ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ ANH ĐÀO SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ ANH ĐÀO SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số chuyên ngành: 62 44 01 18 Phản biện 1: TS Tôn Thất Quang Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương Phản biện 3: TS Mai Đình Trị Phản biện độc lập 1: PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 2: PGS.TS Trần Khắc Vũ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai PGS.TS Trần Lê Quan TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015 Tp Hồ Chí Minh - Năm Phản biện độc lập 2: LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai PGS TS Trần Lê Quan, người tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm quý báu Cô Thầy động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu PGS.TS Nguyễn Trung Nhân Quý Thầy Cô Bộ môn Hóa Phân Tích tận tình hướng dẫn giúp đỡ hoàn thành môn học phần bổ sung Thạc sỹ Nguyễn Xuân Hải bạn phòng thí nghiệm chia sẻ kinh nghiệm tạo cho giây phút vui vẻ tháng ngày miệt mài với công việc TS Trương Thị Huỳnh Hoa kỹ thuật viên phòng máy NMR HPLC-MS thuộc phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm-ĐH Khoa học Tự nhiênĐH Quốc gia TP HCM PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương anh chị thuộc Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM- ĐH Y Dược TP HCM Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện thuận lợi giúp giải thủ tục hành Ban Giám hiệu Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Hóa học Thực phẩmTrường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, tạo điều kiện thời gian, đồng nghiệp gánh vác công việc, hỗ trợ thời gian học Con xin cám ơn Ba Mẹ Bố Mẹ hỗ trợ, động viên yên tâm hoàn thành việc học Cảm ơn Anh hai Con cho em gia đình êm ấm để em vững tin tiếp tục học tập công tác LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án Tiến sĩ Hóa học “Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa số thuốc An giang nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa, bảo vệ gan Tetrastigma erubescens Planch Nauclea orientalis (L.) L.” thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai PGS.TS Trần Lê Quan Những kết nghiên cứu luận án chưa tác giả khác công bố Việt Nam giới Điều kiểm tra cách tra cứu tài liệu tham khảo cung cấp phần mềm SciFinder Tôi xin cam đoan danh dự công trình khoa học Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 09 năm 2015 Tác giả luận án Phan Thị Anh Đào MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm gốc tự 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự thể 1.1.3 Vai trò gốc tự thể 1.1.4 Khái niệm chất kháng oxy hóa 10 1.1.5 Phân loại 11 1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 16 1.2 TỒNG QUAN VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA .20 1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 21 1.3.1 Mô tả thực vật phân bố sinh thái Tetrastigma erubescens Planch 21 1.3.2 Nghiên cứu dược học T.erubescens 22 1.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học T.erubescens 23 1.3.4 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Tetrastigma 24 1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L 28 1.4.1 Mô tả thực vật phân bố sinh thái Nauclea orientalis (L.) L 28 1.4.2 Nghiên cứu dược học N orientalis 30 1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học N orientalis 31 1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Nauclea 34 1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 39 1.5.1 Những vấn đề tồn 39 1.5.2 Định hướng nghiên cứu 40 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 42 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 42 2.1.1 Hóa chất 42 2.1.2 Thiết bị 42 2.2 ĐIỀU CHẾ MẪU CAO SÀNG LỌC, TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT 44 2.2.1 Nguyên liệu 44 2.2.2 Điều chế mẫu cao methanol 51 2.2.3 Trích ly phân lập hợp chất từ thân T.erubescens 51 2.2.4 Trích ly phân lập hợp chất từ thân N.orientalis 55 2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC 59 2.3.1 Nguyên tắc 59 2.3.2 Chuẩn bị mẫu 59 2.3.3 Điều kiện chạy HPLC 59 2.3.4 Điều kiện chạy MS 60 2.3.5 Dựng đường chuẩn 60 2.3.6 Xử lý kết 61 2.3.7 Nơi thực nghiệm 61 2.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 61 2.4.