Đang tải... (xem toàn văn)
hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BỘ MÔN THÚ Y GIAO TRÌNH HƢỚNG DẪN THỰC HÀNH MÔN ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM Food and Animal Toxicology AN 407C Ly Thi Lien Khai, PhD Cần Thơ, 3/2015 THỰC HÀNH ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM Unit Bài Detection of the borax residues in fresh meat and animal products Xác định diện hàn the thịt sản phẩm thịt Trang thiết bị dụng cụ - Lò nung, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật - Bình tam giác, đũa thủy tinh, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, phểu thủy tinh, đĩa Petri, ống hút, chậu thủy tinh, nhiệt kế, cối, chày, dao, kéo, số dụng cụ khác… Hóa chất: Cồn, nước cất, HCl, H3BO3, H2SO4, CaCl2, CaO, methyl orange, phenolphtalein, malnitol … Mẫu vật thí nghiệm: Mẫu vật lấy từ chợ siêu thị TP Cần Thơ bao gồm: thịt bò, thịt heo, cá biển, chả lụa Điều chế giấy thử hàn the - Cắt tờ giấy lọc thành mãnh có kích thước x 1cm - Hòa tan 1gram Curcumin vào 100ml cồn 96o lắc mạnh bình tam giác phút, sau nhúng mãnh giấy lọc vào dung dịch, sau lấy đem sấy khô (40oC), ta giấy thử hàn the Chú ý bảo quản giấy thử hàn the chỗ tối tránh ánh sáng Tạo bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the (AOAC,1995) - Pha dung dịch acid boric chuẩn: + H3BO3 1%: pha 1gram H3BO3 vào 100ml nước cất + H3BO3 2%: pha 2gram H3BO3 vào 100ml nước cất + H3BO3 4%: pha 4gram H3BO3 vào 100ml nước cất + H3BO3 8%: pha 8gram H3BO3 vào 100ml nước cất - Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: lấy 11 ống nghiệm loại 15ml, đánh số từ 0-10 Lần lượt hút 0,00ml; 0,5ml; 1ml; 2ml; 2,5ml; 3,5ml; 4,5ml; 5ml H3BO3 1% cho vào ống nghiệm có số thứ tự tương ứng 0-7, cho 5ml H3BO3 2%; 5ml H3BO3 4%; 5ml H3BO3 8% vào ống nghiệm 8; 9;10 Sau pha loãng đến 10ml tất dung dịch ống nghiệm nước cất cho tiếp vào ống nghiệm 0,7 ml HCl đặm đặc Các dung dịch tương ứng với nồng độ H3BO3 là: 0,00; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,5%; 0,7%; 0,9%; 1%; 2%; 4%; 8% Nhúng tờ giấy thử hàn the đánh số từ 0-10 vào dung dịch tương ứng với số thứ tự ống nghiệm Sau lấy tờ giấy thử để đem sấy nhiệt độ 30-40oC Đọc bảng so màu giấy thử hàn the Đọc bảng so màu giấy thử hàn the Hàm lượng “ít” 0,1-0,4% Hàm lượng “vừa” 0,5-0,9% 0,0 0,1 0,5 0,2 0,4 0,7 0,9 1,0 Hàm lượng “nhiều” 1-8% 10 11 2,0 4,0 8,0 % H3BO3 Bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the Bảng so màu ƣớc lƣợng hàm lƣợng hàn the theo thang điểm Phương pháp quan sát mẫu theo cảm quan - Trạng thái: + Độ đàn hồi: dùng đầu ngón tay ấn vào bề mặt khối thịt, độ đàn hồi trở lại thịt tươi, bề mặt thịt từ từ trở lại thịt bắt đầu ôi, thịt lỏm xuống thịt ôi + Quan sát thịt ướt hay khô - Màu sắc: thịt tươi thường có màu đỏ hồng, nếu: + Màu tái, rỉ nước, nhão, thịt giết mổ lúc thú sốt + Sậm màu, săn cứng, thịt giết mổ lúc thú mệt + Tái, vắt nước, gia súc chết lâu thịt Hình Điều kiện bảo quản thịt tại siêu thị (15-18°C) Picture