MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Khoa học công nghệ ứng dụng đời sống ngày quan tâm giới nói chung Việt Nam nói riêng Những ứng dụng khoa học công nghệ vào sống ngày thể quan trọng lĩnh vực Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần thay hợp chất có nguồn gốc hóa học Sự phát triển công nghệ sinh học giúp xã hội phát triển theo hướng thích ứng với tự nhiên, trình tổng hợp hợp chất tự nhiên từ vi sinh vật điểm đến nhà nghiên cứu Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ chu trình sống chúng So với hợp chất tổng hợp đường hóa học, tổng hợp phương pháp sinh học có ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức khỏe người, thân thiện với môi trường có tính chất bền vững Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, tạo cách sử dụng axit glutamic thông qua phương thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai sử dụng vi sinh vật có khả tổng hợp polyme từ trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật Bản chất polyme có khả phân hủy, không độc với người, tự nhiên nên γ-PGA nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực.Trong ngành công nghiệp xử lý môi trường γ-PGA sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ trình lắng, thay dần chất kết tụ có nguồn gốc hóa học Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA sử dụng dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, y dược γ-PGA dùng chất mang, chất giữ ẩm Theo số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả sinh tổng hợp γ-PGA sản phẩm nước mà phân lập từ sản phẩm thực phẩm truyền thống Việt Nam Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm, Chao…[5].Từ thực trạng nghiên cứu γ-PGA sản xuất ứng dụng Việt Nam cho thấy cần có nghiên cứu rộng tính chất ưu việt vi khuẩn Bacillus sản phẩm vi khuẩn tạo Hơn việc tạo sản phẩm có nguồn gốc từ trình lên men xu hướng phát triển, tính an toàn, khả ứng dụng cao, ảnh hưởng đến môi trường sống Để đáp ứng nhu cầu đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận axit poly γ glutamic hướng ứng dụng thực phẩm” đời nhằm khai thác những điểm mạnh vi khuẩn Bacillus tạo sản phẩm đáp ứng nhu cầu thiết xã hội Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi sinh vật Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp γ PGA từ sản phẩm thực phẩm Khảo sát tối ưu điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic Tinh sạch, thu nhận khảo sát đặc điểm axit poly γ glutamic Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào số sản phẩm thực phẩm Những đóng góp đề tài Luận án nghiên cứu cách có hệ thống công nghệ thu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc, đặc tính γ PGA Bước đầu ứng dụng có hiệu γ PGA việc ổn định trạng thái, màu sắc, hương vị nước cam chế biến bảo quản, cải thiện độ giòn, dai, màu sắc sản xuất giò Bố cục luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số liệu 53 hình ảnh 130 tài liệu tham khảo đó: Mở đầu (2 trang); Chương Tổng quan (37 trang), Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu (11 trang), Chương Kết thảo luận (58 trang), Chương Kết luận (1 trang), Danh mục công trình nghiên cứu công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang) Chƣơng TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tổng hợp nghiên cứu nước nước đề cập đến vấn đề Tình hình nghiên cứu sản xuất γ-PGA giới Tình hình nghiên cứu ứng dụng γ-PGA Việt Nam Cấu trúc phân loại γ-PGA Tính chất γ-PGA, hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA chế sinh tổng hợp γ-PGA Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp γ-PGA Các Phương pháp định lượng tinh γ-PGA Các phương pháp xác định cấu trúc khối lượng phân tử γ PGA Ứng dụng γ-PGA lĩnh vực công nghệ thực phẩm, môi trường, mỹ phẩm, y tế, nông nghiệp ngành công nghiệp khác Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu, dụng cụ thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng luận án gồm Phương pháp vi sinh sinh học phân tử Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA Phương pháp hóa lý hóa sinh: Xác định hàm lượng PGA Xác định hàm lượng protein, xác định hàm lượng carbohydrate Kiểm tra độ tinh điện di gel polyacrylamide (SDS PAGE) Kiểm tra độ tinh sắc ký lỏng cao áp - HPLC Xác định khối lượng phân tử sắc ký thấm gel Xác định tỷ lệ đồng phân L D – Glutamic thành phần γ-PGA đo độ phân cực Phương pháp tinh dựa phương pháp sử dụng giới Phương pháp toán học: tối ưu đa yếu tố theo quy hoạch thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu đánh giá mức độ ảnh hưởng γPGA đến chất lượng