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 61 2.4.2 Khảo sát hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 63 2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan chuột nhắt bị suy giảm hệ miễn dịch cyclophosphamide (mô hình in vivo) 65 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 67 3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 67 3.1.1 Kết khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 67 3.1.2 Kết khảo sát hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 70 3.1.3 Bàn luận kết nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa 71 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS 73 3.2.1 Kết thử hoạt tính mẫu cao thân T erubescens 73 3.2.2 Kết thử hoạt tính mẫu cao thân N orientalis 74 3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 75 3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất phenol đơn vòng 75 3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất stilbene 86 3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất flavonoid 93 3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất benzopyranoid 112 3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất lignan 116 3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất steroid 119 3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất norisoprenoid 130 3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L 133 3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất phenol đơn vòng 134 3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất benzopyranoid 138 3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất triterpenoid 147 3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất monoterpenoid 157 3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất anthraquinone 170 3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất lignan 172 3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC 174 3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 175 3.6.1 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 175 3.6.2 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế trình peroxide hóa lipid 181 3.6.3 Kết nghiên cứu mô hình gây suy giảm miễn dịch chuột nhắt cyclophosphamide (mô hình in vivo) 183 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 187 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C) BHA : Butylated hydroxyanisole br : Broad (rộng) BHT : Butylated hydroxytoluene CHCl3 : Chloroform CTPT : Công thức phân tử CY : Cyclophosphamide d : Doublet (mũi đôi) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IC50 : Nồng độ mẫu mà ức chế 50 % gốc tự J : Hằng số ghép m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NOS : Nitrogen oxygen species NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline PG : Propyl gallate Pr : Protein PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký mỏng điều chế) quin : quintet (mũi năm) RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species s : Singlet (mũi đơn) SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone TCA : Acid Trichloroacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký mỏng) Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại) XO : Xanthine oxidase YHCT : Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp 12 Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid L-ascorbic acid dehydro ascorbic 14 Hình 1.3 Công thức cấu tạo vitamin E 14 Hình 1.4 Công thức cấu tạo β-carotene 15 Hình 1.5 Công thức cấu tạo taurine hypotaurine 15 Hình 1.6 Công thức cấu tạo acid α-lipoic 15 Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 17 Hình 1.8 Phản ứng tạo phức malonyldialdehyde acid thiobarbituric 19 Hình 1.9 Ảnh minh họa T erubescens 21 Hình 1.10 Cấu trúc hợp chất béo phân lập từ chi Tetrastigma 25 Hình 1.11 Cấu trúc hợp chất steroid phân lập từ chi Tetrastigma 25 Hình 1.13 Cấu trúc hợp chất phenol phân lập từ chi Tetrastigma 26 Hình 1.14 Cấu trúc hợp chất flavonoid phân lập từ chi Tetrastigma 27 Hình 1.15 Cấu trúc hợp chất trans-reveratrol phân lập từ chi Tetrastigma 27 Hình 1.16 Cấu trúc hợp chất chứa nitrogen phân lập từ chi Tetrastigma 28 Hình 1.17 Cấu trúc số hợp chất khác phân lập từ chi Tetrastigma 28 Hình 1.18 Ảnh minh họa cây, hoa N orientalis 29 Hình 1.19 Cấu trúc số hợp chất alkaloid phân lập từ N orientalis 33 Hình 1.20 Cấu trúc số hợp chất steroid chất béo phân lập từ N orientalis33 Hình 1.21 Cấu trúc số hợp chất terpenoid phân lập từ N orientalis 34 Hình 1.22 Cấu trúc số hợp chất polyphenol phân lập từ N orientalis 34 Hình 1.24 Cấu trúc số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea 38 Hình 1.25 Cấu trúc số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea 39 Hình 3.1 Tương quan HMBC hợp chất DR-2 77 Hình 3.2 Tương quan HMBC hợp chất DR-4 79 Hình 3.3 Tương quan HMBC hợp chất DR-5 81 Hình 3.4 Tương quan HMBC COSY hợp chất DR-9 85 Hình 3.5 Tương quan HMBC COSY hợp chất DR-10 88 Hình 3.6 Tương quan HMBC COSY hợp chất DR-11 90 Hình 3.7 Tương quan HMBC COSY hợp chất DR-12 92 [...]