Beef with borate Picture Beef with borate Picture Beef without borate Picture Beef without borate Picture Pork with numerous level of borate -Mùi vị: + Thịt tươi thường có mùi vị bình thường + Thịt ôi: có mùi thối, khét + Mùi khác thường: thịt có ướp hóa chất, kháng sinh, heo nọc… Ngoài dựa vào cách thức bảo quản sở bán đánh giá phần chất lượng thịt Phương pháp phân tích định lượng hàn the Theo phương pháp bảng so màu ước lượng (AOAC,1995) hàm lượng hàn the Nêu nhận định tác hại hàm lựơng hàn the vừa phân tích sức khỏe người tiêu dùng Phương pháp xác định hàn the (Borax) trongTP Cần que thử, cồn 960 , HCl 4N Cách làm: cân 10 g mẫu, nghiền nát thêm 20 ml nước cất ml HCl 4N Sau dùng que thử nhún ngậm sâu vào dd mẫu cần thu63, sấy khô Đọc kết quả, định lượng dựa vào thang điểm ước lượng hàm lượng hàn the có TP Bài Khảo sát dƣ lƣợng kháng sinh thịt gia súc, gia cầm, Sữa Detection of the anitibiotic residues in fresh meat, poultry and milk Khảo sát dƣ lƣợng kháng sinh thịt gia súc, gia cầm, Dùng phƣơng pháp FPT (Four Plate Test) (Heitzman, 1994) Các chủng VK: Bacillus cereus, E coli Môi trường: NA (BHI, hay TSA), PCA Đĩa petri đường kính 90mm Mẫu 100g thịt nạc , bảo quản lạnh Nếu chưa xét nghiệm phải bảo quản 18oC Bảng Vi khuẩn nuôi cấy 35oC/24h, (5x10 4CFU/ml) Kháng sinh Chủng VK MT kiểm tra, pH chuẩn Penicillin B subtilis No 10663, 6,2 Tetracycline B cereus NA, Flumequin E coli PCA, ĐK nuôi cấy 30oC/18h 30oC/18h 30oC/18h Cách pha chế mt kiểm tra dư lượng kháng sinh: Môi trường pha hấp vô trùng, nguội 45oC cho thể tích huyễn dịch vk (bào tử) đổ ml mt vào đĩa petri Mẫu thịt kiểm tra cắt miếng tròn, nhỏ dày 2mm, đường kinh 8mm gắp mẫu vô trùng chuẩn Mỗi đĩa đặt 6-8 lát mẫu thịt/ đĩa (Oboegbulem fidelis, 1996) Ở đĩa đặt đĩa kháng sinh chuẩn Ủ đĩa nhiệt độ thích hợp sau 18-24h đọc kết quả: Nếu vòng vô khuẩn ≥ 2mm kết luận mẫu thịt dương tính: có tồn dư kháng sinh Đĩa KS chuẩn Mẫu thịt Bài Phân lập- định danh nấm Aspergillus flavus, A fumigatus có thức ăn gia súc – Khảo sát độc lực aflatoxin vịt Isolation of Aspergillus flavus, A fumigatus from feed Aflatoxin examination in laboratory animal –baby duck Giống Aspergillus Khuẩn lạc Aspergillus fumigatus Khuẩn lạc Aspergillus niger Khuẩn lạc Aspergilus flavus Bào tử Aspergilus Hình Khuẩn lạc Aspergillus niger Hình Khuẩn lạc Aspergillus fumigatus Khuẩn lạc Aspergillus fumigates Sau xác định thức ăn có nấmđể kiểm tra nấm Aspergillus quan sát có chứa độc tố aflatoxin không dùng mẫu thức ăn nầy cho vịt ăn xem biểu bệnh lỳ lâm sàng vịt thí nghiệm Theo dõi 3-5 ngày Ghi kết so với triệu chứng ngộ độc có biểu bệnh lý Bài Khảo sát ngộ độc chất độc từ thực vật – Nitrate Determine the nitrate concentration in vegetables, plant for animal feed, and human Chất độc nitrate thường thấy có hàm lượng nhiều, phổ biến thực vật hay nước, nước thảy chăn nuôi hóa chất Ngộ độc cấp tính nitrate chứa cỏ nồng độ > 1% (cỏ khô) hay 1.500 ppm nước Ở nồng độ 2.000ppm nitrate nước cho bò ăn 10% P /17 ngày không gây ngộ độc cấp tính Nhưng liều 3.000ppm cho bò ăn ngày làm bò chết nhiễm độc cấp tính (Dollahite Rowe, 1974) Nồng độ 2-4% gây độc cấp tính cho đv nhai lại Triệu chứng: xảy 30’-4h sau bò uống hay ăn cỏ nhiễm nitrate từ 5-8 ngày Bò chảy nước bọt, ói, tiêu chảy đau bụng Bò tiểu nhiều nước nhiễm nitrate, thiếu oxy huyết Bò khó thở, mạch ỵếu, máu có màu nâu hay socola Run cơ, suy kiệt, điều vận Bò không di chuyển ép buộc cử động Vật chết 1224h Chẩn đóan: máu có màu nâu tạo methemoglobin, trị methylene blue 2mg/1 lb P, cho uống dung dịch 2-4% Xét nghiệm nồng độ nitrate từ chất chứa dày, cỏ, huyết tương, nước tiểu, cỏ, nước Phương pháp kiểm tra nitrate có nước hay thực vật rau, cây, cỏ Cho 0.5g diphenylamine vào 20ml nước Thêm acid sulfuric 100ml Làm lạnh giữ chai màu nâu Hòa Stock solution v/v 80% sulfuric acid chất thử Nhỏ giọt chất thử bề mặt cắt mẫu cây, cần kiểm tra Màu chuyển từ màu xanh xanh dƣơng: + mẫu chứa > 2% nitrate Bài Xác định độc tố vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử Bacteria toxins detection by molecular technique Sample collection : diarrhea feces samling from pilet/poultry + Isolation of Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) + Determination of toxic genes STb from ETEC caused piglet diarrhea by PCR analysis – Electrophoresis + Determination of these toxins in animal laboratory-mice + Results analysis Khảo sát vi khuẩn gây bệnh gia súc, gia cầm - Vi khuẩn Escherichia coli Là nhóm vsv tồn đường tiêu hóa, trở thành nhân tố gây bệnh cho người động vật có điều kiện thuận lợi Qua thực tập giúp sinh viên nắm vững kỹ thuật thao tác mổ khám, định bệnh, xác định nguyên nhân nghi bệnh - Chẩn đóan xác nguyên nhân gây ngộ độc độc tố vsv - Có thể thực hành đưa phát đồ Phòng trị ngộ độc - Khám ngũ quan, sờ nắn, mổ khám bệnh tích - Học nắm vững toxin vsv gây bệnh chết vật mổ khám cách lấy mẫu: + Nuôi cấy phân lập + Định danh xác định chủng VK gây bệnh + Xác định gene độc lực + Khi phát VK E coli mẫu bệnh có độc lực, muốn biết xác độc tố gây bệnh làm chết vật tiến hành thí nghiệm động vật thí nghiệm +Tiêm độc tố vào động vật thí nghiện cảm thụ Do cần biết rõ : loại độc tố động vật cảm thụ, cách tiêm, đƣờng tiên truyền + Quan sát diễn tiến bệnh thí nghiện động vật thí nghiệm: ghi nhân, hình ảnh minh họa + Thu thập mẫu bệnh, tiến hành phân lập để xác định lại xem có VK tiêm thử nghiệm làm động vật thí nghiệm bệnh chết, cách tiến hành mẫu bệnh phẩm phân tích - Thực hành bệnh tiêu chảy heo/trên gà bệnh ETEChay (hay bệnh nhóm thực tập thực đƣợc thực tập cho kết đủ Lấy mẫu phân heo tiêu chảy/ gà bệnh sau quan sát lâm sàng xác định E coli nhóm ETEC Phân lập- Định danh theo qui trình thường qui học cho E coli Mẫu bệnh phẩm phân, cấy trực tiếp MC, quan sát hình thái khuẩn lạc đậc trưng vk MC Định danh phản ứng sinh hóa Chọn cấy ≥ 10 khuẩn lạc đề tiến hành bước xác định gene đợc tố Khuẩn lạc E coli môi trƣờng MC Bang Các phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E coli (Cowan, 2003) Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn KIA Indole MR VP Citrate DĐ + + + - - + - + - + - + + + - + - - + + - + - + - - + + + Glu Lac H2S Gas E coli + + - Citrobacter + + Klebsiella + Enterobacter + Glu: Glucose Lac: Lactose proskauer MR: Methyl red (+): dương tính; (-): âm tính VP: Voges DĐ: di động; Phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E coli Xác định gene độc tố VK, dùng động vật thí nghiệm chuột bạch nên độtc tố gây bệnh có E coli nhạy cảm chuột STb (STa, STb) theo quy trình chi tiết sau: QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR XÁC ĐỊNH GENE ĐỘC LỰC (ST: STa, STb) CỦA VI KHUẨN E coli nhóm ETEC Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn Vi khuẩn E coli ETEC sau định danh phản ứng huyết học nuôi cấy môi trường TSA để tiến hành ly trích DNA Sau tăng sinh vi khuẩn TSA 37oC, 24 giờ, thu sinh khối cho vào eppendorf chứa ml nước tinh khiết không chứa DNA, hòa tan đun sôi cách thủy 100oC 10 phút Tiến hành ly tâm huyễn dịch eppendorf sau đun cách thủy với vận tốc 10.000 vòng 15 phút Sau ly tâm, thu lấy dịch bên phần cặn lắng, DNA template cho trình PCR Trữ DNA template -20oC Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR Để xác định gene mã hóa độc lực STa, STb vi khuẩn E coli , kỹ thuật PCR sử dụng để xác định đoạn gene mã hóa thành phần bảng Bảng 3: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR (Promega, USA) Hóa chất Master mix 2X Thể tích (µl) 12,5 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 DNA template 2,0 Nước tinh khiết 9,5 Tổng thể tích 25 Đối với mẫu đối chứng âm, thay DNA template nước cất vô trùng; mẫu đối chứng dương: sử dụng DNA template vi khuẩn E coli xác định dương tính với gene độc lực Trình tự nucleotide chu trình nhiệt đoạn primer xác định gene độc lực Sta, STb vi khuẩn E coli trình bày qua Bảng 3 Điện di nhuộm sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose 1,5%: cân 1,5 g thạch cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đun hòa tan thạch Để thạch nguội khoảng 70oC đổ khuôn tạo gel Sau gel đông đặc, đặt gel vào máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X, dùng micropipette cho sản phẩm PCR vào giếng thạch Chạy điện di sản phẩm PCR hiệu điện 100v vòng 60 phút Sau kết thúc điện di, nhuộm gel dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml) 30 phút rữa nước cất 15 phút Sau đó, quan sát chụp ảnh gel nhuộm tia UV Xem xét diện vạch gene ảnh chụp gel để xác định diện gene mã hóa độc lực LT, STa, STb, EAST1, eae Tiêm truyền cho động vật thí nghiệm chuột bạch theo quy trình hướng dẫn GVHD PTN Theo dõi ghi nhân kết - Mổ khám hay lấy mẫu phân tiêu chảy chuột không chết đem nuôi cấy phân lập Phân lập -Xác định Vk E coli Bảng 4: Trình tự nucleotide chu trình nhiệt primer đƣợc sử dụng để xác định gene độc lực E coli ETEC Độc tố STa (estA) STb (estB) Size (bp) Trình tự GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA 11 12 94 94 50 (52) 70 70 94 94 55 72 72 94 50 (52) 70 70 190 GCCTATGCATCTACACAATC TGAGAAATCGACAATGTCCG 10 Nhiệt độ (oC) 279 Thời gian (phút) 0:30 0:45 1:30 10 1 0:30 0:45 1:30 10 Chu kỳ Tham khảo 25 Franck et al., 1998 1 30 Vu-Khac H et al., 2007 25 500 bp 279 bp Kết điện di sản phẩm PCR xác định gene STb (279 bp) vi khuẩn E coli ETEC Giếng 1: Ladder (100bp) Giếng 7: ST62a (+) Giếng 2: Possitive control STb (+) Giếng 8: ST32a (+) Giếng 3: Negative control STb (-) Giếng 9: ST69a (-) Giếng 4: ST65a (-) Giếng 10: ST61b (+) Giếng 5: ST68d (-) Giếng 11: ST61g (-) Giếng 6: ST60-1 (+) Giếng 12: ST65a (-) 13 Phƣơng pháp xác định tính đề kháng với kháng sinh chủng ETEC Kiểm tra tính đề kháng ETEC với loại kháng sinh tiến hành theo phương pháp khuếch tán thạch Bauer et al (1966) Tính nhạy cảm kháng sinh thực phương pháp khuếch tán thạch theo phương pháp Bauer (1966), kết đo đường kính vô khuẩn dựa tiêu chuẩn viện tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (CLSI, 2012) loại kháng sinh thông dụng thú y công ty Nam Khoa sản xuất Môi trường MHA thử kháng sinh đồ đổ vào đĩa petri vô trùng (25ml/đĩa) Bề mặt đĩa làm khô tủ sấy trước sử dụng Huyễn dịch vi khuẩn chuẩn bị cách cấy ria khuẩn lạc thử phản ứng sinh hóa định danh lên môi trường NA ủ 37oC/24h, sau dùng que cấy chấm khuẩn lạc hòa tan vào 2ml nước muối sinh lý 9o/oo Lắc vortex điều chỉnh độ đục vi khuẩn để đạt mật độ 108 CFU/ml (so với ống chuẩn Mc Farland 0.5) Đĩa kháng sinh Que tăm Môi trường MHA Ủ 37oC/24h Canh khuẩn Bảng tiêu chuẩn Đo đường kính vòng vô khuẩn Phƣơng pháp thực kháng sinh đồ (Bauer,1966) 14 Sử dụng tăm vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn nhằm dàn vi khuẩn lên bề mặt môi trường MHA, trước ép tăm vào thành ống nghiệm để tăm không ướt Để khô bề mặt thạch, dùng kẹp vô trùng gắp đĩa kháng sinh đặt bề mặt thạch Sau đó, đem ủ ấm 37oC 24 đọc kết Kết kháng sinh đồ so sánh với bảng tiêu chuẩn CLSI (2012) phân biệt thành mức độ nhạy cảm (susceptible-viết tắt S), trung gian (intermediate-viết tắt I) đề kháng (resistant-viết tắt R) Bảng 3.3: Đường kính vòng vô khuẩn kháng sinh khảo sát (CLSI, 2012) Kháng sinh Hàm lượng (µg) Nhạy Nhạy gian Ampicillin 10 ≥17 14-16 ≤13 Ceftazidime 30 ≥21 18-20 ≤17 Colistin 10 ≥17 12-16 ≤11 Gentamicin 10 ≥15 13-14 ≤12 Norfloxacin 10 ≥17 13-16 ≤12 Tetracycline 30 ≥15 12-14 ≤11 ≥16 11-15 ≤10 Bactrim 1,25/23,75 trung Kháng Phƣơng pháp xác định gene kháng kháng sinh chủng ETEC gây tiêu chảy heo phân lập đƣợc Gene kháng kháng sinh chủng vi khuẩn E coli xác định phương pháp PCR Trình tự nucleotide cặp mồi chu trình nhiệt phản ứng PCR trình bày Bảng 3.3 Phương pháp xác định gene kháng kháng sinh gây tiêu chảy heo thực theo bước sau: Bước 1: Tách chiết DNA vi khuẩn phương pháp nhiệt (Costa et al., 2010) Các chủng ETEC đề kháng kháng sinh nuôi cấy môi trường NA 37oC/24 giờ, sau thu lấy vừa đủ sinh khối vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa 500 µl 15 nước cất khử ion, trộn tạo huyễn dịch vi khuẩn Mẫu đun sôi 100 oC 10 phút, ly tâm 10.000 vòng Thu lấy phần dịch DNA chủng vi khuẩn sang eppendorf trữ nhiệt độ -20oC Bảng 3.6 Trình tự nucleotide cặp mồi xác định gene kháng kháng sinh chủng ETEC sử dụng phản ứng PCR Gene kháng kháng sinh Trình tự nucleotide mồi (5'3') Độdài (bp) Nguồn tham khảo 857 Maynard (2003) 888 Harel (1991) GAGTATTCAACATTTTCGT blaTEM ACCAATGCTTAATCAGTGA GTGAAACCCAACATACCCC tetA GAAGGCAAGCAGGATGTAG Bước 2: Thực phản ứng PCR khuếch đại gene kháng kháng sinh Dùng micropipette hút nước cất khử ion, master mix, primer cần thực theo thể tích cần phân tích, cho tất vào eppendorf đem ly tâm nhẹ để tất thành phần trộn Sau cho thêm DNA mẫu cần kiểm tra diện gene đề kháng Cuối cùng, đặt PCR tip vào máy PCR, cài đặt chương trình nhiệt khuếch đại đoạn gene cần thực Bước 3: Chạy điện di sản phẩm PCR xác định diện gene kháng kháng sinh Mẫu đối chứng dương: chứa chủng vi khuẩn với gene biết Mẫu đối chứng âm: không chứa mẫu DNA Tất mẫu thực phải thực nhiệt độ lạnh Điện di agarose: 16 Gel agarose 1,5% dung dịch đệm TAE 1X 100ml, lắc đun hòa tan Sau để nguội khoảng 50-65oC đổ gel vào khuôn cài lược (comb) đặt mặt phẳng Khuôn gel đặc lại đặt vào bể điện di, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel Cách thực hiện: Dùng micropipette hút 10 µl sản phẩm PCR µl dung dịch đệm, µl thang chuẩn cho vào giếng thạch Khởi động máy điện di: Bật công tắc, dòng điện bể chạy từ cực (-) sang cực (+) với hiệu điện 50V Đọc kết điện di: đoạn DNA dịch chuyển hướng tạo thành vạch (band) DNA khác phân bố vị trí khác tương ứng với kích thước chúng Sản phẩm dương tính nhận diện qua kích thước tương ứng agarose nhuộm ethidium bromide (EtBr) Nhuộm gel dung dịch EtBr khoảng 30 phút, sau rửa nước cất 15 phút Đọc kết máy minitransilluminator (Jircas, Nhật) Mẫu dương tính vạch (band) máy blaTEM 500 bp blaTEM 857 bp Sản phẩm PCR gene blaTEM sau trình điện di (M: DNA marker Ne: đối chứng âm blaTEM, PC: đối chứng dương blaTEM blaTEM (+): giếng 1,4,5 (chủng K88); Giếng (chủng K99); Giếng (chủng 987P) 17 Phƣơng pháp xác định độc lực chủng E coli phân lập đƣợc chuột bạch Chuẩn bị: Chuồng nuôi chuột thiết kế để dễ dàng theo dõi, chuồng nuôi chuột, vỏ trấu lót chuột sát trùng cẩn thận Nước uống cho chuột autoclave để tiệt trùng, nguồn thức ăn cho chuột cung cấp từ nguồn sạch, chất lượng Phương pháp chuẩn bị canh khuẩn để tiêm truyền: mô tả theo Picard et al., (1999): Vi khuẩn nuôi cấy môi trường TSA 37OC 24 sau chuyển qua môi trường TSB (pH: 7,3) để nuôi tăng sinh giờ, trình nuôi cấy có lắc kích thích tăng sinh vi khuẩn Lấy ml dung dịch đem ly tâm 2,500 vòng/phút 10 phút, hút bỏ phần dung dịch bên trên, phần lắng đáy rửa lần với dung dịch Ringer’s Solution Phần vi khuẩn lắng đáy pha loãng với dung dịch Ringer’s Solution đến đạt nồng độ 109 CFU/ml (MacFarland 0,5) Dung dịch sử dụng làm canh khuẩn để tiêm truyền cho chuột bạch Phương pháp tiêm truyền theo dõi kết Tiêm truyền: Chuột bạch nuôi thích nghi vòng 72 giờ, trước tiêm truyền, chuột bạch đo thân nhiệt, nhịp tim, nhịp thở để kiểm tra tiêu sinh lý bình thường chuột bạch Vị trí tiêm truyền: Tiêm canh khuẩn vào xoang bụng chuột bạch Với liều lượng 0,2 ml/chuột hay tùy nhóm định Theo dõi kết quả: Cho chuột ăn uống bình thường theo dõi biểu triệu chứng, thân nhiệt chuột sau tiêm vòng sau tiêm, 18 giờ, 24 giờ, ngày, ngày thứ 3-5 (Picard et al., 1999) Những chuột chết, mổ khám quan sát quan có bệnh tích điển mắc bệnh tự nhiên Lấy máu tim, gan, lách, thận để nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn Nếu cho kết dương tính sở để đánh giá độc lực kiểm tra (Picard et al., 1999) Kết khảo sát Các chuột chết mổ khám có bệnh tích điển hình: bụng chướng, gan sưng, tụ huyết, ruột xuất huyết Gan/ thận, lách hay máu tim nuôi cấy môi trường MC phân lập lại vi khuẩn E coli 18 Phân chuột sệt màu xám Phân chuột lỏng màu vàng Phân chuột lỏng màu vàng Bụng phình to Gan sƣng, tụ huyết 19 Phổi sƣng, xuất huyết; lách tụ huyết; dày ruột chứa đầy A field trip for sampling and classification of toxins in foods, environments and animals 20 [...]... (comb) và đặt trên mặt phẳng Khuôn gel khi đặc lại sẽ được đặt vào bể điện di, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel Cách thực hiện: Dùng micropipette hút 10 µl mỗi sản phẩm PCR và 1 µl dung dịch đệm, 6 µl thang chuẩn cho vào từng giếng thạch Khởi động máy điện di: Bật công tắc, dòng điện trong bể sẽ chạy từ cực (-) sang cực (+) với hiệu điện thế 50V Đọc kết quả điện di: các đoạn DNA dịch chuyển về một hướng. .. STb, EAST1, eae 4 Tiêm truyền cho động vật thí nghiệm là chuột bạch theo quy trình hướng dẫn của GVHD của PTN 5 Theo dõi ghi nhân kết quả - Mổ khám hay lấy mẫu phân tiêu chảy nếu chuột không chết đem nuôi cấy phân lập 6 Phân lập -Xác định Vk E coli Bảng 4: Trình tự nucleotide và chu trình nhiệt các primer đƣợc sử dụng để xác định các gene độc lực của E coli ETEC Độc tố STa (estA) STb (estB) Size (bp)... cần thực hiện Bước 3: Chạy điện di sản phẩm PCR và xác định sự hiện diện của gene kháng kháng sinh Mẫu đối chứng dương: chứa chủng vi khuẩn với gene đã biết Mẫu đối chứng âm: không chứa mẫu DNA Tất cả những mẫu thực hiện đều phải được thực hiện trong nhiệt độ lạnh Điện di agarose: 16 Gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X 100ml, lắc đều và đun hòa tan Sau đó để nguội khoảng 50-65oC đổ gel vào... lực trên Trình tự nucleotide và chu trình nhiệt của các đoạn primer xác định các gene độc lực Sta, STb của vi khuẩn E coli được trình bày qua Bảng 2 3 Điện di và nhuộm sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose 1,5%: cân 1,5 g thạch cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch Để thạch nguội khoảng 70oC rồi đổ khuôn tạo bản gel Sau khi gel đã đông đặc, đặt bản gel vào máy điện di có dung dịch... GAAGGCAAGCAGGATGTAG Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các gene kháng kháng sinh Dùng micropipette hút lần lượt nước cất khử ion, master mix, primer cần thực hiện theo thể tích cần phân tích, cho tất cả vào eppendorf rồi đem ly tâm nhẹ để tất cả các thành phần được trộn đều Sau đó cho thêm DNA mẫu cần kiểm tra sự hiện diện của gene đề kháng Cuối cùng, đặt những PCR tip vào máy PCR, cài đặt chương... sản phẩm PCR vào các giếng thạch Chạy điện di các sản phẩm PCR ở hiệu điện thế 100v trong vòng 60 phút Sau khi kết thúc điện di, nhuộm bản gel bằng dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml) trong 30 phút rồi rữa bằng nước cất trong 15 phút Sau đó, quan sát và chụp ảnh gel đã nhuộm dưới tia UV Xem xét sự hiện diện của các vạch gene trên ảnh chụp của bản gel để xác định sự hiện diện gene mã hóa các độc lực...QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR XÁC ĐỊNH GENE ĐỘC LỰC (ST: STa, STb) CỦA VI KHUẨN E coli trong nhóm ETEC 1 Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn Vi khuẩn E coli ETEC sau khi được định danh bằng phản ứng huyết thanh học được nuôi cấy trên môi trường TSA để tiến hành ly trích DNA Sau khi tăng sinh vi khuẩn trên TSA ở 37oC, 24 giờ, thu sinh khối cho vào eppendorf chứa 1 ml nước tinh... hóa các thành phần này như bảng 1 Bảng 3: Thành phần hỗn hợp cho một phản ứng PCR (Promega, USA) Hóa chất Master mix 2X Thể tích (µl) 12,5 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 DNA template 2,0 Nước tinh khiết 9,5 Tổng thể tích 25 Đối với mẫu đối chứng âm, thay thế DNA template bằng nước cất vô trùng; đối với mẫu đối chứng dương: sử dụng DNA template của vi khuẩn E coli đã xác định dương tính với các gene độc lực... rồi đun sôi cách thủy ở 100oC trong 10 phút Tiến hành ly tâm huyễn dịch trong eppendorf sau khi đun cách thủy với vận tốc 10.000 vòng trong 15 phút Sau khi ly tâm, thu lấy dịch trong bên trên phần cặn lắng, đây chính là DNA template cho quá trình PCR Trữ DNA template ở -20oC 2 Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR Để xác định gene mã hóa các độc lực STa, STb của vi khuẩn E coli , kỹ thuật PCR... kháng sinh Que tăm bông Môi trường MHA Ủ 37oC/24h Canh khuẩn Bảng tiêu chuẩn Đo đường kính vòng vô khuẩn Phƣơng pháp thực hiện kháng sinh đồ (Bauer,1966) 14 Sử dụng tăm bông vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn nhằm dàn đều vi khuẩn lên bề mặt môi trường MHA, trước đó ép tăm bông vào thành ống nghiệm để tăm bông không quá ướt Để khô bề mặt thạch, dùng kẹp vô trùng gắp đĩa kháng sinh đặt trên bề mặt ...THỰC HÀNH ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM Unit Bài Detection of the borax residues in fresh meat and animal products Xác định diện hàn the thịt sản phẩm thịt Trang thiết... bệnh + Xác định gene độc lực + Khi phát VK E coli mẫu bệnh có độc lực, muốn biết xác độc tố gây bệnh làm chết vật tiến hành thí nghiệm động vật thí nghiệm +Tiêm độc tố vào động vật thí nghiện cảm... tiêm thử nghiệm làm động vật thí nghiệm bệnh chết, cách tiến hành mẫu bệnh phẩm phân tích - Thực hành bệnh tiêu chảy heo/trên gà bệnh ETEChay (hay bệnh nhóm thực tập thực đƣợc thực tập cho kết đủ