THỊ XUÂN L 36 ĐINH CHÂU T 37 VƯƠNG KHẮC L 38 NGUYỄN THỊ B 39 LE THỊ N 40 PHAN THỊ C 41 PHAN THANH T 42 NGUYỄN THỊ B 43 TRƯƠNG DUY T 44 TỐNG THÀNH Đ 45 HỒ S 46 VÕ VĂN N 47 TRƯƠNG THỊ C 48 TRẦN THỊ G 49 PHAN BÁ T 50 NGUYỄN VĂN T 51 PHAN P NGUYỄN THỊ 52 TƯỜNG V 53 LÊ ĐÌNH P 54 TRƯƠNG ĐỨC H 55 TRẦN BÌNG H 56 CAO ĐỨC TRÙNG D 57 LƯU THỊ THANH L 58 PHAN NGỌC T 59 NGUYỄN YẾN P 60 TRẦN ĐÌNH P 61 PHẠM HÀ TÚ N 62 NGUYỄN THANH H 63 NGUYỄN THỊ ANH P 64 PHAN BÍCH H 65 TRƯƠNG GIA T 66 NGUYỄN THỊ THU T 67 PHAN THANH H 68 NHAN THỊ T 69 NGUYỄN NGỌC K 70 PHAN ĐĂNG L 71 LÂM VĂN L 72 PHẠM HOÀNG T 32 29 50 36 50 30 59 42 47 50 20 57 27 31 39 18 32 52 NAM NỮ NAM NAM NỮ NỮ NỮ NAM NỮ NAM NAM NAM NAM NỮ NỮ NAM NAM NAM 29 19 35 41 25 24 42 25 25 24 28 24 25 25 19 25 20 23 25 27 21 NỮ NAM NAM NAM NỮ NỮ NAM NỮ NAM NỮ NAM NỮ NỮ NAM NỮ NỮ NỮ NỮ NAM NAM NAM 135 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ĐINH THANH T NGUYỄN NGỌC H LÂM THANH M BÙI CÔNG T PHẠM THANH T PHẠM HOÀNG H NGUYỄN CÔNG NHƯ T LÊ THỊ NGỌC T NGÔ TRƯƠNG MỸ V TRẦN QUỲNH V NGUYỄN XUÂN H NGUYỄN THANH H TRẦN THỊ T NGUYỄN NGỌC D CAO THỊ XUÂN M PHẠM THÚY H BÙI NGỌC Q NGUYỄN THANH L 25 23 24 25 24 28 NỮ NỮ NAM NAM NỮ NAM 19 28 25 24 23 24 19 22 20 22 24 25 NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ Xác nhận 136 PHỤ LỤC DMEM: 500ml (GIBCO) 5ml Sodium pyruvat 100 MM (GIBCO) 5ml L-Glutamine 200 mM (GIBCO) 5ml NEAA (axit amin không thiết yếu) (GIBCO) 0,5ml Gentamycine 50mg/ml (GIBCO) 0,5ml 2Mercapto chloro 20ml huyết bào thai bê khử bổ thể (GIBCO) 20ml huyết bào ngựa khử bổ thể (GIBCO) Cho vào chai 180 ml EMEM: 500ml môi trường REGA (GIBCO) 0,5ml Gentamycine 50mg/ml (GIBCO) 5ml Hepes (GIBCO) HAT: 100ml môi trường DMEM 2ml (2%) HT 1ml (1%) Aminopterin Dung dòch đệm citrate-phosphate pH= 0,15 M Dung dòch acide citric C 6H8O7, H2O 21g/l (MERCK) Dung dòch Na2HPO4, H2O 35,6g/l (MERCK) Trộn lẫn 49ml dung dòch acid citric 51ml dung dòch Na2HPO4 Dung dòch đệm carbonate-bicarbonate pH=9,6 0,05 M Na2CO3 1,59 g/l (MERCK) NaHCO3 2,93 g/l (MERCK) Dung dòch đệm PBS pH=7,2 0,15 M NaCl 8g/l (MERCK) KCl 0,20g/l (MERCK) Na2HP04 , 2H2O 1,42g/l (MERCK) KH2P04 0,20g/l (MERCK) 137 NaN3 1g/l (MERCK) Dung dòch đệm PBS + NaCl 2,5 M 300ml dung dòch đệm PBS 45g NaCl (MERCK) Dung dòch đệm Glycine/HCl pH=2,8 4l nước khử ion 30,028g Glycine H2N CH2 COOH (MERCK) 34,04g NaCl (MERCK) điều chỉnh pH=2,8 HCl Dung dòch đệm PBS+NaCl 1l PBS 146,1g NaCl (MERCK) Dung dòch đệm Tris/HCl 4l nước khử ion 145,368g Tris C4H11N03 (MERCK) Điều chỉnh pH=8 HCl 37 % HAT: Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine 10ml HT, 50 X (GIBCO) 5ml Aminopterin, 100 X (GIBCO) OPD: Orthophenylene diamine dihydrochloride OPD 4mg/ml Nước oxy già H2O2 30 % 10 ml PEG: polyethylenelycol 0,5g PEG 4000 (MERCK) 0,7ml dung dòch EMEM 50µl dung dòch dimethyl sulfoxide DMSO C2H20S (MERCK) 15 phút tủ sấy ướt + 1200C Sau để nguội 138 [...]... nghiên cứu y sinh học, miễn dòch học, thú y… Từ những vấn đề nêu trên, nghiên cứu thực hiện tạo ra kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein với kỹ thuật lai từ dòng tế bào ung thư IR983F và tế bào lymphô B chuột cống LOU, để có thể ứng dụng trong việc đònh lượng Alpha- fetoprotein MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: 1 Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein người 2 Đánh giá chất lượng kháng thể đơn dòng kháng. .. khoa việc đònh lượng Alpha- fetoprotein cùng với các xét nghiệm khác để giúp chẩn đoán dò tật thai nhi [28],[46],[82], [89],[95],[96] Thực tiển Việt Nam việc tạo ra kháng thể đơn dòng kháng Alphafetoprotein người có ý nghóa quan trọng, vì từ kháng thể đơn dòng này có thể đònh lượng Alpha- fetoprotein trong huyết thanh, và với kỹ thuật này sẽ tạo ra nhiều kháng thể đơn dòng kháng các kháng nguyên khác nhau... Kháng thể dùng để đònh isotype của kháng thể được tiết bởi tế bào lai có thể là kháng thể đa dòng hay