... có bất kỳ một nghiên cứu quy mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa Do đó, luận án thực hiện với mục tiêu sàng l c hoạt tính kháng oxy hóa của các cây thuốc An Giang, từ đó l a chọn các cây thuốc có hoạt tính mạnh l m đối tượng nghiên cứu phân l p và định danh các hoạt chất kháng oxy hóa Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa được sử dụng trong luận án bao... hợp với nhau tạo thành phân tử trung hòa hoặc khi sản phẩm của phản ứng không còn ở trạng thái gốc (phản ứng 1.18-1.2 0) 8 LH + HO•  L + H2O (1.1 5) L + O2  LOO• (1.1 6) LOO• + LH  LOOH (1.1 7) L + L  L- L (1.1 8)  LOOL (1.1 9) + LOO•  LOOOOL (1.2 0) L + LOO• LOO• LOOH + Fe2+  LO• + OH- + Fe3+ (1.2 1) LOOH + Fe3+  LOO• + OH- + Fe2+ (1.2 2) LOOH  LO•  MDA (1.2 3) Quá trình peroxide hóa cũng có thể... phụ thuộc vào pH của môi trường và bản chất của dung môi Mô hình thử nghiệm ET bao gồm hai thành phần chính l chất kháng oxy hóa và chất oxy hóa (chất nền) Chất nền l một chất oxy hóa và l y một electron từ chất kháng oxy hóa, kết quả l màu sắc của chất nền bị thay đổi 16 Mức độ thay đổi màu sắc tỉ l với nồng độ của chất kháng oxy hóa Phản ứng kết thúc khi không còn sự thay đổi màu sắc Một số phương... huyện Tịnh Biên, An Giang l m đối tượng nghiên cứu sàng l c hoạt tính kháng oxy hóa Các cây thuốc sàng l c được l a chọn theo ba tiêu chí: (a) Kinh nghiệm dân gian (b) Tham khảo tài liệu (c) Chọn ngẫu nhiên Tiêu chí kinh nghiệm dân gian: các cây thuốc được l a chọn dựa trên các công dụng điều trị các bệnh có liên quan đến gốc tự do tại vùng An Giang như: viêm nhiễm, thấp khớp, ung thư, Alzheimer, Parkinson,... bởi oxygen đơn bội, hypochlorite, sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp (phản ứng 1.21 và 1.2 2) Lipid hydroperoxide bị phân hủy thành rất nhiều sản phẩm như aldehyde (malonyldialdehyde, acrolein, crotonaldehyde), alkane, lipid epoxide, alcohol Trong đó, hợp chất malonyldialdehyde (MDA) l sản phẩm aldehyde phổ biến nhất và nó được xem l dấu hiệu của quá trình peroxide hóa lipid (phản ứng 1.2 3). .. 1.1.5.1 Chất kháng oxy hóa tổng hợp [34,82,84] Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp được sử dụng nhiều trong thực phẩm đóng hộp như butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ), propyl gallate (PG) (hình 1. 1) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tổng hợp có nguy cơ gây bệnh ung thư và nhiều tác dụng phụ, không an toàn... nhóm methylene của lipid (LH) hình thành gốc tự do lipid (L ) (phản ứng 1.1 5) Gốc tự do lipid sẽ tiếp tục phản ứng với oxygen trong cơ thể tạo gốc tự do lipid peroxyl (LOO ) Gốc LOO• sẽ hình thành hợp chất lipid hydroperoxide (LOOH) bằng cách l y đi một nguyên tử hydrogen từ một acid béo không no kế cận nó trong giai đoạn thứ hai gọi l giai đoạn phát triển (phản ứng 1.16 và 1.1 7) Giai đoạn kết thúc... (GPx) glutathione peroxidase GPx có vai trò chuyển hóa lipid hydroperoxide (LOOH) thành LOH dưới sự oxy hóa đồng thời của glutathione (GSH) (phản ứng 1.3 3): 12 +GPx LOOH + 2GSH LOH + GSSG + H2O (1.3 3) GPx cũng xúc tác cho quá trình chuyển hóa H2O2 thành H2O (phản ứng 1.3 4): H2O2 + 2GSH +GPx GSSG + 2H2O (1.3 4) b) Chất kháng oxy hóa không có bản chất enzyme Nhiều nhóm hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa. .. DR-29 so sánh với loliolide 131 Bảng 3.39 Số liệu phổ của hợp chất DR-30 so sánh với ( +)- dehydrovomifoliol 133 Bảng 3.40 Số liệu phổ của hợp chất GV-5 so sánh với acid 3-(2,4dihydroxylphenyl)propanoic 135 Bảng 3.41 Số liệu phổ của hợp chất GV-6 so sánh với methyl 3-(2,4 dihydroxylphenyl)propanoate 137 Bảng 3.42 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-7 so sánh với acid trans-p-coumaric ... suất điều chế cao chiết methanol của các cây thuốc nghiên cứu sàng l c 45 Bảng 2.2 Khối l ợng và thu suất các loại cao từ thân cây T .erubescens 51 Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây T erubescens 53 Bảng 2.4 Khối l ợng và thu suất các loại cao từ thân cây N .orientalis 55 Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N orientalis 57 Bảng 2.6 Chương trình ... PHAN THỊ ANH ĐÀO SÀNG L C HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L. ). .. Tiến sĩ Hóa học Sàng l c hoạt tính kháng oxy hóa số thuốc An giang nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa, bảo vệ gan Tetrastigma erubescens Planch Nauclea orientalis (L. ) L. ” thực... nhiên: số thuốc khác Từ kết sàng l c hoạt tính kháng oxy hóa thuốc An Giang, hai thuốc có hoạt tính mạnh l a chọn để nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa bao gồm Tetrastigma erubescens