ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Thương Huyền NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Thương Huyền NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh lý học Người Động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 Phản biện 1: PGS.TS Bùi Hồng Thủy Phản biện 2: PGS.TS Lê Xuân Cương Phản biện 3: TS Lê Văn Ty Phản biện độc lập 1: PGS.TS Mai Văn Sánh Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Văn Hạnh LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Hoàng Nghĩa Sơn TS Nguyễn Quốc Đạt Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Những kết nghiên cứu hoàn toàn chưa công bố tác giả khác -i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành công trình này, nhận quan tâm, giúp đỡ người thân, Thầy Cô, bạn bè đồng nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Thầy – TS Hoàng Nghĩa Sơn Thầy – TS Nguyễn Quốc Đạt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho hoàn thành luận án Cảm ơn Thầy – ThS Phan Kim Ngọc quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho hoàn thành luận án Chân thành cảm ơn Thầy Cô, đồng nghiệp, em thuộc Bộ môn Sinh lý Công nghệ Sinh học Động vật Phòng thí nghiệm Nghiên cứu ứng dụng Tế bào gốc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, đặc biệt em nhóm Hỗ trợ sinh sản bên cạnh hỗ trợ suốt thời gian làm luận án Chân thành cảm ơn Thầy Cô, đồng nghiệp Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp HCM động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho thời gian làm luận án Cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Út, ThS Nguyễn Thị Thoa cho góp ý chân thành Cảm ơn Thầy/Cô Hội đồng bảo bệ luận án tiến sĩ cấp Đơn vị Chuyên môn, cấp Cơ sở đào tạo, Thầy phản biện kín cho góp ý chân thành để chỉnh sửa, hoàn chỉnh nội dung luận án Cảm ơn cán bộ, cô công tác, làm việc Công ty Kỹ nghệ súc sản Vissan lò mổ Thành Vinh tạo điều kiện cho thu nhận mẫu buồng trứng bò - ii Cảm ơn anh Đoàn Minh Chánh - Công ty TNHH Anh Chánh tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận án Cảm ơn TS Nguyễn Thị Ước, em Minh Hiệp, Diệu Hằng, Thành Long giúp đỡ nguồn tài liệu để hoàn thành luận án Lời cuối xin bày tỏ lòng biết ơn Bố Mẹ nuôi dạy chỗ dựa cho Cảm ơn Má thông cảm tạo điều kiện cho Cảm ơn em yêu thương quan tâm, giúp đỡ Cảm ơn Chồng tất có Cảm ơn Paris - gái yêu mẹ Tp Hồ Chí Minh tháng 03 năm 2014 Nguyễn Thị Thương Huyền - iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iv Danh mục bảng ix Danh mục hình xi Danh mục từ viết tắt xii Bảng đối chiếu thuật ngữ xiv PHẦN MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI Chương TỔNG QUAN 1.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 1.1.1 Những nghiên cứu giới 1.1.1.1 Đông lạnh tế bào trứng chín (MII) 1.1.1.2 Đông lạnh tế bào trứng túi mầm (GV) 1.1.2 Những nghiên cứu Việt Nam 1.2 CƠ SỞ KHOA HỌC ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 10 1.2.1 Khái niệm 10 1.2.2 Cơ chế sinh học lạnh tế bào 11 1.2.2.1 Tốc độ làm lạnh giải đông 11 1.2.2.2 Những biến đổi trình đông lạnh 12 1.2.2.3 Những tổn thương trình đông lạnh 14 1.2.3 Các phương pháp đông lạnh tế bào trứng 17 1.2.3.1 Đông lạnh chậm (Slow-cooling) 17 1.2.3.2 Đông lạnh cực nhanh (Thủy tinh hóa, vitrification) 18 1.2.4 Các chất bảo vệ lạnh 20 - iv 1.2.4.1 Chất bảo vệ ngoại bào 20 1.2.4.2 Chất bảo vệ nội bào 22 1.2.4.3 Một số chất bảo vệ lạnh khác 23 1.2.5 Các tiêu chuẩn đánh giá chất lượng tế bào trứng sau bảo quản lạnh 23 1.2.6 Những khó khăn bảo quản lạnh tế bào trứng so với tế bào khác 24 1.3 SỰ PHÁT TRIỂN VÀ CHÍN CỦA TẾ BÀO TRỨNG TRONG CƠ THỂ 25 1.3.1 Sự trưởng thành nhân 25 1.3.2 Sự trưởng thành tế bào chất 26 1.3.3 Cấu tạo tế bào trứng chín 26 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN TẾ BÀO TRỨNG 27 1.5 NUÔI CHÍN TẾ BÀO TRỨNG TRONG ỐNG NGHIỆM 28 1.5.1 Khái niệm 28 1.5.2 Phân loại chất lượng tế bào trứng sau thu nhận 28 1.5.3 Đánh giá chất lượng tế bào trứng sau nuôi chín 29 1.5.3.1 Sự giãn nở tế bào cumulus 29 1.5.3.2 Sự trưởng thành nhân bào tương trứng 29 1.6 QUÁ TRÌNH THỤ TINH TRONG CƠ THỂ 30 1.6.1 Khái niệm thụ tinh 30 1.6.2 Cơ chế trình thụ tinh 30 1.6.3 Quá trình phát triển phôi 31 1.7 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN TẾ BÀO TRỨNG BÒ ĐÔNG LẠNH 32 1.7.1 Chuẩn bị tế bào trứng 32 1.7.2 Chuẩn bị tinh trùng 32 1.7.3 Chuyển tế bào trứng vào vi giọt thụ tinh 33 1.8 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHÔI IN VITRO 33 1.9 MÔI TRƯỜNG DÙNG CHO THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Ở TẾ BÀO TRỨNG BÒ 34 -v 1.10 NHẬN ĐỊNH CHUNG VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG 37 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 VẬT LIỆU 38 2.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 39 2.2.1 Nội dung 1: Nuôi chín tế bào trứng tươi ống nghiệm 40 2.2.2 Nội dung 2: Đông lạnh, giải đông tế bào trứng chín (TBT MII) 41 2.2.3 Nội dung 3: Thụ tinh ống nghiệm từ tế bào trứng MII đông lạnh 41 2.2.4 Nội dung 4: Thử nghiệm cấy truyền phôi tạo từ tế bào trứng MII đông lạnh 42 2.2.5 Nội dung 5: Đông lạnh, giải đông tế bào trứng GV 42 2.2.6 Nội dung 6: Nuôi chín tế bào GV sau bảo quản lạnh 43 2.2.7 Nội dung 7: Thụ tinh ống nghiệm từ TBT GV đông lạnh nuôi chín in vitro 43 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.3.1 Phương pháp thu buồng trứng tế bào trứng 44 2.3.2 Đánh giá phân loại tế bào trứng sau thu hoạch 45 2.3.3 Phương pháp nuôi chín tế bào trứng 45 2.3.3.1 Nuôi chín tế bào trứng tươi (chưa qua đông lạnh) 45 2.3.3.2 Nuôi chín tế bào trứng qua đông lạnh 47 2.3.4 Phương pháp đông lạnh tế bào trứng 47 2.3.4.1 Đông lạnh cọng rạ 48 2.3.4.2 Đông lạnh vi giọt 49 2.3.5 Phương pháp giải đông 49 2.3.5.1 Giải đông tế bào trứng cọng rạ 50 2.3.5.2 Giải đông tế bào trứng vi giọt 51 2.3.6 Phương pháp đánh giá sống/chết tế bào trứng sau đông lạnh 52 2.3.6.1 Đánh giá theo hình thái 52 2.3.6.2 Đánh giá theo nhuộm PI (propidium iodide) 53 - vi 2.3.6.3 Đánh giá theo nhuộm AO/PI 54 2.3.7 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm 54 2.3.8 Phương pháp nuôi phôi 57 2.3.9 Phương pháp đông lạnh phôi 57 2.3.10 Phương pháp cấy truyền phôi 58 2.3.11 Phương pháp xử lí số liệu 59 Chương KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 60 3.1 KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TẾ BÀO TRỨNG TƯƠI TRONG ỐNG NGHIỆM 60 3.2 KẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG MII 64 3.3 KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TBT MII ĐÔNG LẠNH 71 3.3.1 Thụ tinh ống nghiệm từ tế bào trứng MII đông lạnh theo quy trình 71 3.3.2 Thụ tinh ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh theo quy trình quy trình 76 3.3.3 So sánh hiệu thụ tinh ống nghiệm từ TBT MII đông lạnh 81 3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CẤY TRUYỀN PHÔI TẠO RA TỪ CÁC TBT MII QUA ĐÔNG LẠNH 84 3.5 KẾT QUẢ ĐÔNG LẠNH, GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG GV 86 3.6 KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TBT GV SAU KHI BẢO QUẢN LẠNH 91 3.6.1 Kết nuôi chín TBT GV đông lạnh đợt 92 3.6.1.1 Đánh giá ảnh hưởng môi trường, vật mang tương tác môi trường vật mang lên kết nuôi chín in vitro 94 3.6.1.2 So sánh ảnh hưởng cặp yếu tố môi trường – vật mang lên kết nuôi chín in vitro 95 3.6.2 Kết nuôi chín TBT GV đông lạnh đợt 101 3.7 KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TBT GV ĐÔNG LẠNH ĐƯỢC NUÔI CHÍN IN VITRO 106 - vii 3.8 SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG Ở HAI GIAI ĐOẠN 109 3.9 SO SÁNH HIỆU QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ TBT ĐÔNG LẠNH Ở HAI GIAI ĐOẠN 110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 Kết luận 113 Kiến nghị 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 PHỤ LỤC - viii     4.1.2 KIỂM ĐỊNH - Tỉ lệ thu hồi > N1 CR VG ĐC M chisq.test(M) Pearson's Chi-squared test Pearson's Chi-squared test data: M X-squared = 271.9638, df = 2, pvalue < 2.2e-16 data: M X-squared = 271.9638, df = 2, pvalue < 2.2e-16   5.2.2.2 So sánh cặp tỉ lệ - Tỉ lệ sống sau nuôi CR SO VOI VI GIOT > N1 NT1 NT2 NT3 M chisq.test(M) Pearson's Chi-squared test data: M X-squared = 4.3181, df = 2, p-value = 0.1154 - Phôi 8-16 tế bào > NT1 NT2 NT3 M chisq.test(M) Pearson's Chi-squared test data: M X-squared = 5.6288, df = 2, p-value = 0.05994 - Phôi nang > NT1 NT2 NT3 M chisq.test(M) Pearson's Chi-squared test data: M X-squared = 8.0253, df = 2, p-value = 0.01809 8.2 So sánh cặp tỉ lệ - Phôi tế bào + NT1 so với NT2 > N1 [...]... còn thấp hơn nhiều so với các nghiên cứu trên thế giới Để nâng cao tỉ lệ TBT sống sau đông -1- lạnh, giải đông và góp phần nâng cao tỉ lệ tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT đông lạnh, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm 2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Cải tiến được quy trình đông lạnh TBT bò bằng phương pháp thủy tinh... Nam nhằm góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1/ Nuôi chín TBT tươi trong ống nghiệm 2/ Đông lạnh, giải đông TBT chín (TBT MII) 3/ Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT MII đông lạnh 4/ Thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ các TBT MII đông lạnh 5/ Đông lạnh, giải đông TBT giai đoạn túi mầm (TBT GV) 6/ Nuôi chín TBT GV sau khi được bảo quản lạnh. .. tinh trong ống nghiệm từ các TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro 4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI  Nâng cao được tỉ lệ sống của TBT bò sau đông lạnh, giải đông góp phần nâng cao hiệu quả tạo phôi trong ống nghiệm từ TBT bò đông lạnh;  Góp phần trong việc thành lập ngân hàng tế bào sinh sản gia súc, từ đó làm cơ sở để nghiên cứu đông lạnh TBT của các động vật khác và các nghiên cứu cơ... bảo quản lạnh đang gặp nhiều khó khăn, chưa phổ biến Việc nghiên cứu một quy trình đông lạnh tối ưu TBT đã và đang được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước chú ý Các nhà khoa học đã có nhiều nghiên cứu cải tiến các phương pháp đông lạnh TBT với mục đích nâng cao tỉ lệ sống của tế bào sinh sản sau đông lạnh, giải đông [58, 61, 65, 77] Đối với bò, các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tạo phôi. .. thu trên bò sống bằng máy siêu âm (Ovum Pick Up - OPU) hoặc từ nguồn TBT đông lạnh [1, 61] Tạo phôi từ TBT tươi cho kết quả khả quan, nhưng số lượng và thời gian tiến hành trên TBT tươi rất hạn chế vì TBT dễ bị hư hỏng, tốn kém Hiệu quả IVF từ nguồn TBT đông lạnh thường thấp hơn so với TBT tươi Vì vậy, việc cải tiến quy trình đông lạnh và giải đông nhằm nâng cao hiệu quả IVF từ TBT bò đông lạnh là một... nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu về việc bảo quản TBT ở động vật có vú, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (TBT) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi 1.2 CƠ SỞ KHOA HỌC ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 1.2.1 Khái niệm Đông lạnh tế bào nói chung, đông lạnh TBT bò nói riêng là quá trình chuyển tế bào từ trạng thái sinh lí bình... CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ 1.1.1 Những nghiên cứu trên thế giới Đông lạnh và bảo quản TBT của động vật có vú chỉ mới được thực hiện gần đây và sự thành công thấp hơn so với bảo quản tinh trùng và phôi Năm 1958, một trong những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản lạnh TBT chuột, sau khi rã đông, các TBT này sống nhưng không cho kết quả khi tiến hành thụ tinh [130] Năm... Nâng cao tỉ lệ sống của TBT MII sau khi đông lạnh, giải đông bằng phương pháp thủy tinh hóa cải tiến (bổ sung 1µM Taxol vào môi trường cân bằng, môi trường thủy tinh hóa và bổ sung 10% dung dịch Tyrode vào môi trường sau khi giải đông bước 3);  Nuôi chín TBT bò trong ống nghiệm từ nguồn TBT GV đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa;  Tạo được phôi bò trong ống nghiệm từ các TBT MII và GV đông lạnh. .. thương lạnh đến các giọt lipid bên trong tế bào, lipid ở trong màng tế bào và bộ xương tế bào [62] 1.2.2.2 Những biến đổi trong quá trình đông lạnh Sự hình thành tinh thể đá Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào sau đông lạnh Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quy t định dạng tinh thể nước đá hình thành Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì... kỹ thuật khác như tạo động vật chuyển gen, cắt phôi, khai thác nguồn tế bào gốc phôi [12, 61, 75] Để chủ động nguồn nguyên liệu cho việc tạo phôi trong ống nghiệm đã có nhiều nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng và tế bào trứng (TBT) Bảo quản lạnh tinh trùng đã rất thông dụng đối với cả người và động vật có vú Nguồn tinh trùng khá dồi dào, khả năng sống, thụ tinh sau giải đông khá cao Ngược lại, nguồn ... nâng cao tỉ lệ tạo phôi ống nghiệm từ TBT đông lạnh, tiến hành đề tài: Nghiên cứu cải tiến quy trình đông lạnh tế bào trứng bò nhằm nâng cao hiệu tạo phôi ống nghiệm MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Cải tiến. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Nguyễn Thị Thương Huyền NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG BÒ NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh lý học Người Động vật... TBT đông lạnh thường thấp so với TBT tươi Vì vậy, việc cải tiến quy trình đông lạnh giải đông nhằm nâng cao hiệu IVF từ TBT bò đông lạnh yêu cầu cấp thiết Nghiên cứu thụ tinh ống nghiệm từ TBT bò