đơn dòng, thường dùng là các kháng thể đơn dòng của chuột nhắt kháng lại các isotype của chuột cống Kỹ thuật được dùng là kỹ thuật ELISA 25 MARM: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng µ của chuột cống MARG1: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma1 của chuột cống MARG2a: kháng thể chuột nhắt kháng. .. MARG2b: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2b của chuột cống MARG2c: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2c của chuột cống MARL: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ lamda của chuột cống MARK: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ kappa của chuột cống Dựa vào các kháng thể trên và với kỹ thuật ELISA từ đó biết được isotype của kháng thể đơn dòng 1.2.9 Sản xuất kháng thể đơn dòng trong cơ thể. .. tuổi Mặt khác, nồng độ kháng thể đơn dòng phụ thuộc đặc tính tiết kháng thể của tế bào lai, kích thước của khối u (chính xác hơn là tế bào sống tiết kháng thể đơn dòng) , vò trí (ở dưới da hay ở trong ổ bụng), thời gian bán hủy của kháng thể đơn dòng Nồng độ trung bình trong dòch báng của kháng thể đơn dòng là từ 1 mg/ml đến 10 mg/ml Có nhiều phương pháp để tinh chế kháng thể đơn dòng, trong chuyên đề... kháng Alpha- fetoprotein người đã được tạo ra 3 Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein người đã được tạo ra trong đònh lượng Alpha- fetoprotein huyết thanh 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁNG THỂ 1.1.1 Cấu trúc: Từ globulin miễn dòch (Immunoglobulin = Ig) chính xác hơn gammaglobulin, vì phần lớn các kháng thể có khả năng di chuyển trong điện trường tới vùng γ, một số kháng thể. .. (Universite Catholique de Louvain) đã tạo ra dòng tế bào ung thư IR983F và dòng chuột cống LOU để sản xuất các kháng thể đơn dòng [39] Nhờ vào kỹ thuật sản xuất ra kháng thể đơn dòng từ đó đến nay đã tạo ra rất nhiều kháng thể đơn dòng kháng các kháng nguyên khác nhau, từ đó có nhiều ứng dụng trong nhận diện, đònh lượng kháng nguyên, và đặc biệt trong chẩn đoán và điều trò Alpha- fetoprotein là một glycoprotein,... thể sử dụng ngay, mà phải được ly tâm để lấy phần dòch nổi, và thêm PMSF + Thimerosal vào dòch báng, để chống nhiễm khuẩn Sau đó dòch báng được dự trử ở -200C hoặc -700C 1.2.10 Tinh chế kháng thể đơn dòng từ dòch báng ổ bụng: Khi tinh chế dòch báng để thu kháng thể đơn dòng được sản xuất từ tế bào lai phát triển trong ổ bụng Hai vấn đề cần xem xét là nồng độ kháng thể đơn dòng và các kháng thể đa dòng. .. các kháng thể kháng isotype người bằng cách tiêm cho con vật (thỏ) Ig đa hay đơn dòng của người 1.1.3.2 Nhóm quyết đònh allotype Người ta thấy có những đặc điểm kháng nguyên ở một số cá thể trong cùng một loài, do có khác biệt từ 1 đến 3 axit amin ở chuỗi CH và CL vật thí nghiệm có thể có được kháng thể kháng allotype tinh khiết sau khi mẫn cảm với huyết thanh cùng loài rồi hấp thụ nó với các kháng thể. .. vô hạn và sản xuất ra dòng kháng thể có cùng đặc tính kháng lại kháng nguyên đã được mẫn cảm trước Kháng thể đơn dòng có tính đồng nhất cao và rất đặc hiệu với kháng nguyên [30], [57], [98] Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới đã tạo ra nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau để thực hiện kỹ thuật hợp nhất tế bào, và dòng chuột thuần chủng để sản xuất kháng thể đơn dòng [39],[98] Các nhà khoa học tại ... TIÊU NGHIÊN CỨU: Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein người Đánh giá chất lượng kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein người tạo Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein. .. Dựa vào kháng thể với kỹ thuật ELISA từ biết isotype kháng thể đơn dòng 1.2.9 Sản xuất kháng thể đơn dòng thể sống: Sau chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên... .3 1.1 Kháng thể 1.2 Kháng thể đơn dòng 15 1.3 Đại cương Alpha-fetoprotein 28 Chương 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein