24 A (BS-3), irigenin (BS-4), irilin D (BS-7), tectoridin (BS-9) tectorigenin 4’-O-β-Dglucoside (BS-10); hợp chất flavonoid rhamnocitrin (BS-6), kaempferol-3-O-β-Dglucopyranoside (BS-11) isoquercetin (BS-12); hợp chất khác acetovanillone (BS-5), daucosterol (BS-8), 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol (BS-13), axit myristic (BS14) Trong số đó, hợp chất là: acetovanillone (BS-5), kaempferol-3-O-β-Dglucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12) axit myristic (BS-14) hợp chất lần đầu phân lập từ loài Hai hợp chất tectorigenin tectoridin thành phần thân rễ thực vật Về nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.1 Kết sàng lọc hoạt tính kháng viêm dịch chiết cho thấy có cặn chiết ethyl acetat (EB-Et) củ sâm đại hành, cặn chiết ethyl acetat (BS-Et) cặn nước (BSW) thân rễ xạ can có hoạt tính kháng viêm theo đường uống với mức độ ức chế khối viêm tương ứng 52,12%, 70%, 64,26% Tất cặn chiết củ sâm đại hành thân rễ xạ can hoạt tính thử nghiệm theo đường bôi 2.2 Lần nghiên nghiên cứu tác dụng ức chế sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh tuỷ xương kích thích LPS 14 hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Kết cho thấy có hợp chất: (2S) dihydroeleutherinol-8-Oβ-D-glucopyranoside (EB-1), hongconin (EB-4), eleutherine (EB-5), isoeleutherin (EB-6) có hoạt tính tốt ức chế sản sinh cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ 0,1±0,08→5±0,4 µM) IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µ M) từ tế bào tua (DCs) sinh từ tủy xương Kết cho thấy sử dụng hợp chất chất kháng viêm tiềm tương lai 2.3 Đã đánh giá hoạt tính kháng viêm độ an toàn tectorigenin hoạt chất phân lập từ thân rễ xạ can - Tác dụng kháng viêm, giảm đau: Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt liều 100 mg/kg cân nặng chuột nhắt Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tác dụng chống viêm cấp viêm mạn - Độc tính cấp tính tectorigenin xác định với giá trị LD50 (1,78 ± 0,13) g/kg P - Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với liều thử 100 mg/kg cân nặng 300 mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng đến cân nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu chức gan, thận so với lô chứng KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thành phần hoá học cặn chiết n-hexane hai loài xạ can sâm đại hành Nghiên cứu hợp chất EB-1 (hợp chất kháng viêm tiềm năng) số hợp chất khác để tạo sản phẩm I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Việt Nam nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú đa dạng, với khoảng 14.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, có khoảng gần 4.000 loài sử dụng làm thuốc chữa bệnh y học cổ truyền Nước ta có y học cổ truyền đa dạng đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, y học dân tộc không ngừng phát triển qua thời kỳ Nhiều thuốc, vị thuốc có tác dụng tốt lâm sàng chưa nghiên cứu sâu thành phần hóa học, tác dụng dược lý độc tính Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế xã hội lớn nước ta Trong chương trình sàng lọc thuốc có hoạt tính kháng viêm từ nguồn dược liệu Việt Nam, phát thấy thuốc họ La dơn có hoạt tính kháng viêm tốt Ngoài ra, chúng có số hoạt tính khác như: kháng nấm, kháng khuẩn, độc tế bào, chống oxy hoá Trong đó, đáng ý hai loài Belamcanda chinensis (L.) DC (xạ can) Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb (sâm đại hành) Đây hai thuốc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học Việt Nam giới Trong y học dân gian, xạ can thường sử dụng để chữa viêm họng, viêm amidan, đau cổ, ho khó thở nhiều đờm, chữa sốt, tắc tia sữa… Còn sâm đại hành thường dùng để trị thiếu máu, vàng da, hoa mắt, nhức đầu, mệt mỏi, ho máu, cầm máu, ho, ho lao… Vì đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La dơn (Iridaceae))” với mục tiêu làm sáng tỏ thành phần hoá học hoạt tính sinh học (đặc biệt hoạt tính kháng viêm), nhằm nâng cao giá trị sử dụng khai thác có hiệu nguồn hoạt chất quý giá từ hai thuốc dân gian Đối tượng nghiên cứu nội dung luận án Đối tượng nghiên cứu luận án củ sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) thân rễ xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) Nội dung luận án là: Điều chế đánh giá hoạt tính kháng viêm cặn chiết củ sâm đại hành thân rễ xạ can Chiết tách phân lập hợp chất từ loài thực vật Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính kháng viêm số hợp chất phân lập Những đóng góp luận án 3.1 Từ củ sâm đại hành phân lập xác định cấu trúc hoá học 14 hợp chất là: (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2), eleutherinoside A (EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-6), eleuthoside C (EB-7), eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9), (R)-7-acetyl3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11), eleuthoside B (EB12), eleutherinoside D (EB-13) 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) từ củ sâm đại hành Trong đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) 23 hợp chất hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu phân lập từ loài 3.2 Từ thân rễ xạ can phân lập xác định cấu trúc hoá học 14 hợp chất là: irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin A (BS-3), irigenin (BS-4), acetovanillone (BS-5), rhamnocitrin (BS-6), irilin D (BS-7), daucosterol (BS-8), tectoridin (BS-9), tectorigenin 4’-O-β-D-glucoside (BS-10), kaempferol-3-O-β-Dglucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12), 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol (BS-13) axit myristic (BS-14) Trong hợp chất: acetovanillone (BS-5), kaempferol-3-O-βD-glucopyranoside (BS-11), isoquercetin (BS-12) axit myristic (BS-14) lần đầu phân lập từ xạ can 3.3 Đã xác định cặn chiết ethyl axetat (BS-Et), cặn nước (BS-W) thân rễ xạ can cặn ethyl axetat (EB-Et) củ sâm đại hành có hoạt tính kháng viêm theo đường uống với phần trăm ức chế khối viêm tương ứng 52,12%, 70%, 64,26% 3.4 Là công trình nghiên cứu tác dụng ức chế sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh từ tuỷ xương bị kích thích LPS 14 hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Hợp chất EB-1 hợp chất EB-4, EB-5 EB-6 ức chế tốt sản sinh cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ 0,1±0,08→5±0,4 µg/mL) IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µg/mL) Gợi ý cho thấy sử dụng hợp chất chất kháng viêm tiềm tương lai 3.5 Đã đánh giá tác dụng kháng viêm, giảm đau độ an toàn hợp chất tectorigienin phân lập từ thân rễ xạ can - Tác dụng kháng viêm, giảm đau: Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt liều 100 mg/kg cân nặng chuột nhắt Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tác dụng chống viêm cấp viêm mạn - Độc tính cấp tính tectorigenin xác định với giá trị LD50 (1,78±0,13) g/kg P - Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với liều thử 100 mg/kg cân nặng 300 mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng đến cân nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu chức gan, thận mô bệnh học so với lô chứng Bố cục luận án Luận án gồm 148 trang với 27 bảng số liệu, 125 hình, 159 tài liệu tham khảo 62 phụ lục Bố cục luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (30 trang), Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (5 trang), Chương 3: Thực nghiệm (26 trang), Chương 4: Kết thảo luận (82 trang), Kết luận (2 trang), Các công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (17 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN Mở đầu: đề cập đến tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, tính thời sự, mục tiêu nhiệm vụ luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN Trên sở nghiên cứu tài liệu, chương đề cập đến tình hình nghiên cứu hoá học hoạt tính sinh học loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) loài xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.), khái niệm viêm số hợp chất phenolic thực vật có hoạt tính kháng viêm Protein N14 46,29±0,98 46,13±0,96 47,36 ± 1,11 > 0,05 toàn phần N28 43,89±2,27 44,98±1,54 44,49±2,61 > 0,05 (g/L) p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg tectorigenin/kgP + Kết bảng 4.24 cho thấy: ba thời điểm nghiên cứu, không thấy có khác biệt thông số AST, ALT cholesterol toàn phần protein toàn phần lô chuột thực nghiệm (p>0,05) + Kết quan sát đại thể mô bệnh học gan chuột sau 28 ngày uống thuốc sau: lô thuốc thử lô chứng mặt gan nhẵn, mật độ bình thường, màu đỏ, sung huyết, dấu hiệu tổn thương - Đánh giá chức thận Kết định lượng creatinin lô chuột thí nghiệm trình bày bảng 4.25 Bảng 4.25 Ảnh hưởng tectorigienin đến thông số creatinin huyết chuột thực nghiệm Chỉ số Thời điểm Lô chứng Lô thử Lô thử p nghiên cứu nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) Creatinin (µmol/L) N14 399,94±10,26 368,26 ± 15,41 354,65±29,44 > 0,05 N28 417,54±12,38 419,83 ± 5,46 431,98±7,45 > 0,05 p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg tectorigenin/kgP Kết bảng 4.25 cho thấy: sau tuần tuần uống thuốc liên tục, hàm lượng creatinin máu chuột thay đổi khác biệt so với lô chứng (p>0,05) Quan sát đại thể mô bệnh học thận chuột sau 28 ngày uống thuốc cho thấy thận mức bình thường, mật độ bình thường, màu đỏ thẫm, mặt nhẵn, màu đỏ, không thấy đám sung huyết đám tổn thương Kết nghiên cứu cho thấy số creatinin khác biệt so với lô chứng, chứng tỏ tectorigienin không ảnh hưởng đến chức lọc cầu thận Kết phù hợp với hình ảnh cấu trúc vi thể thận KẾT LUẬN Về thành phần hoá học 1.1 Từ củ sâm đại hành phân lập xác định cấu trúc 14 hợp chất là: (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2), eleutherinoside A(EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-6), eleuthoside C (EB-7), Eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9), (R)-7acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11), eleuthoside B (EB-12), eleutherinoside D (EB-13), 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) Trong số đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1) hợp chất hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone (EB-14) lần đầu phân lập từ loài 1.2 Từ thân rễ loài xạ can phân lập xác định cấu trúc 14 hợp chất gồm: hợp chất isoflavonoid irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2), iristectorigenin 22 Chuột lô thí nghiệm tăng cân rõ rệt sau tuần tuần uống thuốc (ptr/s 0,05) - Ảnh hưởng lên chức tạo máu Kết định lượng thông số huyết học: số lượng hồng cầu (HC), nồng độ hemoglobin (Hb), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lượng tiểu cầu (PLT) số lượng bạch cầu (BC), thời điểm sau cho uống thuốc 14 ngày (N14) sau uống thuốc 28 ngày (N28) trình bày bảng 4.23 Bảng 4.23 Ảnh hưởng tectorigienin thông số huyết học chuột thực nghiệm Chỉ số nghiên Thời điểm Lô chứng Lô thử Lô thử p cứu nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) N14 8,16 ± 0,21 7,92 ± 0,33 6,87 ± 0,57 > 0,05 HC (1012/L) N28 7,99 ± 0,27 8,38 ± 0,22 8,51 ± 0,21 > 0,05 N14 13,35 ± 0,36 12,14 ± 0,49 11,34 ± 1,00 > 0,05 Hb (g/100mL) N28 13,34 ± 0,31 12,56 ± 0,43 13,17 ± 0,39 > 0,05 N14 37,59 ± 1,11 35,57 ± 1,49 32,72 ± 2,16 > 0,05 HCT (%) N28 37,89 ± 1,29 37,20 ± 1,13 38,28 ± 0,88 > 0,05 N14 716,56± 31,88 721,00±40,46 694,60±47,05 > 0,05 PLT N28 812,20± 38,41 792,90±35,59 793,78± 33,35 > 0,05 N14 1,95 ± 0,20 1,80 ± 0,15 1,64 ± 0,21 > 0,05 BC (109/L) N28 1,58 ± 0,19 1,99 ± 0,22 1,48 ± 0,11 > 0,05 Tại thời điểm nghiên cứu, không thấy có biến đổi số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu số lượng bạch cầu lô thực nghiệm (p > 0,05) - Đánh giá chức gan Kết định lượng thông số AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin amino transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần thời điểm N14, N28 trình bày bảng 4.24 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thực vật: củ sâm đại hành thu Chí Linh, Hải Dương vào tháng năm 2011 thân rễ xạ can thu vào tháng đến tháng năm 2010 Lạng Sơn 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký cột (CC) pha thường pha đảo 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất: kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại như: phổ khối lượng, phổ khối phân giải cao, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D NMR 2.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo cặn chiết: - Theo đường bôi: theo phương pháp Mrudula Kale (2007), Jaijoy K (2010) - Theo đường uống: theo phương pháp Miklos Gabor (2009) Nghiên cứu tác dụng ức chế sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC (dendritic cells) sinh tuỷ xương kích thích LPS (lipopolysaccharide) hợp chất phân lập từ sâm đại hành: tiến hành Viện CN sinh học Hàn Quốc, hợp chất thử nghiệm nồng độ 50,0; 25,0; 12,5 6,3 µM, dịch huyền phù thu hoạch sau 16 kích thích, phát nồng độ murine IL-12p40, IL6 TNF-α máy ELISA Nghiên cứu tác dụng dược lí in vivo độ an toàn tectorigenin phân lập từ thân rễ xạ can - Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau tectorigenin thực môn Dược lí, trường đại học Dược Hà Nội theo phương pháp chuẩn thường qui - Nghiên cứu độ an toàn tectorigienin tiến hành môn Dược lí, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương: độc tính cấp, độc tính bán trường diễn đánh giá theo phương pháp OECD CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Chương mô tả chi tiết trình chiết, phân lập hợp chất đánh giá hoạt tính kháng viêm số hợp chất phân lập Quy trình phân lập hợp chất từ củ sâm đại hành Cặn EB/Et Bảng 4.24 Ảnh hưởng tectorigienin đến thông số AST, ALT, cholesterol toàn phần protein toàn phần Thời điểm Lô chứng Lô thử Lô thử Chỉ số (n = 10) (n = 10) (n = 10) nghiên cứu nghiên cứu ALT (U/L) SKC, SiO2, gradient HX:Aceton (40:1 -1:1) p N14 176,28±9,38 156,75±7,11 155,13±7,54 > 0,05 N28 194,58±17,27 173,91±18,61 209,41±22,02 > 0,05 AST (U/L) N14 59,68 ± 4,79 64,74±3,15 64,80±5,93 > 0,05 N28 75,04 ±3,99 82,66±5,48 74,09±7,90 > 0,05 Cholesterol toàn phần (mmol/L) N14 1,88±0,10 2,06±0,11 2,05 ± 0,12 > 0,05 N28 2,04±0,14 1,79±0,13 1,76 ± 0,10 > 0,05 EB-A EB-B EB-C EB-D SKC, SiO2 HX:Aceton (5:1) SKC, SiO2 CHCl3:Aceton 10:1) EB-B1 EB-14 (10mg) EB-B2 SKC, YMC RP-18, MeOH:H2O (6:1) EB-2 (12mg) EB-10 (8mg) EB-B3 EB-B4 SKC, YMC RP-18 MeOH:H2O (3:1) EB-4 (5mg) EB-5 (9mg) EB-6 (15mg) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết etyl axetat củ sâm đại hành 21 Cặn EB-W SKC, Dianion HP-20P, MeOH (0%, 25%, 50%, 75%, 100%) EB-E EB-F EB-G EB-H EB-K SKC, SiO CHCl3:MeOH:H 2O (5:1:0,15) EB-G1 EB-G2 SKC, YMC RP-18 Aceton:H2O (1:2) EB-7 (12mg) EB-8 (15mg) SKC, LH-20 MeOH EB-G3 EB-1 (5mg) SKC, YMC RP-18 MeOH:H2O (1:1) EB-3 (9mg) EB-11 (19mg) EB-12 (9mg) EB-13 (14mg) EB-9 (8mg) Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn nước củ sâm đại hành Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Hợp chất EB-1 (1) 25 Chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –58,1 (MeOH, c = 0,3); ESI-MS m/z 419 [M‒H]–; HR-ESI-MS m/z 455,1126 [M+Cl]– (C21H24O9Cl, 455,1114), m/z 419,1338 [M‒H]– (C21H23O9, 419,1348), m/z 257,0818 [M‒Glc]– (C15H13O4, 257,0819) H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,87 (1H, ddq, J=4,0; 6,1; 12,0, H-2); 2,57 (1H, dd, J=4,0; 16,8, Hb-3); 2,62 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,85 (1H, s, H-6); 6,67 (1H, s, H-7); 6,45 (1H, s, H-9); 1,46 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,45 (1H, s, 5-Me); 4,93 (1H, d, J=7,2, H-1′); 3,40 (1H, H-2′); 3,47 (1H, H-3′); 3,31 (1H, d, J=8,5, H-4′); 3,42 (1H, H5′); 3,62 (1H, dd, J=5,6; 12,2, Hb-6′); 3,83 (1H, dd, J=2,2; 12,2, Ha-6′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3 OD) δ (ppm): 163,4 (C-1); 78,0 (C-2); 45,9 (C-3); 194,3 (C-4); 114,6 (C-4a); 137,6 (C-5); 124,2 (C-6); 141,4 (C-6a); 103,6 (C-7); 161,4 (C-8); 103,5 (C-9); 158,7 (C-10); 109,9 (C-10a); 20,7 (2-Me); 23,3 (5-Me); 101,7 (C-1′); 74,8 (C-2′); 78,0 (C-3′); 71,4 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,5 (C-6′) Thuỷ phân hợp chất EB-1 Hoà tan hợp chất EB-1 dung dịch HCl 0,1 N (dioxane/H2O, 1:1, v/v, 1,0 ml) đun cách thuỷ 800C 3h Sau đó, dung dịch axit trung hoà Ag2CO3, dung môi loại bỏ triệt để khí N2, sau chiết với CHCl3 lớp CHCl3 lớp nước Lớp CHCl3 đem tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi CHCl3MeOH (8:1, v/v) thu hợp chất EB-1a Lớp nước làm khô kiệt khí N2, phần cặn hoà tan 0,1 ml pyridine khô thêm vào este L-cysteine methyl hydrochloride pyridin (0,06 M, 0,1 mL) Hỗn hợp phản ứng gia nhiệt đến 600C bổ sung thêm 0,1 ml dung dịch trimethylsilylimidazole tiếp tục gia nhiệt đến 600C 1,5 Sản phẩm sau làm khô phân bố với n-hexan (0,1 ml) H2O (0,1 ml), lớp n-hexan phân tích sắc ký khí GC (cột SPB-1 (0,25 mm×30 m), detector FID, nhiệt độ cột 2100C, nhiệt độ tiêm 2700C, nhiệt độ detector 3000C, khí mang He (2,0 ml/phút)) Thời gian lưu peak phát 14,11 phút Với điều kiện peak Lô thử uống 313,48±40,52 56,49±5,01 tectorigienin liều p3/10,05 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy lô x so với lô y Từ bảng 4.20 ta thấy tectorigienin thể rõ tác dụng chống viêm mạn cân khối lượng u hạt lúc ướt lúc khô Tỷ lệ ức chế u hạt tectorigienin tương đối cao, cân ướt 35,67%, cân khô 43,54% Tác dụng chống viêm tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng tương đương với tác dụng chống viêm prednisolon liều mg/kg cân nặng b Nghiên cứu tính an toàn tectorigienin * Độc tính cấp Đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp tectorigenin mức liều khác Số lượng chuột chết lô thử cụ thể trình bày bảng 4.21 Bảng 4.21 Kết theo dõi động vật thí nghiệm Mức Liều thử Số chuột chết/ Số chuột chết/ % chết liều (g mẫu thử/kg chuột) sống thực tế sống kỳ vọng 1,0 0/10 0/21 0,00 1,5 4/6 4/11 26,67 2,0 7/3 11/5 68,75 2,5 8/2 19/2 90,48 3,0 10/0 29/0 100,00 Từ kết theo công thức tính Behrens xác định độc tính cấp tectorigienin với giá trị LD50 = (1,78 ± 0,13) gam/kg chuột * Độc tính bán trường diễn - Về tình trạng chung: Trong thời gian thử nghiệm, chuột lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống bình thường, phân khô, nước tiểu bình thường Không thấy biểu đặc biệt lô chuột suốt thời gian nghiên cứu Tiến hành cân chuột trước, lúc kết thúc thí nghiệm Mức độ tăng cân chuột so với trước uống thuốc thời điểm nghiên cứu sau: Bảng 4.22 Ảnh hưởng tectorigienin đến mức độ tăng cân chuột (%) Thời điểm Lô chứng Lô thử Lô thử p nghiên cứu (n = 10) (n = 10) (n = 10) 25,94±0,29 25,98 ± 0,63 >0,05 N0 24,00 ± 0,53 ptr/s < 0,01 ptr/s < 0,01 28,75 ± 0,64 28,38±0,51 N14 26,40 ± 0,52 >0,05 ptr/s < 0,01 ptr/s < 0,01 31,24±0,68 33,76 ± 0,97 >0,05 N28 27,96 ± 0,79 ptr/s < 0,01 ptr/s < 0,01 p: so với lô chứng ptr/s: so với thời điểm N0 Ghi chú: N0: lúc bắt đầu dùng thuốc; N14: thời gian dùng thuốc sau 14 ngày; N28: thời gian dùng thuốc sau 28 ngày 20 Tác dụng chống viêm cấp tectorigienin đánh giá qua tác dụng ức chế khả gây phù bàn chân chuột cống carragenin, với liều thử nghiệm 60 mg tectorigienin/kg cân nặng chuột cống (mức liều tương đương với 100 mg tectorigienin/kgP chuột nhắt) Kết trình bày bảng 4.18 4.19 Bảng 4.18 Tác dụng chống viêm cấp tectorigienin Tỉ lệ phù chân chuột thời điểm nghiên cứu Lô thí nghiệm ∆V1% ∆V3% ∆V4% ∆V5% ∆V7% ∆V24% Lô (Chứng trắng) 12,24±1,67 40,27±2,72 46,62 ± 2,7146,9 ± 1,94 62,4±2,20 20,1± 1,66 NaCMC 1% Lô 4,69 ± 0,80 12,7± 1,19 22,9 ± 1,13 25,3±1,17 34,7±1,91 11,3±1,35 (Chứng+) Indomethacin p2/1 > 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 >0,05 liều 10mg/kgP 1,6 ± 0,85 18,6 ± 2,66 23,5 ± 2,84 19,7±2,62 20,4±2,77 7,6±2,05 Lô tectorigienin liều p3/1 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/1 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 > 0,05 60mg/kgP p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 p3/2 > 0,05 Ghi chú: px/y: so sánh lô x lô y Như vậy, với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin thể tác dụng chống viêm rõ sau 5-7 gây viêm Bảng 4.19 Tỷ lệ % ức chế phù chân chuột tectorigienin so với lô chứng trắng đường chuẩn D-glucose L-glucose có thời gian lưu tương ứng 14,11 14,26 phút Do đó, xác định gốc đường EB-1 D-glucose Hợp chất EB-1a 25 Chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –38,3 (MeOH, c = 0,3); HR-ESI-MS m/z 257,0810 ‒ [M-H] (C15H13O4, 257,0819) H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,88 (1H, H-2); 2,72 (1H, dd, J=3,7; 16,8, Hb3); 2,80 (1H, dd, J=12,0; 16,8, Ha-3); 6,90 (1H, s, H-6); 6,48 (1H, d, J=2,2, H-7); 6,35 (1H, d, J=2,2, H-9); 1,60 (1H, d, J=6,1, 2-Me); 2,59 (1H, s, 5-Me) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,8 (C-1); 77,9 (C-2); 46,0 (C-3); 194,0 (C-4); 113,7 (C-4a); 137,3 (C-5); 123,3 (C-6); 141,7 (C-6a); 102,6 (C-7); 162,0 (C-8); 102,9 (C-9); 158,9 (C-10); 108,3 (C-10a); 20,8 (2-Me); 23,4 (5-Me) Hợp chất EB-2 (2) Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H12O4, ESI-MS m/z 257 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,19 (1H, s, H-6); 6,56 (1H, s, H-7); 6,58 (1H, s, H-9); 2,37 (1H, s, 2-Me); 2,71 (1H, s, 5-Me); 10,05 (1H, s, 8-OH); 10,15 (1H, s, 10-OH) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,8 (C-1a), 163,5 (C-2); 112,1 (C-3); 178,6 (C-4); 116,3 (C-4a); 134,4 (C-5); 124,8 (C-6); 138,7 (C-6a); 102,9 (C-7); 156,9 (C-8); 101,2 (C-9); 159,3 (C-10); 107,2 (C-10a); 19,4 (2-Me); 23,0 (5-Me) Hợp chất EB-3 (3) Chất bột màu trắng, mp 175-1760C, C21H22O9, ESI-MS m/z 417 [M-H]¯ H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,27 (1H, s, H-6); 6,89 (1H, d, J=2,1 Hz, H-7); 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9); 2,35 (1H, s, 2-Me); 2,70 (1H, s, 5-Me); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,24 (1H, t, J=7,6 Hz, H-2′); 3,36 (1H, m, H-3′); 3,19 (1H, t, J=8,3 Hz, H-4′); 3,28 (1H, m, H-5′); 3,69 (1H, dd, J=1,2; 11,4 Hz, Ha-6′); 3,49 (1H, dd, J=5,5; 11,4 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,3 (C-1a), 163,7 (C-2); 112,1 (C-3); 178,5 (C-4); 117,1 (C-4a); 134,7 (C-5); 125,5 (C-6); 138,1 (C-6a); 101,5 (C-7); 158,5 (C-8); 103,1 (C-9); 156,5 (C-10); 108,7 (C-10a); 19,5 (2-Me); 23,0 (5-Me); 100,0 (C-1′); 73,2 (C-2′); 77,1 (C-3′); 69,6 (C-4′); 76,7 (C-5′); 60,6 (C-6′) Hợp chất EB-4 (4) Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 175-176oC, C16H16O5, ESI-MS m/z 289 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,49 (1H, q, J=7,0 Hz, H-1); 4,69 (1H, q, J=7,0 Hz, H-3); 8,04 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 7,01 (1H, t, J=8,0 Hz, H-8); 1,64 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-Me); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 3-Me); 4,07 (3H, s, 9-OMe); 12,82 (1H, s, 5-OH) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 69,5 (C-3); 202,9 (C-4); 153,4 (C5); 118,1 (C-6); 125,4 (C-7); 109,1 (C-8); 155,7 (C-9); 139,4 (C-10); 121,0 (C-11); 107,8 (C-12); 126,0 (C-13); 119,6 (C-14); 17,4 (CH3-1); 16,3 (CH3-3); 56,4 (OCH3-9) Hợp chất EB-5 (5) Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 175-1770C, C16H16O4, ESI-MS m/z 273 [M+H]+ Lô giờ giờ 24 Lô chứng dương uống 61,69 68,39 50,86 46,31 44,32 43,89 indomethacin liều 10mg/kg Lô thử tectorigienin liều 86,93 53,77 49,58 58,04 67,32 62,27 60mg/kg Từ bảng 4.19 cho thấy tỷ lệ ức chế phù chân chuột tectorigienin liều 60mg/kg cân nặng cao tương đương với tỷ lệ ức chế phù chân chuột indomethacin liều 10 mg/kg cân nặng Tỷ lệ ức chế cao thời điểm sau gây viêm 86,93% Thậm chí, tỷ lệ ức chế phù chân chuột tectorigienin liều 60 mg/kg cân nặng cao tỷ lệ ức chế phù chân chuột indomethacin thời điểm giờ, sau gây viêm * Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn tectorigienin Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn tectorigienin mô hình gây u hạt thực nghiệm amian thể bảng 4.20 Bảng 4.20 Tác dụng chống viêm mạn tectorigienin mô hình gây u hạt thực nghiệm viên amian MTB ướt % ức chế MTB khô % ức chế Lô (mg) cân ướt (mg) cân khô Lô chứng trắng uống 487,33±65,87 100,06±12,92 NaCMC 1% 55,48±5,20 Lô chứng dương uống 280,05±24,43 42,53 44,55 p2/1 0,05 p3/4 > 0,05 5,57 ± 0,49 15,4 ± 0,29 p3/1 > 0,05 p3/4 < 0,05 11,1 ± 0,33 p4/1>0,05 p4/2>0,05 p4/10,05 p2/1 < 0,05 p2/1< 0,05 11,7±0,33 10,3 ± 0,28 7,9 ± 0,36 6,3 ± 0,26 p3/1< 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 < 0,05 p3/1 < 0,05 p3/4 0,05 p3/4 > 0,05 p3/4 > 0,05 7,14±0,54 8,4 ± 0,33 7,14 ± 0,40 6,0 ± 0,28 p4/10,05 p4/10,05 p4/10,05 p4/1 < 0,05 p4/2 > 0,05 7,77 ± 0,32 13,0 ± 0,27 12,1±0,20 10,2±0,25 7,5 ± 0,35 5,5 ± 0,17 Lô tectorigienin liều p5/1 >0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 p5/1 < 0,05 200 mg/kgP p5/4 >0,05 p5/4 > 0,05 p5/4 < 0,05 p5/4 > 0,05 p5/4 > 0,05 p5/4 > 0,05 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy lô x so với lô y Tectorigenin thể tác dụng giảm số đau quặn rõ rệt liều thử Với liều 50 mg/kg cân nặng, tectorigenin bắt đầu thể tác dụng từ giai đoạn thứ trình nghiên cứu (10-15 phút sau gây đau acid acetic) Khi dùng liều 100 mg/kg liều 200 mg/kg cân nặng, tectorigenin có tác dụng giảm đau sau phút sau tiêm acid acetic tác dụng thể rõ thời điểm 30 phút sau gây đau Bảng 4.17 Ảnh hưởng tectorigienin đến tỷ lệ giảm đau lô uống thuốc so với lô không uống thuốc qua giai đoạn Tỷ lệ giảm đau (%) giai đoạn Liều dùng 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 Lô (mg/kg) phút phút phút phút phút phút Lô chứng dương 240 47,50 40,00 46,17 45,56 48,21 39,34 uống aspirin 50 18,00 16,00 35,40 25,24 43,57 44,41 100 44,29 39,22 60,56 38,82 48,98 47,06 200 22,22 29,09 33,13 25,81 46,03 47,06 Tectorigenin có tác dụng giảm đau với tỷ lệ % ức chế số đau cao, cao tectorigenin liều 100mg/kg cân nặng giai đoạn thứ (10-15 phút), tỷ lệ giảm đau lên đến 60,56% Với liều 100mg/kg cân nặng, tectorigenin có khả giảm số đau tốt so với liều 50 mg/kg cân nặng liều 200 mg/kg cân nặng Ở tất giai đoạn với liều này, tectorigenin có tác dụng ức chế tương đương với aspirin liều 240mg/kg cân nặng * Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tectorigienin Lô thử uống tectorigienin 18 Tectorigenin 4’-O-β-Dglucopyranoside (BS-10) Kaempferol-3-O-β-Dglucopyranoside (BS-11) Lần phân lập từ xạ can Isoquercetin (BS-12) Lần phân lập từ xạ can Axit myristic (BS-14) 24E-stigmasta-5,22Lần phân lập từ xạ can dien-3β-ol (BS-13) 4.2.2 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm Hợp chất tectorigenin phân lập từ thân rễ xạ can với hàm lượng tương đối lớn thành phần xạ can Nhằm định hướng tạo sở để phát triển, khai thác sử dụng hợp chất có hiệu quả, tiến hành nghiên cứu sâu tác dụng dược lý (hoạt tính kháng viêm, giảm đau) độ an toàn tectorigenin động vật thực nghiệm 4.2.2.1 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm cặn chiết thân rễ xạ can Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cặn chiết: methanol, hexan, etyl axetat cặn nước mẫu nghiên cứu khả ức chế khối viêm cục theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống cho thấy có mẫu ức chế 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt chất), cặn chiết etyl axetat (BS-Et) cặn chiết nước (BS-W) với % ức chế khối viêm tương ứng 70,0% 64,26% Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính ổn định ức chế 64,59% khối viêm 4.2.2.2 Kết nghiên cứu tác dụng sinh học độ an toàn tectorigenin phân lập từ thân rễ xạ can a Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau tectorigenin * Kết nghiên cứu tác dụng giảm đau tectorigienin Tác dụng giảm đau tectorigenin tiến hành chuột nhắt theo phương pháp gây đau acid acetic Kết trình bày bảng 4.16 4.17 (C-12); 130,3 (C-13); 114,4 (C-14); 19,5 (1-Me); 22,2 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 105,2 (C1′); 75,5 (C-2′); 74,7 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,3 (C-5′); 70,8 (C-6′); 103,8 (C-1ʺ); 74,7 (C2ʺ); 77,3 (C-3ʺ); 71,2 (C-4ʺ); 77,3 (C-5ʺ); 62,4 (C-6ʺ) Hợp chất EB-9 (9) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O15, ESI-MS m/z 615 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,1 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,2 (1H, m, H-3); 4,10 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, H-4); 8,24 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,37 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,98 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,63 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,06 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,07 (1H, s, 9-OMe); 4,07 (1H, H-1′); 3,22 (1H, H-2′); 3,30 (1H, H-3′); 3,25 (1H, H-4′); 3,29 (1H, H-5′); 3,30 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz, Hb-6′); 3,41 (1H, Ha-6′); 3,62 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,11 (1H, H-2ʺ); 3,16 (1H, H-3ʺ); 3,22 (1H, H-4ʺ); 3,29 (1H, m, H5ʺ); 3,30 (1H, dd, J=6,2, 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,33 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) 13 C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,9 (C-1); 67,0 (C-3); 62,6 (C-4); 144,0 (C5); 117,7 (C-6); 127,0 (C-7); 106,2 (C-8); 157,6 (C-9); 148,0 (C-10); 120,8 (C-11); 128,0 (C-12); 130,4 (C-13); 116,2 (C-14); 17,8 (1-Me); 21,0 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 106,2 (C1′); 77,3 (C-2′); 75,0 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,8 (C-5′); 71,8 (C-6′); 104,2 (C-1ʺ); 75,4 (C2ʺ); 77,6 (C-3ʺ); 71,6 (C-4ʺ); 77,7 (C-5ʺ); 62,6 (C-6ʺ) Hợp chất EB-10 (10) Bột vô định hình màu trắng, C13H14O4, ESI-MS m/z 233 [M-H]¯ H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 2,52 (1H, dd, J=8,2; 16,5 Hz; Haq-2); 2,82 (1H, dd, J=3,4; 16,5 Hz, Heq-2); 4,22 (1H, m, H-3); 2,89 (1H, dd, J=7,5; 15,8 Hz, Haq4); 3,14 (1H, dd, J=3,4; 15,8 Hz, Heq-4); 6,60 (1H, s, H-5); 2,40 (3H, s, 8-CH3); 2,42 (3H, s, 7-CH3) 13 C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 199,3 (C-1); 50,0 (C-2); 66,8 (C-3); 40,4 (C4); 114,7 (C-5); 158,8 (C-6); 132,2 (C-7); 140,4 (C-8); 124,9 (C-8a); 147,1 (C-4a); 19,2 (8-CH3); 208,4 (C=O); 32,6 (7-CH3) Hợp chất EB-11 (11) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C20H22O9, ESI-MS m/z 407 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,05 (1H, q, J=6,6 Hz, H-1); 8,16 (1H, s, H4); 7,60 (1H, d, J=8,3 Hz, H-5); 7,47 (1H, t, J=8,3 Hz, H-6); 7,11 (1H, d, J=8,3 Hz, H-7); 1,70 (1H, d, J=6,6, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-Ome); 4,99 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (2H, H-2′, Ha-6′); 3,10 (1H, m, H-3′); 3,39 (1H, t, J=9,3 Hz, H-4′); 3,47 (1H, t, J=9,3 Hz, H5′); 3,68 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Hb-6′) 13 C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 80,9 (C-1); 172,3 (C-3); 124,0 (C-4); 123,7 (C-5); 128,4 (C-6); 109,8 (C-7); 157,4 (C-8); 147,9 (C-9); 140,7 (C-10); 125,9 (C-11); 139,3 (C-12); 124,0 (C-13); 19,4 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,2 (C-1′); 76,0 (C-2′); 77,8 (C-3′); 71,6 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,4 (C-6′) Hợp chất EB-12 (12) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H32O14, ESI-MS m/z 569 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,12 (1H, q, J=6,9, H-1); 8,15 (1H, s, H-4); 7,60 (1H, d, J=7,6 Hz, H-5); 7,46 (1H, t, J=7,6 Hz, H-6); 7,10 (1H, d, J=7,6 Hz, H-7); 1,68 (1H, d, J=6,9 Hz, 1-Me); 3,98 (1H, s, 8-OMe); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-2′); 3,47 (1H, t, J=8,9 Hz, H-3′); 3,56 (1H, H-4′); 2,32 (1H, H5′); 3,67 (1H, dd, J=4,9; 11,0 Hz, Hb-6′); 4,00 (1H, dd, J=2,0; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,16 (1H, 17 d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 3,12 (1H, dd, J=7,6; 8,3 Hz, H-2ʺ); 3,25 (1H, H-3ʺ); 3,21 (1H, t, J=8,2 Hz, H-4ʺ); 3,17 (1H, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=4,1; 11,7 Hz, Hb-6ʺ); 3,81 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Ha-6ʺ) 13 C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 81,1 (C-1); 172,3 (C-3); 124,2 (C-4); 109,8 (C-5); 128,4 (C-6); 123,7 (C-7); 157,5 (C-8); 147,8 (C-9); 140,8 (C-10); 126,0 (C-11); 139,3 (C-12); 124,1 (C-13); 19,2 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,0 (C-1′); 76,2 (C-2′); 77,4 (C-3′); 71,1 (C-4′); 78,0 (C-5′); 69,0 (C-6′); 104,3 (C-1ʺ); 75,1 (C-2ʺ); 76,6 (C-3ʺ); 71,7 (C-4ʺ); 78,0 (C-5ʺ); 62,9 (C-6ʺ) Hợp chất EB-13 (13) Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H34O14, ESI-MS m/z 571 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,33 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 5,03 (1H, d, J=13,1 Hz, Hb-3); 5,40 (1H, q, J=13,1 Hz, Ha-3); 8,03 (1H, d, J=8,2 Hz, H-5); 7,31 (1H, t, J=8,2 Hz, H-6); 6,91 (1H, d, J=8,2 Hz, H-7); 1,45 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-OMe); 4,53 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,30 (2H, H-2′, H-5′); 3,08 (1H, m, H-3′); 3,20 (1H, H-4′); 3,56 (1H, dd, J=6,2, 11,0 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, d, J=11,0 Hz, Ha-6′); 4,11 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 2,94 (1H, m, H-2ʺ); 3,01 (2H, H-3ʺ, H-4ʺ); 3,20 (1H, H-5ʺ); 3,38 (1H, dd, J=4,8; 11,0 Hz, Hb-6ʺ); 3,62 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Ha-6ʺ) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 78,3 (C-1); 70.6 (C-3); 137,6 (C-4); 115,7 (C-5); 125,8 (C-6); 104,6 (C-7); 156,2 (C-8); 143,8 (C-9); 124,8 (C-10); 130,9 (C-11); 130,4 (C-12); 114,9 (C-13); 20,1 (1-Me); 56,2 (8-OMe); 104,6 (C-1′); 73,8 (C-2′); 76,6 (C-3′); 69,9 (C-4′); 75,2 (C-5′); 68,7 (C-6′); 103,2 (C-1ʺ); 73,5 (C-2ʺ); 76,8 (C-3ʺ); 69,9 (C-4ʺ); 76,3 (C-5ʺ); 61,0 (C-6ʺ) Hợp chất EB-14 (14) Chất bột màu trắng, mp.>310oC, C15H10O5, ESI-MS m/z 271 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,61 (3H, s, 8-CH3 ); 6,40 (1H, d, J=2,7 Hz, H-2); 6,94 (1H, d, J=2,7 Hz, H-4); 6,80 (1H, d, J=2,7 Hz, H-7); 7,31 (1H, d, J=2,7 Hz, H-5); 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 166,2 (C-1); 109,3 (C-2); 165,3 (C-3); 108,2 (C-4); 113,3 (C-5); 163,0 (C-6); 125,6 (C-7); 146,6 (C-8); 189,5 (C-9); 184,1 (C-10); 111,6 (C-9a); 135,8 (C-4a); 138,3 (C-10a); 124,3 (C-8a); 24,2 (8-CH3) penta-substituted nhóm methoxyl δ 3,87 (3H, s, OCH3-6) Tín hiệu doublet doublet δ 6,84 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H-3′, 5′) 7,35 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H2′, 6′) dự đoán nhóm vòng thơm para-substitued, Phổ 13C-NMR BS-2 tín hiệu 16 nguyên tử cacbon, gồm nhóm methoxyl 15 cac bon khung isoflavone, tín hiệu xác nhận thêm qua phổ DEPT 90, DEPT 135 HSQC Thêm vào đó, phổ ESI MS pic ion phân tử [M-H]+ BS-2 xuất m/z 299 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C16H12O6 Khi so sánh với tài liệu tham khảo, tất liệu phổ chất BS-2 đồng với liệu phổ 4′,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavone hay tectorigenin chất BS-2 xác định tectorigenin Hình 4.18d Cấu trúc hợp chất BS-2 (Tectorigenin) Bảng 4.13 Bảng tổng hợp hợp chất BS-1→BS-14 phân lập từ thân rễ xạ can Irisflorentin (BS-1) Irigenin (BS-4) Irilin D (BS-7) Tectorigenin (BS-2) Iristectorigenin A (BS-3) Acetovanillone (BS-5) Lần phân lập từ xạ can Rhamnocitrin (BS6-) Daucosterol (BS-8) Tectoridin (BS-9) 16 Kết cho thấy hợp chất EB-1 hợp chất biết khác EB-4, EB-5, EB-6 thể hoạt tính ức chế sản sinh IL-12p40 nồng độ 25 µM Do hợp chất tiếp tục lựa chọn để làm thử nghiệm nồng độ 6,3 đến 50,0 µM SB203580 sử dụng làm đối chứng dương, chất ức chế sản sinh IL12 p40, IL-6 TNF-α với giá trị IC50 tương ứng 5,2±0,1, 3,5±0,1 7,5±0,2 µM (Bảng 4.12) Bảng 4.12 Hoạt tính kháng viêm số hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành tế bào tua sinh từ tủy xương kích thích LPS IC50 IL-12 p40 (µg/mL) IL-6 (µg/mL) TNF-α (µg/mL) Cặn chiết methanol 0,1 ± 0,05 16,2 ± 0,3 >50 SB203580a) 2,5 ± 0,1 1,7 ± 0,2 3,6 ± 0,2 Hợp chất IL-12 p40 (µM) IL-6 (µM) TNF-α (µ M) EB-1 1,0 ± 0,1 5,0 ± 0,2 >50 EB-4 5,0 ± 0,4 8,7 ± 0,3 61,2 ± 1,5 EB-5 0,1 ± 0,08 1,7 ± 0,1 39,6 ± 2,0 EB-6 0,2 ± 0,1 2,6 ± 0,4 >50 SB203580a) 5,2 ± 0,1 3,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 a) đối chứng dương Kết cho thấy hợp chất EB-1, EB-4, EB-5, EB-6 cặn chiết EB-Me ức chế sản sinh IL-12 p40 kích thích LPS với giá trị IC50 từ 0,1±0,08 µM đến 5,0±0,4 µM Các hợp chất EB-1, EB-5 EB-6 ức chế sản sinh IL-6 với giá trị IC50 từ 1,7±0,1 µM đến 5,0±0,2 µM Tuy nhiên, có hai hợp chất EB-4 EB-5 có hoạt tính ức chế mức độ trung bình sản sinh TNF-α với giá trị IC50 tương ứng 61,2±1,5 µM 39,6± 2,0 µM Các hợp chất (–)-hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5) isoeleutherin (EB-6) phân lập từ Eleutherine americana ức chế sản sinh nitric oxide dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264,7 hoạt hóa LPS Đây lần thành phần hóa học hoạt tính kháng viêm E bulbosa công bố Như vậy, hợp chất EB-1 hợp chất biết EB-4, EB-5 EB-6 phân lập từ củ sâm đại hành thể hoạt tính ức chế sản sinh TNF-α, IL-6 IL-12 p40 tế bào DCs kích thích LPS Kết nghiên cứu cho thấy hợp chất sử dụng chất kháng viêm tiềm tương lai 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI XẠ CAN 4.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ thân rễ xạ can Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc 14 hợp chất phân lập từ thân rễ xạ can, có hợp chất BS-5, BS-11, BS-12 BS-14 lần đầu phân lập từ xạ can hợp chất có hàm lượng lớn tectoridin tectorigienin Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất tectorigienin (BS-2): Chất BS-2 phân lập dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm chảy 235-236°C Sự có mặt khung isoflavon phân tử chất BS-2 dự đoán qua phổ hấp thụ tử ngoại UV λmax 259, 320nm Phổ 1H-NMR BS-2 có mặt singlet δ 7,99 (1H, s) proton H-2, tín hiệu singlet khác δ 6,41 (1H, s) dự đoán vòng A Quy trình phân lập hợp chất từ thân rễ xạ can Cặn BS-EtOAc SKC, SiO2, gradient CHCl3:MeOH (99:1 -50:50) F1 F2 F3 F4 F6 F5 SKC, SiO2 SKC, SiO2, HX:EtOAC 10:1 CHCl3:MeOH BS-2 (480 mg) BS-14 (15 mg) F5.1 F3.2 BS-13 (5 mg) F7 SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (20:1) F5.3 F5.2 SKC MeOH:CHCl3 (15:1) F3.3 F3.1 SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (15:1) Kết tinh lại MeOH SKLMĐC RP18 MeOH:H2O (7:3) BS-5 (9 mg) BS-1 (8 mg) BS-4 (8 mg) F5.2.1 BS-3 (20 mg) F7 F6 1.SKC, RP18, MeOH:H2O (1:1) 2.SKLMĐC, RP18, MeOH:H2O (6:4) SKC, RP18 MeOH:H2O (4:6) BS-9 (42 mg) BS-6 (10 mg) F7.1 F7.2 F7.3 BS-7 (5 mg) BS-8 (12 mg) Hình 3.4 Sơ đồ phần lập hợp chất từ cặn chiết etyl axetat xạ can Cặn BS/W (4,7gam) SK cột, CH2Cl2 : MeOH (4:1) E1 E2 E3 SK cột CHCl3: MeOH : H2 O (80:18:2) BS- 11 (12 mg) BS-12 (11 mg) E4 E5 SK cột RP 18 E4.1 E4.2 SKLMĐC RP 18 MeOH: H2O (5:5) BS-10 (7 mg) Hình 3.5 Sơ đồ phần lập hợp chất từ cặn nước xạ can Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ xạ can Hợp chất BS-1 (15) Bột màu vàng nhạt, mp 168-169oC, C20H18O8, ESI-MS m/z 385 [M-H]¯ E4.3 10 15 H-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 7,77 (1H, s, H-2); 6,56 (1H, s, H-8); 6,67 (2H, s, H-2′, H-6′); 5,99 (2H, s, -O-CH2-O-); 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3′, 5′), 3,77 (3H, s, OCH3-4′) 13 C-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 56,0 (OCH3-3′, 5′); 60,6 (OCH3-4′); 60,9 (OCH3-5); 92,9 (C-8); 102,1 (-O-CH2-O-); 106,6 (C-2′, 6′); 113,4 (C-10); 125,4 (C-3); 127,3 (C-1′); 135,2 (C-6); 137,9 (C-4′); 141,5 (C-5); 150,8 (C-2); 152,8 (C-3′, 5′); 152,9 (C-7); 154,5 (C-9); 175,3 (C-4) Hợp chất BS-2 (16) Tinh thể màu vàng, mp 235-236oC, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]¯ H-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 3,87 (3H, s, OCH3-6); 6,41 (1H, s, H-8); 6,84 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-3′, 5′); 7,35 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-2′, 6′); 7,99 (1H, s, H2) 13 C-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 116,2 (C-2′,6′); 123,1 (C-3); 124,1 (C-1′); 131,3 (C-3′, 5′); 132,7 (C-6); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9); 158,6 (C-4′); 182,4 (C-4) Hợp chất BS-3 (17) Tinh thể màu vàng nhạt, mp 237-238°C, C17H14O7, ESI-MS m/z 329 [M-H]¯ H-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 3,90 (3H, s, OCH3-3′); 6,46 (1H, s, H-8); 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-2′); 6,96 (1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz, H-6′); 7,14 (1H, J=2,0Hz, H-5′); 8,06 (1H, s, H-2) 13 C-NMR (CD3 OD CDCl3) δ (ppm): 56,4 (OCH3-3′); 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 113,8 (C-5′); 116,1 (C-2′); 122,7 (C-6′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-1′); 132,7 (C-6); 147,7 (C-4′); 148,6 (C-3′); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,6 (C-9); 182,4 (C-4) Hợp chất BS-4 (18) Bột màu vàng, mp 184-185°C, C18H16O8, ESI-MS m/z 359 [M-H]¯ H-NMR (CD3OD CDCl3) δ: (ppm) 3,88 (3H, s, OCH3-4′); 3,89 (3H, s, OCH3-5′); 3,94 (3H, s, OCH3-6); 6,48 (1H, s, H-8); 6,68 (2H, dd, J=6,0; 2,0 Hz, H-2′, 6′); 7,90 (1H, s, H-2) 13 C-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 55,7 (OCH3-6); 60,3 (OCH3-4′); 60,4 (OCH3-5′); 93,9 (C-8); 104,9 (C-10); 105,7 (C-2′); 109,4 (C-6′); 122,9 (C-3); 126,4 (C1′); 131,2 (C-6); 136,2 (C-4′); 149,8 (C-3′); 152,7 (C-5′); 152,8 (C-5); 153,2 (C-9); 153,3 (C-2); 156,7 (C-7); 180,7 (C-4) Hợp chất BS-5 (19) Bột màu trắng, mp 113oC, C9H10O3, ESI-MS m/z 167 [M+H]+ H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 2,56 (3H, s, CH3-8); 3,96 (3H, d, J=7,5Hz, OCH3-9); 6,06 (1H, s, OH); 6,94 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,54 (1H, dd, J=1,8; 8,0 Hz, H-7); 7,53 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-3) 13 C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 196,7 (C=O); 130,3 (C-2); 124,1 (C-3); 146,6 (C-4); 150,4 (C-5); 113,8 (C-6); 109,8 (C-7); 26,17 (CH3-8) 56,12 (CH3-9) Hợp chất BS-6 (20) Tinh thể màu vàng, mp.221-223°C, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]+ H-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3); 6,54 (1H, s, H-8); 6,56 (1H, s, H-6); 6,93 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3′, 5′) 7,82 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2′, 6′) methylchroman-4-one có độ quay cực [α ]D = +53,2 Điều xác nhận hợp chất EB1a có cấu hình C-2 S Do vậy, hợp chất EB-1 xác định (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside Đây hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên Hình 4.1d, h Cấu trúc hợp chất EB-1a EB-1 4.1.2 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm 4.1.2.1 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm cặn chiết củ sâm đại hành Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cặn chiết methanol, n-hexan, ethyl axetat cặn chiết nước củ sâm đại hành khả ức chế khối viêm cục theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone Kết nghiên cứu theo đường uống cho thấy có cặn chiết etyl axetat (EB-Et) ức chế 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử dụng hoạt chất) với % ức chế khối viêm 52,12% Chất đối chứng dương Indomethacine có hoạt tính ổn định ức chế 64,59% khối viêm 4.1.2.2 Kết nghiên cứu tác dụng ức chế sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh tuỷ xương kích thích LPS hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Đầu tiên, sử dụng phương pháp nhuộm màu MTT để đánh giá ảnh hưởng đến khả sống sót tế bào 14 hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Sau tiến hành thử hoạt tính ức chế sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh tuỷ xương kích thích LPS hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Hình 4.15 Tác dụng hợp chất EB-1-EB-14 nồng độ 25,0 µm đến sản sinh IL12p40 từ tế bào tua DC kích thích LPS 14 Dưới trình bày phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Dihydroeleutherinol8-O-β-D-glucopyranoside (EB1) phân lập từ củ sâm đại hành: 25 Hợp chất EB-1 thu dạng chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –58,1 (MeOH, c = 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có cực đại hấp thụ λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) nm Phổ hồng ngoại IR cho đỉnh hấp thụ 3495 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu nhóm –OH, 1640 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu nhóm C=O 1610 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu C-O-C Phổ ESI-MS cho pic ion negative m/z 419 [M–H]– Phổ phân giải cao HRESI-MS với pic ion cluster m/z 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342) phù hợp với công thức phân tử C21H24O9 Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu sau: nhóm methyl bậc ba δH 2,45 ppm, nhóm methyl bậc hai δH 1,46 ppm (d, J=6,1 Hz), proton thơm singlet δH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7) δH 6,85 ppm (s, H-6), proton anomeric δH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1') Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu 21 nguyên tử C, tín hiệu cộng hưởng 12 nguyên tử cacbon thơm olefin, tín hiệu nhóm cacbonyl δC 194,3 ppm (C-4), tín hiệu nguyên tử cacbon δC từ 62,5 đến 78,3 ppm tín hiệu nguyên tử cacbon δC 101,7 ppm (C-1') thuộc phần đường monosaccharide; tín hiệu hai nhóm methyl δC 20,7 ppm (2-Me) 23,3 ppm (5Me) Phân tích liệu phổ cho thấy phần aglycone EB-1 xác định dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d) Phổ HMBC EB-1 cho thấy tương tác H-2 (δH 4,87) với C-1a (δC 163,4), C3 (δC 45,9), C-4 (δC 194,3), 2-Me (δC 20,7); H-3 (δH 2,57 2,62) với C-2 (δC 78,0), C-4 (δC 194,3), 2-Me (δC 20,7) gợi ý nhóm methyl nhóm carbonyl tương ứng vị trí C-2 C-4 vòng dihydropyrone Mặt khác, phổ HMBC xuất tương tác 5-Me (δH 2,45 ppm) với C-4a (δC 114,6 ppm), C-5 (δC 137,6 ppm), C-6 (δC 124,2 ppm); H-7 (δH 6,67) với C-6 (δC 124,2), C-8 (δC 161,4), C-9 (δC 103,5), C-10a (δC 109,9); H-9 (δH 6,45) với C-7 (δC 103,6), C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), C-10a (δC 109,9) Những kiện chứng tỏ vị trí nhóm methyl hai nhóm hydroxyl tương ứng vị trí C-5, C-8, C-10 Sự có mặt phân tử đường phân tử hợp chất EB-1 khẳng định thêm việc thủy phân EB-1 môi trường axit thu đơn vị đường Dglucose aglycone EB-1a Ngoài ra, vị trí đường glucose C-8 khẳng định thêm tương tác H-1' glc (δH 4,93) C-8 (δC 161,4) phổ HMBC Để xác định cấu hình tuyệt đối C-2 phân từ hợp chất EB-1 tiến hành ghi phổ CD EB-1 Phổ CD hợp chất EB-1 cho thấy hiệu ứng cotton xung quanh 319 nm, tương tự hợp chất (2S)-5-hydroxy-6,8-dimethoxy-2-methyl-4H2,3-dihydronaphtho[2,3-b]-pyran-4-one, điều gợi ý cấu hình C-2 EB-1 cấu hình S Thêm vào để khẳng định thêm cấu hình EB-1, xác định cấu hình aglycone EB-1a cách so sánh độ quay cực EB-1a với hợp chất 225 methylchroman-4-one hợp chất (R)-dihydroeleutherinol ( [α ] D =+8,8) Độ quay cực EB-1a đo [α ] 25 = –38,3, hợp chất (S) 5,7-dihydroxy-2D methylchroman-4-one có độ quay cực [α ] D = –58,6 hợp chất (R) 7-methoxy-2- 11 13 C-NMR (CD3OD) δ (ppm): 60,9 (OCH3-7); 92,1 (C-8); 104,3 (C-10); 115,6 (C3′,5′); 135,6 (C-3); 121,8 (C-1′); 129,5 (C-2’, 6’); 97,6 (C-6); 160,3 (C-5); 164,8 (C-7); 147,4 (C-2); 156,3 (C-9); 159,5 (C-4′); 176,8 (C-4) Hợp chất BS-7 (21) Dạng bột vô định hình màu vàng, C16H12O7, ESI-MS m/z 315 [M-H]+ H-NMR (CD3OD CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 6,46 (1H, s, H-8); 6,85 (2H, d, J = 2,0Hz, H-2′, 6′), 7,02 (1H, d, J =1,5 Hz, H-5′), 8,01 (1H, s, H-2) 13 C-NMR (CD3 OD CDCl3 ) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10); 116,2 (C-2′); 117,3 (C-5′); 121,6 (C-1′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-6′); 132,6 (C-6); 146,0 (C3′); 146,5 (C-4′); 154,4 (C-5); 154,6 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9) 182,4 (C-4) Hợp chất BS-8 (22) Dạng bột màu trắng, mp 285-286oC, C35H60O6, ESI-MS m/z 575 [M-H]¯ H-NMR (500MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 0,77 (3H, s, CH3-18); 0,81 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27); 0,82 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-29); 0,90 (3H, d, J=6,0 Hz, CH3-21); 0,96 (3H, s, CH3-19); 3,46 (1H, m, H-3); 5,33 (1H, d, J=5,0 Hz, H-6); 2,90 (1H, m, H-2′-glc); 3,02 (1H, m, H-4′-glc); 3,07 (1H, m, H-5′-glc); 3,12 (1H, m, H-3′-glc); 3,41 (1H, m, H-6′a-glc); 3,65 (1H, m, H-6′b-glc); 4,22 (1H, d, J=7,0 Hz, H-1′-glc); 4,39 (1H, t, J=6,0 Hz, OH-6′-glc); 4,82 (1H, d, J=2,0 Hz, OH-4′-glc); 4,83 (1H, d, J=2,0 Hz, OH-2′-glc) 4,85 (1H, d, J=5Hz, OH-3′-glc) 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 11,7 (CH3-18); 19,0 (CH3 -27); 19,7 (CH3-26); 11,73 (CH3-29); 18,6 (CH3 -21); 18,90 (CH3-19); 20,6 (C-11); 22,6 (C28); 23,2 (C-15); 25,4 (C-23); 27,7 (C-16); 28,7 (C-25); 29,2 (C-2); 31,3 (C-7); 31,4 (C-8); 33,3 (C-22); 35,4 (C-20); 36,2 (C-10); 36,8 (C-1); 38,3 (C-4); 39,2 (C-12); 41,8 (C-13); 45,1 (C-24); 49,6 (C-9); 55,4 (C-17); 56,1 (C-14); 76,9 (C-3); 121,1 (C-6); 140,4 (C-5); 60,1 (C-6′-glc); 70,1 (C-4′-glc); 73,3 (C-2′-glc); 76,4 (C-3′-glc); 76,7 (C5′-glc); 100,7 (C-1′-glc) Hợp chất BS-9 (23) Dạng bột, màu trắng, mp 256-257oC, C22H22O11, ESI-MS m/z 463 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, DMSO) δ (ppm): 8,43 (1H, s, H-2), 7,40 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,88 (1H, s, H-8), 5,08 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1ʺ), 3,73 (1H, d, J=7,5 Hz, Ha-6ʺ), 3,45 (1H, d, J=10,5 Hz, Hb-6ʺ), 3,36 (1H, m, H2ʺ), 3,34 (1H, m, H-3ʺ), 3,19 (1H, m, H-4ʺ), 3,44 (1H, m, H-5ʺ), 3,80 (3H, s, OCH3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO) δ (ppm): 154,6 (C-2), 121,09 (C-3), 180,7 (C-4), 152,8 (C-5), 132,4 (C-6), 156,5 (C-7), 94,0 (C-8), 152,4 (C- 9), 106,44 (C-10), 122,04 (C-1′), 130,11 (C-2′, 6′), 115,05 (C-3′, 5′), 157,40 (C-4′), 100,17 (C-1ʺ), 73,11 (C-2ʺ), 76,67 (C-3ʺ), 69,64 (C-4ʺ), 77,26 (C-5ʺ), 60,64 (C-6ʺ), 60,24 (OCH3) Hợp chất BS-10 (24) Dạng bột vô định hình màu vàng, C22H22O11, ESI-MS m/z 485 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 3,75 (3H, s, 6-OCH3), 6,87 (1H, s, H-8), 6,83 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-3′, 5′), 7,38 (2H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-2′, 6′), 8,43 (1H, s, H-2), 5,45 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 3,32 (m, H-2″), 3,41 (m, H-3″), 3,34 (m, H-4″), 3,38 (m, H-5″), 3,44 (m, Ha-6″), and 3,65 (m, Hb-6″) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 154,7 (C-2), 121,0 (C-3), 180,8 (C-4), 152,9 (C-5), 132,5 (C-6), 157,5 (C-7), 94,1 (C-8), 152,5 (C-9), 106,5 (C-10), 122,1 (C- 12 13 1′), 130,2 (C-2′), 115,1 (C-3′), 156,6 (C-4′), 115,1 (C-5′), 130,2 (C-6′), 100,2 (C-1″), 73,3 (C-2″), 76,7 (C-3″), 69,7 (C-4″), 77,3 (C-5″), 60,7 (C-6″), 60,3 (OCH3 -6) Hợp chất BS-11 (25) Dạng bột vô định hình màu vàng, C21H20O11, ESI-MS m/z 471 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 5,45 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″), 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,88 (2H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-3′, H-5′) 8,03 (2H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-2′, H-6′) 13 C- NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 158,5 (C-2), 135,3 (C-3), 179,5 (C-4), 163,0 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,8 (C-8), 159,0 (C-9), 105,7 (C-10), 122,7 (C-1′), 132,3 (C-2′), 116,1 (C-3′), 161,5 (C-4′), 116,1 (C-5′), 132,3 (C-6′), 104,1 (C-1″), 75,7 (C-2″), 78,0 (C-3″), 71,3 (C-4″), 78.0 (C-5″), 62,6 (C-6″) Hợp chất BS-12 (26) Dạng bột màu vàng, mp 240-242oC, C21H20O12, ESI-MS m/z 487 [M+Na]+ H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 5,23 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 6,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,71 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′) 7,56 (1H, d, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′) 13 C NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 158,4 (C-2), 135,6 (C-3), 179,4 (C-4), 162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,4 (C-7), 94,8 (C-8), 158,8 (C-9), 104,3 (C-10), 123,2 (C-1′), 115,9 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,9 (C-4′), 117,5 (C-5′), 123,0 (C-6′), 104,4 (C-1″), 75,7 (C2″), 78,3 (C-3″), 71,1 (C-4″), 78,0 (C-5″), 62,5 (C-6″) Hợp chất BS-13 (27) Bột vô định hình màu trắng, C29H48O, ESI-MS m/z 412 [M+Na]+ H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH ppm: 3,51 (1H, tt, 11,0, 5,0, H-3), 5,35 (1H, brs, H6), 0,70 (3H, s, H-19), 5,13 (1H, m, H-20), 5,35 (1H, m, H-21), 0,83 (3H, t, 6,0, H-24), 0,79 (3H, d, 7,0, H-26), 0,82 (3H, d, 6.5, H-27), 0,80 (3H, d, 6,0, H-28), 1,03 (3H, s, 6,0, H-29) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 11,2 (C-24), 11,7 (C-21), 18,4 (C-26), 18,8 (C27), 20,4 (C-18), 20,5 (C-19), 20,6 (C-11), 23,7 (C-16), 24,8 (C-15), 28,3 (C-24), 31,0 (C-20), 31,2 (C-8), 31,3 (C-7), 35,9 (C-25), 36,7 (C-12), 39,0 (C-1), 39,4 (C-2), 40,0 (C10), 41,5 (C-13), 41,7 (C-24), 49,5 (C-9), 50,6 (C-4), 55,2 (C-14), 56,2 (C-17), 70,5 (C3), 120,6 (C-6), 128,5 (C-22), 137,7 (C-23), 140,4 (C-5) Hợp chất BS-14 (28) Chất bột màu trắng, mp 53-54oC, C14H28O2, EI-MS m/z 228 [M]+ H -NMR (500 MHz, CD3 OD) δH ppm: 0,89 (t, H-1), 1,26 (m, H-2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), 1,64 (m, H-12), 2,36 (t, H-13) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 180,62 (C-1), 34,20 (C-2), 24,74 (C-3), 29,72 (C-4), 29,42 (C-5), 29,49 (C-6, 7, 8, 9, 10), 29,31 (C-11), 31,99 (C-12), 22,74 (C-13), 14,12 (C-14) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH 4.1.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc 14 hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành, có hợp chất EB-1 hợp chất hợp chất EB-14 lần đầu phân lập từ sâm đại hành Bảng 4.9 Bảng tổng hợp hợp chất phân lập từ sâm đại hành Me O Me 4a Me O 6a 10a 1a O 6a Me OH O HO OH Me HO HO HO OH O OH Eleutherinoside A (EB3) Eleutherinol (EB2) OH O OMe O O Me OH O 10 O 12 13 ODsac Me(β) H O HO O HO HO 12 ODsac H HO HO HO HO HO HO Dsac OGlc Eleutherinoside B (EB9) Me OMe ODsac O HO HO HO OH O OH HO HO Dsac Eleuthoside A (EB11) O Eleuthoside B (EB12) Me H O OH HO O ODSac O OH Me Eleutherinoside D (EB13) O HO O Glc OH OH O O HO HO HO OH (R) 7-acetyl-3,6-dihydroxy8-methyltetral-1-one (EB10) OMe Me O O OH O Dsac OH O O HO HO OH OMe Me(α) HO OH Eleutherinoside C (EB8) O O 12 13 ODsac O Dsac Eleuthoside C (EB7) Me Me(α) O OH 11 O O 10 14 13 OH 11 HO OH O OH OMe 10 14 H Isoeleutherin (EB6) OH 11 O H Eleutherin (EB5) OMe OH 14 Me(α) Me O (–)-hongconin (EB4) O OMe O Me Me Glc Dihydroeleutherinol-8-O-βD-glucopyranoside (EB1) (Chất mới) HO HO O OH Glc 1a GlcO O OMe 10a 10 GlcO HO HO HO 4a 10 OMe O Deoxyerythrolaccin (EB14) Lần phân lập từ sâm đại hành [...]... 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH 4.1.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 14 hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành, trong đó có hợp chất EB-1 là hợp chất mới và hợp chất EB-14 lần đầu được phân lập từ cây sâm đại hành Bảng 4.9 Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành... C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), và C-10a (δC 109,9) Những dữ kiện này chứng tỏ vị trí nhóm methyl và hai nhóm hydroxyl tương ứng ở các vị trí C-5, C-8, và C-10 Sự có mặt của một phân tử đường trong phân tử hợp chất EB-1 được khẳng định thêm bằng việc thủy phân EB-1 trong môi trường axit thu được 1 đơn vị đường Dglucose và aglycone EB-1a Ngoài ra, vị trí của đường glucose ở C-8 được khẳng định thêm... (–)-hongconin (EB4) 9 O OMe O Me Me Glc Dihydroeleutherinol-8-O-βD-glucopyranoside (EB1) (Chất mới) HO HO O OH Glc 6 1a GlcO O OMe 2 10a 7 10 GlcO HO HO HO 4 4a 10 OMe O 5 6 Deoxyerythrolaccin (EB14) Lần đầu tiên phân lập được từ cây sâm đại hành ...14 Dưới đây trình bày phương pháp xác định cấu trúc hợp chất mới Dihydroeleutherinol8-O-β-D-glucopyranoside (EB1) được phân lập từ củ sâm đại hành: 25 Hợp chất EB-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt; [α ] D –58,1 (MeOH, c = 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có các cực đại hấp thụ tại λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) nm Phổ hồng ngoại... 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342) phù hợp với công thức phân tử là C21H24O9 Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của hợp chất EB-1 cho thấy các tín hiệu sau: 1 nhóm methyl bậc ba ở δH 2,45 ppm, 1 nhóm methyl bậc hai ở δH 1,46 ppm (d, J=6,1 Hz), 3 proton thơm singlet ở δH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7) và δH 6,85 ppm (s, H-6), và proton anomeric ở δH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1') Phổ 13C-NMR và DEPT của... nhóm cacbonyl ở δC 194,3 ppm (C-4), 5 tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon ở δC từ 62,5 đến 78,3 ppm và 1 tín hiệu của nguyên tử cacbon ở δC 101,7 ppm (C-1') thuộc phần đường monosaccharide; 2 tín hiệu của hai nhóm methyl ở δC 20,7 ppm (2-Me) và 23,3 ppm (5Me) Phân tích các dữ liệu phổ trên cho thấy phần aglycone của EB-1 được xác định là dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d) Phổ HMBC của EB-1 cho thấy ... Trên sở nghiên cứu tài liệu, chương đề cập đến tình hình nghiên cứu hoá học hoạt tính sinh học loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) loài xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.), ... khối viêm 4.2.2.2 Kết nghiên cứu tác dụng sinh học độ an toàn tectorigenin phân lập từ thân rễ xạ can a Kết nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau tectorigenin * Kết nghiên cứu tác dụng giảm... nhân 1D, 2D NMR 2.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo cặn chiết: - Theo đường bôi: theo phương pháp Mrudula Kale (2007), Jaijoy K (2010) - Theo