nước cam ép đóng chai Phương pháp nghiên cứu đánh giá mức độ ảnh hưởng γPGA đến chất lượng giò lụa Phương pháp đánh giá cảm quan dựa theo TCVN 3215-79 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp Poly γ glutamic 3.1.1Tuyển chọn chủng sinh γ PGA axit môi trường đặc hiệu Kết cho thấy từ 27 chủng phân lập chủng có khả phát triển mạnh môi trường đặc hiệu sau 72 h nuôi cấy; 20 chủng vi khuẩn phát triển chậm sau 72 h số không phát triển Hình 3.1 Sự tạo màng chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu Từ chủng thu thông qua nuôi cấy môi trường đặc hiệu E, cho thấy chủng có khả tạo màng nhầy lớn sau 96 h bốn chủng B5; ND1; N2; T1 tiến hành kiểm tra khả tạo nhớt chủng để đánh giá khả tạo γ PGA chủng 3.1.2 Tuyển chọn chủng dựa đặc tính tạo nhớt môi trường đặc hiệu Kết nghiên cứu cho thấy độ nhớt canh trường nuôi cấy tăng mạnh thời gian từ 72h đến 96h, độ nhớt lớn đạt chủng thời điểm 96h Hai chủng B5 T1 hai chủng tạo độ nhớt lớn từ 5,2 – 5,3cp, chủng ND1 ND6 chủng tạo độ nhớt thấp chủng Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá hiệu suất sinh tổng hợp chủng đưa giá trị tương đối khả tạo γ-PGA 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp γPGA phương pháp đo quang UV-VIS Kết cho thấy khả sinh γ-PGA mạnh thời điểm 96h chủng phân lập Theo số nghiên cứu trước γ-PGA 96h giá trị γ-PGA tạo cực đại, thời điểm lựa chọn để dừng trình lên men nhằm tăng hiệu trình sản xuất Dựa kết đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA phương pháp phổ tử ngoại đặc điểm hình thấy hai chủng vi khuẩn có mã hiệu B5 T1 có khả sinh tổng hợp γ-PGA lớn số chủng vi khuẩn phân lập Trên sở lựa chọn hai chủng vi khuẩn B5 T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γPGA 3.2 Định tên chủng vi khuẩn sinh γ PGA 3.2.1 Định tên phương pháp sinh hóa Dựa vào kết phân loại bảng 3.5 đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS, đặc điểm sinh lý, sinh hóacho thấy chủng vi khuẩn B5 có độ tương đồng với B subtilis 98% độ tương đồng vi khuẩn T1 với loài B subtilis 73% 3.2.2 Định tên phương pháp sinh học phân tử: Trình tự đoạn gel giải trình tự hệ thống máy ABI 3103XL xác định đoạn gen 16S rRNA chủng B5 có 1250 bp T1 1516bp Phân tích kết phần mềm sequecing analysis 5.3, so với kết ngân hàng gen kỹ thuật BLAST cho thấy chủng B5 có quan hệ gần nhất, 99% với loài B subtilis strain wn39 mã số 161621764|gb|EU294413.1 chủng T1 có quan hệ gần nhất, 97% với B subtilis strain y10 Kết định danh hai phương pháp hóa sinh phương pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 chủng vi khuẩn có độ tương đồng 99% chủng vi khuẩn B subtilis Dựa vào kết định danh vi khuẩnB subtilis mã hiệu B5 đề xuất tên gọi cho chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B5 Đối với chủng T1 trình định danh hai phương pháp hóa sinh phương pháp sinh học phân tử cho kết có độ tương đồng với B subtilis 97% phương pháp hóa sinh 73% cho thấy chủng T1 không thuộc loài B subtilis, chủng B Subtilis B5 lựa chọn sử dụng chủng giống cho trình nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp γ PGA 3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ PGA Những nghiên cứu sinh tổng hợp γ PGA cho thấy tiền chất để tạo thành γ PGA chủ yếu hợp chất glutamic glutamat Nghiên cứu nguồn tiền chất đậu tương, glutamic natri glutamat, tiến hành sinh tổng hợp γ PGA cho thấy sử dụng natri glutamat làm nguồn tiền chất cho trình tạo γ PGA thay cho axit glutamic 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ B subtilis loài vi khuẩn ưa ấm có khả sinh trưởng phát triển tốt dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC Chủng B subtilis B5 chủng phân lập từ Tương bần, sản phẩm sản xuất điều kiện có sử dụng nhiệt độ môi trường cao cho trình lên men (37-40oC) Để tìm chế độ nhiệt thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu có Natri glutamat, điều kiện nuôi tĩnh, lên men nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC 45oC 50oC để nuôi cấy, thu nhận kết 24h lần, kết thúc trình lên men sau thời gian 120h Kết nghiên cứu thể qua đồ thị hình 3.9 10 Thời gian 24 48 γ PGA (g/l) (h) 72 96 120 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 3.3.3.Ảnh hưởng tốc độ lắc Tốc độ lắc trình lên men khảo sát tốc đô từ – 200 v/p, tốc độ lắc thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho môi trường lên men Khi tốc độ lắc lên đến 200 v/p hình thành dòng chảy xoáy canh trường, cung cấp oxy hòa tan cho trình lên men tăng, hình thành γ-PGA có cải thiện so với tốc độ lắc từ 100-150 v/p Đối với mẫu nuôi tĩnh tác động lên lớp vỏ tế bào, nên hình thành γ-PGA không bị ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men phản ánh góc độ nghiên cứu phòng thí nghiệm Do lựa chọn phương án tốc độ lắc = v/p ( nuôi tĩnh) làm thông số cho trình nghiên cứu tiếp theo, phương án đề cập nhiều công trình nghiên cứu γ-PGA sản sinh từ B subtilis nhà khoa học giới 3.3.4 Ảnh hưởng pH Sự ảnh hưởng pH đến phát triển sinh trưởng vi khuẩn B subtilis B5 thể rõ giá trị pH = môi trường axit yếu pH =9 môi trường kiềm, khả sinh tổng hợp γ-PGA hầu không thấy Sự hình thành γ-PGA tăng mạnh khoảng pH từ đến thời gian 96h Giá trị γ-PGA cao (13,03 g/l) thời điểm 96h môi trường có pH ban đầu 8, hàm lượng γ-PGA giá trị pH = pH = đạt cực đại thời điểm nuôi cấy 96h 3.3.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp γ-PGA Nguồn cacbon phần cốt lõi để tạo lên khung tế bào vi sinh vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn cacbon phù hợp giúp phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis B5 phát triển tốt, tạo tiền đề cho sinh tổng hợp γ-PGA Sau nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon lactoza, glucoza, saccaroza axit xitric, lựa chọn nguồn cacbon sử dụng axit citric nồng độ 1,5% (15g/l) làm thông số cho trình nghiên cứu 3.3.6 Ảnh hưởng nguồn Nitơ Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến trình sinh tổng hợp Poly γ glutamic axit với nguồn nitơ thông dụng rẻ tiền NH4Cl, cao nấm men, NH4NO3 cho thấy trình sinh tổng hợp γ PGA đạt nồng độ cao 13,5 g/l sử dụng nguồn nitơ NH4NO3 γ-PGA (g/l) 16 14 12 10 10 Cao nấm men 15 20 NH4NO3 25 NH4Cl 30 nguồn nitơ (g/l) Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hình thành γ PGA Quá trình sinh tổng hợp γ-PGA sử dụng NH4NO3 làm nguồn nitơ cho trình tổng hợp γ-PGA, thay nguồn nitơ dùng môi trường E NH4Cl 3.3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống Tỷ lệ cấp giống yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Nghiên cứu với tỷ lệ cấp giống đến trình lên men dao động khoảng 1% đến 15% với thời gian lên men 96h cho thấy: Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γPGA lớn 16,48 g/l, hai tỷ lệ cấp giống 1% 15% lượng γ-PGA tạo thành nhỏ dao động khoảng g/l Tỷ lệ cấp giống cao hay ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp, vi khuẩn cần phải có thời gian sinh trưởng phát triển, hình thành γ-PGA cần phải kéo dài hơn, tỷ lệ cấp giống cao dẫn tới cạnh tranh nguồn dinh dưỡng giai đoạn sinh trưởng phát triển, gây cân canh trường dẫn đến hình thành sản phẩm phụ, thay đổi môi trường pH, ảnh hưởng đến hiệu suất sinh γ-PGA Vì tỷ lệ cấp giống 5% lựa chọn làm thông số cho nghiên cứu 3.3.8 Ảnh hưởng nồng độ Natri-glutamat Các nghiên cứu việc thay L-glutamic nồng độ 20 g/l Natri glutamat nồng độ 20 g/l Sau thay đổi điều kiện, môi trường, chế độ nuôi cấy, nồng độ γ-PGA tạo thành có phần cải thiện Để tạo điều kiện cho hình thành γ-PGA cực đại với nguồn tiền chất mới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ tiền chất đến lượng γ-PGA hình thành cho thấy với nguồn tiền chất Natri – Glutamat với nồng độ 25 g/l tạo nên lượng γ-PGA cao sơ với sử dụng Natri – glutamat nồng độ 20g/l tạo thành γ PGA = 20,5 g/l 3.4 Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ PGA Theo nguyên tắc ma trận Box – Behnken, ta tiến hành 29 thí nghiệm với thay đổi đồng thời bốn yếu tố quanh giá trị trung bình Từ phân tích phương sai, phần mềm đưa phương trình hồi quy theo giá trị thực mô hình nghiên cứu sau: Hàm lượng γ- PGA = - 2356,079 + 49,003X1 + 0,267X2 - 1,375X3 – 0,022X1X2 + 0,055X2X3 - 0,542X1X2 - 0,009X2X2 - 0,115X3X2 – 21,617X4X2 Giá trị chuẩn Fisher (F) 24,70 mô hình hoàn toàn có ý nghĩa với độ tin cậy 99,99% (p 0,05) điều có nghĩa mô hình tương thích với thực nghiệm Đánh giá dựa giá trị hệ số xác định bội (R2 hay R-square để đo mức độ hàm hồi quy) hệ số xác định bội hiệu chỉnh (Adj R-square), hai thông số đặc trưng cho mức độ phù hợp mô hình việc giải thích thí nghiệm Trong nghiên cứu giá trị R-square = 0,9611 Adj R-square = 0,9222 > 0,9 điều chứng tỏ mô hình lựa chọn phù hợp để giải thích kết nghiên cứu thí nghiệm Tối ƣu hóa mô hình nghiên cứu Sau phương trình hồi quy sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng, phần mềm DX 7.0.0 tính giá trị biến độc lập để tính giá trị tối ưu γ-PGA đồng thời đánh giá hình ảnh, ảnh hưởng biến độc lập đến lượng γ-PGA sinh tổng hợp Hai 12 phương án tối ưu lý thuyết lựa chọn sau: Phương án 1: Nếu xét góc độ tính toán để tối ưu hàm lượng γ PGA hay nói cách khác đặt mức độ quan trọng tiêu đến mức cao nhất, phần mềm cho phương án sau thời gian 115,97 giờ, điều kiện pH ban đầu 8,04 hàm lượng tiền chất 30 g/l nhiệt độ nuôi 39,41oC, thu nồng độ γ-PGA cao 26,40 g/l phương án có giá trị mong đợi (Desirability) 0,978 Dựa kết tối ưu tiến hành thực nghiệm kiểm chứng nhiệt độ 39,5oC, pH = 8, nồng độ tiền chất 30g/l với điều kiện khác tương tự sau 116 nuôi cấy nồng độ γ-PGA thu 26,04 g/l Phương án 2: Nếu xét góc độ tính toán tối ưu để áp dụng sản xuất quy mô lớn, cần phải xem xét yếu tố thời gian ngắn, đầu vào nguyên liệu thấp, cho sản lượng tối ưu, tiến hành đặt mức độ quan trọng thời gian, tiền chất lên mức độ quan trọng nhất, sản lượng γ PGA mức khá, nhiệt độ mức trung bình giá trị ảnh hưởng pH mức độ vừa phải Sau chạy phần mềm tối ưu ta thông số nhiệt độ = 39,74OC; thời gian thu nhận 97,02 giờ; nồng độ tiền chất 25 g/l pH=8,0 hàm lượng theo phần mềm tính tinh toán 23,71 g/l phương án đạt giá trị mong đợi 1,000 Dựa kết tính toán lý thuyết, tiến hành thực nghiệm kiểm chứng với thông số nhiệt độ 40OC, pH = nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 thu nhận γ PGA có nồng độ 25,02 g/l cao với tính toán lý thuyết 1,31 g/l So sánh hai phương án đưa theo tối ưu hóa lý thuyết thực nghiệm ta thấy, thời gian chênh lệch phương án 19 (giảm 16%), chênh lệch tiền chất g/l (giảm 16,7%) hàm lượng γ PGA thu chênh lệch 1,02 g/l (tăng 3,9%) Như xét góc độ hiệu kinh tế phương án tối ưu phương án Do phương án với thông số nghiên cứu: nhiệt độ 40OC, pH = nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 thu nhận γ PGA phương án lựa chọn cho nghiên cứu sau đề tài 10 3.5 Nghiên cứu động thái trình lên men Quá trình sinh trưởng phát triển chủng B5 theo pha Từ đến 24h sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn chủng B5 thích ứng dần với môi trường lên men, khẳng định pha lag Giai đoạn từ 24 đến 72h sinh khối tế bào tăng mạnh từ 15,1 đến 54,6 g/l, cho thấy tế bào sinh sản nhanh, chất dinh dưỡng chủ yếu tổng hợp sinh khối Trong khoảng thời gian từ 72h-120h, quần thể vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ mức ổn định số tế bào chết số tế bào sinh Giai đoạn cuối từ 120 đến 144h sinh khối bào bắt giảm chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp gây ức chế sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng dần cạn kiệt Sinh khối ướt 10 (g/100ml) 0h PGA (g/l) 30 25 20 15 10 24h 48h pH 72h Sinh Khối ướt g/100ml) 96h 120h 144h Hàm lượng PGA (g/l) Hình 3.20: Đồ thị biểu diễn động học trình tổng hợp γ-PGA Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h bắt đầu giảm vào cuối pha cân Điều thấy tạo thành sinh khối mạnh sau 48h lên men tạo lượng enzim PGA synthetase lớn làm xúc tác cho trình tổng hợp γ-PGA Trong giai đoạn cuối pha cân phần γ-PGA vi khuẩn sử dụng làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm Trong toàn trình sinh trưởng phát triển, giá trị pH môi trường không thay đổi so với giá trị ban đầu 11 3.6 Nghiên cứu thông số sinh tổng hợp γ PGA quy mô 100 lít/mẻ 3.6.1 Ảnh hưởng chế độ khuấy sục khí Đánh giá mức độ phát triển vi sinh vật canh trường cách mật độ quang OD bước sóng 600nm để đánh giá tốc độ phát triển 96h với chu kỳ lấy mẫu 24h lần, kết thể bảng 3.9: Bảng 3.9 Ảnh hưởng khuấy sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) Chế độ cấp khí 0h 24h 48h 72h 96h γ-PGA (g/l) Tĩnh Khuấy 350 v/p Sục khí 10lít/phút Khuấy 350 v/p + sục khí 10 lít/phút 1x106 1x106 1x106 1x106 4x106 7x108 8x108 2x109 5x108 1x109 2x109 6x109 7x103 1x109 1x109 1x109 2x102 4x107 5x107 7x107 3,8 19,7 24,1 25,3 Qua kết bảng 3.9 nhận thấy hình thành γ-PGA trình nuôi tĩnh nhất, không giống nghiên cứu quy mô thí nghiệm Nghiên cứu cho thấy kết hợp phương pháp khuấy trộn sục khí cho môi trường lên men quy mô 100 lít khả sinh tổng hợp γ-PGA cao so với phương pháp lên men tĩnh, khuấy sục khí Hàm lượng γ-PGA = 25,3 g/l sau 96h kết hợp khuấy trộn sục khí trình lên men quy mô pilot 100 lít/mẻ Như nghiên cứu quy mô 100 lít/mẻ cần kết hợp phương pháp khuấy trộn sục khí cho môi trường lên men quy mô 100 lít khả sinh tổng hợp γ-PGA cao so với phương pháp lên men tĩnh, khuấy sục khí Hàm lượng γ-PGA = 25,3 g/l sau 96h kết hợp khuấy trộn sục khí trình lên men quy mô pilot 100 lít/mẻ 3.6.2 Sự thay đổi hàm lượng oxy hòa tan trình lên men Khảo sát cho thấy nồng độ oxy hòa tan thiết bị lên men giảm mạnh thời gian từ đến 24h nồng độ oxy hòa tan giai đoạn 24 đến 48h thấp, tiêu thụ oxy cho trình sinh trưởng 12 phát triển vi khuẩn làm lượng oxy hoa tan dịch giảm mạnh Sau 48h trình tổng hợp γ-PGA vào giai đoạn tăng trưởng, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn vào giai đoạn suy thoái Sau 72h nồng độ γ-PGA độ nhớt dịch lên men tăng đến giá trị cực đại, kìm hãm phát triển vi khuẩn, gây ức chế phát triển vi khuẩn, oxy sử dụng Trong giai đoạn enzim xúc tác trình chuyển hóa đơn phân glutamic muối thành chuỗi polyme γ PGA.Tại 24h- 48h nồng độ oxy hòa tan giảm xuống cực tiểu, đồng nghĩa với sinh trưởng phát triển vi sinh vật, mật độ vi sinh vật tăng, mức độ tiêu thụ oxy môi trường đạt cực đại, làm giảm lượng oxy môi trường Qua khảo sát thấy quy luật cung cấp tiêu thụ oxy cho trình lên men giai đoạn sinh trưởng B subtilis B5 lên men quy mô pilot Đây thông số cho trình cung cấp oxy hòa tan, thúc đẩy phát triển vi sinh vật, tăng hiệu suất trình tổng hợp γ PGA 3.7 Nghiên cứu số phương án tinh γ PGA Quá trình tinh γ-PGA sử dụng để nghiên cứu dựa công bố khoa học nước với phương pháp công bố Các phương pháp lựa chọn với mục tiêu chí: 3.6.1 So sánh phương pháp tinh dựa tiêu chí hàm lượng protein cacbonhydrat Các mẫu nghiên cứu thu được, tiến hành tinh phương pháp nêu với mẫu PP1, PP1, PP3 kiểm tra hàm lượng protein theo phương pháp Brandford, tính toán đo thông số cacbonhydrate sản phẩm sau tinh sạch, kết quả: phương pháp sau tinh hàm lượng cacbonhydrat lại nhất, sau đến phương pháp phương pháp 3, điều thấy ảnh hưởng than hoạt tính, celite đến việc hấp thụ hợp chất cacbonhydrat 3.6.2 Nghiên cứu đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau tinh Đánh giá cảm quan thông số độ nhớt cho mẫu nghiên cứu thấy phương pháp có sử dụng than hoạt tính celite (đất hoạt 13 tính) hai tác nhân có tác dụng hấp thụ màu hấp thụ mùi sản phẩm qua sản phẩm tạo thành mùi lạ phương pháp lại Do phương pháp tinh γPGA lựa chọn để nghiên cứu đưa vào ứng dụng cho nghiên cứu phương pháp có sử dụng kết hợp than hoạt tính, Celite, cồn phương pháp lọc, thẩm tích để thu nhận γ-PGA có chất lượng tốt 3.6.3 Kiểm tra mức độ tinh sản phẩm phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Để đánh giá mức độ tinh sản phẩm sau phương pháp, việc kiểm tra protein, cacbonhydrat có sản phẩm sau tinh sạch, ta kiểm tra axit amin lại sau trình tinh phương pháp sắc ký lỏng cao áp sản phẩm γ-PGA Kết sắc ký cho thấy có hiển diện axit L-glutamic, có peak nhỏ thể lẫn tạp chất sản phẩm sau thủy phân Phương pháp tinh sử dụng cồn, than hoạt tính Celite lựa chọn làm phương pháp sử dụng cho tinh γPGA 3.6.4.Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh qua kính hiển vi điện tử quét Nhìn vào mẫu sử dụng kính hiển vi điện tử quét thấy: mẫu thô lẫn nhiều tạp chất nên cấu trúc γPGA chưa hiển thị rõ cấu trúc khối, hiển thị nhìn thấy dạng phẳng hai chiều, không làm rõ cấu trúc phân tử γ-PGA mẫu tinh mẫu chuẩn So sánh hình ảnh kính hiển vi điện tử mẫu tinh mẫu chuẩn thấy rõ nét cấu trúc γ-PGA dạng không gian ba chiều Mẫu tinh thể cụm nhỏ liên kết với thành nhiều đám rời rạc tạo khoảng trống, mẫu chuẩn cụm nhỏ có hình bất định liên kết với nhau, nhiên liên kết chặt chẽ tạo khoảng trống, làm cho cấu trúc nhìn trông mịn liền khối 3.6.5 Xác định cấu trúc độ γ PGA thông qua phổ FTIR phổ H NMR Các phổ FT-IR H NMR γ PGA sau tinh thu chủng Bacillus subtilis B5 cho thấy: có thể gốc muối 14 carboxyl (COO- giãn bất đối xứng) mẫu γ PGA phân tích, phổ thể hình thành liên kết C=O nhiên bị che peak giãn COO- Tiếp đến giải phổ có liên quan đến liên kết nhóm NH; CH3; COO-; γ-CH2; αCH2 nhóm chức khác γ-PGA Những kết cho thấy kết hợp hai phổ FT –IR phổ H NMR để đánh giá cấu trúc phân tử γ PGA tương đối giống 3.8 Nghiên cứu số đặc tính γ PGA 3.8.1 Xác định khối lượng phân tử Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử mẫu γ-PGA phương pháp điện di SDS Page mẫu sau tinh cho thấy khối lượng phân tử mẫu sau chạy điện di với maker hiển thị màu chuẩn có khối lượng phân tử lớn 176 kDa khối lượng phân tử trung bình dao động khoảng 200KDa Đánh giá khối lượng phân tử trung bình sản phẩm γ PGA sắc ký lọc gel (GPC) kết sau tính toán dựa peak thu nhận khối lượng phân tử trung bình Mw γ PGA dao động khoảng từ 158 – 426 Kda Đối chiếu so sánh với nghiên cứu γ PGA tạo chủng Bacillus subtilis cho thấy thông thường có khối lượng phân tử từ 100 – 1.500 KDa 3.8.2 Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic L – Glutamic γ-PGA Từ γ-PGA tạo thành từ Bacillus subtilis B5 sau thủy phân băng axit làm sản phẩm đến độ tinh khiết định, tiến hành đo độ phân cực hỗn hợp đồng phân quang học D L glutamic Sau tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit 47,97/52,03 hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh Bacillus subtilis B5 Kết lần khẳng định cho nguồn gốc chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA Bacillus subtilis 3.8.3 Nghiên cứu tính bền axit γ PGA Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất γ PGA môi trường axit citric có nồng độ từ – 30g/l qua việc xác định độ nhớt dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng nồng độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm γ PGA nồng độ g/l Kết nồng độ axit tăng (độ pH giảm) khả tạo nhớt γ-PGA giảm đi, đến nồng độ axit 20g/l biến đổi độ nhớt 15 thay đổi nhiều Qua khảo sát kết luận sử dụng γ-PGA sản phẩm đồ uống có độ axit cao 3.8.4 Nghiên cứu tính bền nhiệt γ PGA Để tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ đến độ nhớt γ-PGA hay tính bền nhiệt, tiến hành nghiên cứu với γ-PGA nồng độ g/l để nhiệt độ 25oC; 50oC; 75oC; 100oC 125oC thời gian 30 phút Kết nghiên cứu độ nhớt γ-PGA tỷ lệ nghịch với nhiệt độ, bị tác động nhiệt độ cao độ nhớt γ-PGA giảm Mức độ giảm độ nhớt γ-PGA nhỏ khoảng nhiệt độ từ 75-100OC Đây đặc tính ưu việt sử dụng γ-PGA áp dụng cho loại sản phẩm thực tế 3.9 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ PGA 3.9.1 Nghiên cứu thông số cho sấy phun chế phẩm γ PGA Sau nghiên cứu thực nghiệm thu kết sấy phun tốt chế phẩm γ PGA bảng 3.14: Bảng 3.14 Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ PGA Chỉ tiêu Chất trợ sấy: Maltodextrin Nhiệt độ sấy Tốc độ đĩa phun Hiệu suất thu hồi Lưu lượng dịch cấp Đánh giá cảm quan Thông số 5% 160 oC 11.00-12.000 v/ph 85,8 -90,4% lít/h Bột khô, hút ẩm chậm, màu trắng, dễ lấy sau sấy phun Độ hòa tan tốt, không bị vón hòa tan 3.9.1 Đánh giá mức độ an toàn γ-PGA việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm Căn theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phụ gia thực phẩm – Chất làm dày (QCVN 4-21:2011/BYT) ban hành năm 2011 loại phụ gia làm dày Căn vào công bố sử dụng γ-PGA sản xuất từ vi khuẩn B subtilis Công ty Ajinomoto công bố đến Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa kỳ việc chấp nhận sử dụng γ-PGA từ Bacillus subtilis loại phụ gia thực phẩm an toàn Sau áp dụng quy chuẩn kỹ thuật, sản 16 phẩm γ-PGA đem phân tích kiểm nghiệm phòng thí nghiệm đươc nhà nước công nhận Từ kết phân tích số mẫu kiểm tra quan chức năng, sản phẩm γ-PGA Cục vệ sinh An toàn thực phẩm xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm cho sản phẩm PGA Liều lượng sử dụng sản phẩm sử dụng theo hướng dẫn Bộ Y tế khoảng thấp 0,1% khối lượng sử dụng 3.10 Nghiên cứu ứng dụng γ PGA ổn định nƣớc cam 3.10.1 Khảo sát chất lượng nguyên liệu Kết khảo sát thể cam nguyên liệu có tỉ lệ vitamin C cao 40mg%, hàm lượng đường tổng số mức 9,0% với hàm lượng axit hữu tổng số 0,6 % Sau đánh giá công thức, tỷ lệ phối trộn nước cam cho thấy với tỷ lệ nước cốt chiếm 30% phù hợp cho trình nghiên cứu 3.10.2 So sánh ảnh hưởng γ-PGA đến độ ổn định nước cam với phụ gia khác 3.10.2.1 Đánh giá ảnh hưởng γ-PGA phụ gia ổn định khác thông qua số huyền phù Tiến hành sử dụng γ-PGA loại phụ gia ổn định khác CMC, Xanthan Gum, Agar nồng độ 0,05%, chế biến chế độ công nghệ, sau phối chế, trùng, bảo ôn sau bảo ôn đem phân tích số huyền phù không bền theo phương pháp Krop để đánh giá mức độ phân tách sản phẩm, cho kết đồ thị hình 3.31 sau Chỉ số huyền phù không bền 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Mẫu ban đầu γ-PGA CMC Xanthan Agar ĐC Mẫu sau Mẫu sau bảo ôn Mẫu sau bảo ôn trùng 10 ngày 30 ngày 17 Hình 3.32 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng γ-PGA phụ gia thường dùng khác việc ổn định cho nước cam Chỉ số huyền phù không bền sử dụng để đánh giá độ ổn định nước cam Nếu số cao đồng nghĩa với chất lượng nước cam ổn định Trước trùng mẫu nước cam có bổ sung CMC có số huyền phù không bền thấp nên độ ổn định cao nhất, độ ổn định mẫu chứa γ-PGA thấp Tuy nhiên, sau trình trùng, độ ổn định nước cam có sử dụng γ-PGA tăng lên rõ rệt cao mẫu chứa CMC Sau trình bảo ôn số huyền phù không bền tất mẫu tăng dần phản ánh độ ổn định giảm mẫu chứa γ-PGA giữ độ ổn định cao mẫu không bổ sung hóa chất nhiều Hơn nữa, độ ổn định mẫu bổ sung γ-PGA đạt chí vượt so với mẫu bổ sung hai loại phụ gia thông dụng CMC Xanthan gum Do γ-PGA sử dụng làm phụ gia làm ổn định nước cam đầy tiềm năng, giữ cho nước cam trạng thái đồng nhất, không bị lắng cặn, tách lớpẢnh hưởng γ-PGA phụ gia ổn định nước cam thông qua biến đổi độ nhớt Các mẫu nước cam đối chứng mẫu sử dụng Aga sau thời gian bảo quản tháng có xu hướng tăng độ nhớt Đối với mẫu γPGA, CMC Xanthan Gum có độ nhớt giảm sau thời gian bảo quản, chất có cấu tạo phân cực, nước cam chúng có liên kết với nước không liên kết với phần tử huyền phù nước cam, nhờ liên kết với nước khoảng trống phần tử nước cam giảm, không cho phần tử nước cam dồn phía đáy bao bì 3.10.2.2 Ảnh hưởng γ-PGA phụ gia ổn định nước cam thông qua biến đổi độ nhớt Sự ảnh hưởng chất phụ gia đến chất lượng nước cam chất phụ gia khảo sát cho thấy số độ nhớt mẫu bị giảm sau trình trùng, điều chứng tỏ ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định cấu trúc phụ gia Lý giải cho tượng độ nhớt giảm sau thời gian bảo quan nồng độ axít nước cam ảnh hưởng đến độ bền cấu 18 trúc phân tử phụ gia gây tượng phân cắt mạch làm giảm độ nhớt 3.10.2.3 Ảnh hưởng γ-PGA đến màu sắc sản phẩm nước cam Tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung ΔE cho thấy thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy biến đổi nhiều mẫu γ-PGA, mẫu Xanthan Gum mẫu CMC xu hướng biến đổi màu sắc mẫu nước cam màu nhạt đi, thiên màu vàng, mẫu sử dụng Aga mẫu đối chứng màu sắc sản phẩm không thay đổi nhiều, nhiên có xu hướng sẫm màu, chuyển sang màu đen, giảm tính cảm quan sản phẩm 3.10.2.4 Đánh giá tính chất cảm quan sản phẩm nước cam có sử dụng γ-PGA loại phụ gia khác Kết đánh giá cảm quan tiêu chí mùi, vị trạng thái chất ổn định như: Xanthan gum, γ-PGA CMC cho điểm đánh giá cao, sản phẩm chất lượng đồng sau trình bảo ôn 3.10.3 Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam Tiến hành thí nghiệm với nồng độ γ-PGA 0,05%; 0,10%; 0,15% 0,20% sản phẩm nước cam, sau đem đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm Kết thu với nồng độ γ-PGA 0,05% cho điểm chất lượng cao nhất, có điểm cảm quan màu sắc, mùi vị hình thái cao Lựa chọn công thức tương ứng với tỷ lệ bổ sung γ-PGA cho sản phẩm 0,05% 3.10.4 Ảnh hưởng chế độ trùng tới chất lượng cảm quan nước cam Nhiệt độ 800C, 900C thời gian 5, 10, 15 phút sản phẩm có hương tốt màu sắc không đổi vàng đẹp Ở nhiệt độ 1000C thời gian phút màu sắc hương vị không đổi trùng 10 phút 15 phút sản phẩm có mùi nấu chín Do nghiên cứu đưa lựa chọn trùng nước cam nhiệt độ 900C cho trùng nước cam có sử dụng γ-PGA nồng độ 0,05% thời gian 10-15 phút 19 3.11 Nghiên cứu ứng dụng γ PGA cải thiện chất lƣợng giò 3.11.1 Ảnh hưởng loại phụ gia đến độ dẻo khối thịt xay Nghiên cứu dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo khối thịt sử dụng loại phụ gia Các phụ gia sử dụng nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate (STPP), borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) chitosan phụ gia sử dụng không sử dụng ngành chế biến thực phẩm Các phụ gia sử dụng mức giới hạn Bộ Y tế cho phép phụ gia bị cấm danh mục (hàn the) sử dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%), mục đích việc sử dụng phụ gia bị cấm nhằm so sánh, gợi mở thay đổi việc sử dụng phụ gia an toàn thực phẩm Sau thử nghiệm khối thịt xay tiến hành đo độ nhớt mẫu nghiên cứu thấy thay đổi rõ rệt độ nhớt, độ quánh mẫu sử dụng hàn the stpp, thay đổi không đáng kể độ dẻo quánh độ nhớt mẫu sử dụng γ-PGA, tinh bột biến tính chitosan 3.11.2 Ảnh hưởng loại phụ gia đến chất lượng giò 3.11.2.1 Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén lực cắt Sự thay đổi tính chất, cấu trúc khối thịt xay trình làm giò phần đánh giá mức độ ảnh hưởng loại phụ gia đến trình chế biến thực phẩm Tuy nhiên để phân tích đánh giá cấu trúc sản phẩm cần đánh giá mẫu sản phẩm cuối Các mẫu phụ gia bổ sung vào mẫu giò nghiên cứu sau chế biến điều kiện (bao gói tiêu chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ nhau) mẫu bảo ôn đem phân tích máy đo cấu trúc cho kết hình 3.36: 20 1200 2000 1000 800 1500 1000 500 LN(g) LC (g) 2500 600 LN 400 LC 200 0 Đối chứng Hàn the TBBT STPP γ-PGA Chitosan Hình 3.37 Biểu đồ lực nén lực cắt giò thành phẩm Khi kết hợp hai yếu tố lực nén lực cắt lên sản phẩm giò đánh giá mức độ giòn, cứng sản phẩm Nhìn vào biểu đồ 3.36 lực nén (LN) lực cắt (LC) máy đo cấu trúc phân tích giò thành phẩm cho thấy lực nén mẫu có sử dụng Chitosan γ PGA lớn nhất, đồng nghĩa với độ đàn hồi độ cứng giò thành phẩm tốt mẫu có lực nén gần mẫu đối chứng, mẫu bổ sung hàn the mẫu sử dụng stpp mẫu có lực nén trung bình từ 1200-1300g Mẫu có lực nén thấp mẫu sử dụng tinh bột biến tính, lực nén đo từ mẫu phản ánh chất tinh bột bổ sung vào sản phẩm giò Mẫu bổ sung tinh bột tạo cho giò bở, cấu trúc bề mặt mịn xốp Chỉ số lực cắt lực nén hai thông số thể tính chất, đặc tính sản phẩm giò, để đánh giá mức độ đồng nhất, độ đàn hồi cấu trúc giò tiến hành khảo sát lực cắt lực nén đầu đâm xuyên cách mẫu 15mm đầu P/5S để đánh giá cường lực gel mẫu sử dụng loại phụ gia khác nhau, kết cho thấy cường lực gel lớn mẫu có sử dụng chitosan thấp mẫu chứa γ PGA; STPP; Tinh bột biến tính thấp hàn the mẫu đối chứng Qua phân tích cường lực gel lần khẳng định việc sử dụng chitosan γ PGA làm phụ gia ổn định cải thiện cấu trúc sản phẩm giò lụa ưu việt an toàn 21 3.11.2.2 Đánh giá chất lượng giò sử dụng loại phụ gia tạo cấu trúc phương pháp cảm quan Các mẫu giò sau đánh giá qua phân tích lực nén, lực cắt phân tích phương pháp cảm quan để đánh giá chất lượng, kết thu cho thấy: Màu sắc sản phẩm khác biệt nhiều mẫu trình phân tích Màu sắc chia làm hai nhóm nhóm sản phẩm có màu hồng nhạt sản phẩm sử dụng hàn the, γPGA, nhóm có màu trắng nhạt gồm có mẫu đối chứng, mẫu có chứa chitosan, tinh bột biến tính mẫu chứa stpp Về mùi vị, mẫu có sử dụng γ-PGA đạt giá trị nghiệm thức cao khác biệt ý nghĩa so với mẫu đối chứng mẫu sử dụng stpp, so với mẫu sử dụng hàn the, tinh bột biến tính chitosan khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Về hình dáng, mẫu khác không đáng kể, độ giòn dai, mẫu sử dụng chitosan có giá trị nghiệm thức cao khác biệt so với mẫu lại, góc độ phân tích cảm quan độ giòn dai sử dụng tinh bột biến tính Khả sử dụng loại phụ gia thực phẩm việc ổn định cải thiện chất lượng giò thử nghiệm so sánh γPGA loại phụ gia khác sử dụng rộng rãi thị thường sản xuất, cho thấy γ-PGA có khả ổn định trạng thái, cho màu sắc đặc trưng giò tươi, thay phụ gia độc hại hàn the, tạo cấu trúc sản phẩm giò tốt sử dụng hợp chất photphat loại tinh bột biến tính Về mặt ứng dụng thực tiễn hiệu kinh tế chưa đáp ứng chitosan, góc độ định γ-PGA có khả tạo màu cho sản phẩm nên lợi γ-PGA trình ứng dụng 3.11.3 Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lượng giò Nghiên cứu ảnh hưởng γ-PGA đến khả ổn định, cải thiện cấu trúc giò cho thấy nồng độ 0,1% γ-PGA cải thiện chất lượng giò tốt phụ gia sử dụng thị trường Tuy nhiên để tối ưu nồng độ sử dụng cho sản phẩm cần có nghiên cứu sơ γ-PGA sử dụng sản phẩm giò Để khảo sát nồng độ thích hợp γ-PGA cho cải thiện ổn 22 định chất lượng giò, tiến hành thử nghiệm nồng độ γ-PGA từ đến 0,25% với bước nhảy nồng độ 0,05% sau thử nghiệm tiến hành đánh giá cảm quan đo cường lực gel mẫu nghiên cứu kết quả: Khi đem so sánh với mẫu có bổ sung γ-PGA thấy khác rõ rệt mẫu có γ-PGA Ở nồng độ từ 0,05% đến 0,15% cường lực gel mẫu có giá trị dao động từ 8582 g.mm đến 9356 g.mm Cường lực gel mẫu giò đạt giá trị cao mẫu có sử dụng γ-PGA với nồng độ 0,20% có xu hướng giảm nồng độ γ-PGA 0,25% Nhìn vào đồ thị thấy cường lực gel mẫu giò đạt cực đại nồng độ γ-PGA 0,20% Từ nghiên cứu thực tế cho thấy sử dụng γ-PGA nồng độ 0,20% làm phụ gia chế biến giò, nhằm cải thiện chất lượng giò, thay cho hàn the sử dụng tràn lan thị trường chế biến KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu, luận án thu kết sau: - Từ mẫu thực phẩm phân lập 27 chủng vi khuẩn tuyển chọn chủng B5 có khả sinh tổng hợp γ-PGA cao từ sản phẩm tương Bần Bằng phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, sinh học phân tử định tên chủng B5 B subtilis B5 - Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc Box- Bernken tìm điều kiện tối ưu chủng B subtilis B5 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất natri glutamat 25 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống 5%, nuôi tĩnh nhiệt độ 39,7oC, pH = sau thời gian 97 thu nhận γ PGA có nồng độ 25,02 g/l - Đã đưa quy trình thu nhận, tinh chế phẩm γ-PGA dạng bột: Chủng giống  Lên men  Dịch lên men  Bổ sung H2O gia nhiệt (100oC)  Tảy màu, tảy mùi  Lọc thô  Lọc tinh  Kết tủa cồn 98% (2 lần, tỷ lệ 3:1)  Thẩm tích  γ PGA Sấy phun (maltodextrin 5%, nhiệt độ 160oC 11.000 v/p, lưu lượng cấp dịch l/h)  Chế phẩm γ-PGA dạng bột 23 - Đã xác định cấu trúc số đặc tính γ-PGA: Mw>158 kDa, γ-PGA có chứa α NH+ γ COO-; tỷ lệ đồng phần D:L glutamic – 47,97:52,03; có tính chất nhớt vùng axít từ pH 2,5 đến 7,0; bền nhiệt khoảng 25 – 125oC, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm vi sinh vật hàm lượng kim loại nặng - Bước đầu ứng dụng γ-PGA 0,05% ổn định nước cam tự nhiên 0,1- 0,2% sản phẩm giò lụa cho kết tốt Chế phẩm γ-PGA dùng để thay hàn the chế biến bảo quản giò sản phẩm chế biến từ thịt khác Các hƣớng nghiên cứu tiếp tục dự kiến - Nghiên cứu ứng dụng γ PGA lĩnh vực nông nghiệp mỹ phẩm - Nghiên cứu tạo γ PGA từ phụ phẩm nhà máy chế biến thực phẩm - Nghiên cứu sản xuất túi đựng sinh học từ γ PGA 24 [...]... và hàm lượng kim loại nặng - Bước đầu ứng dụng γ- PGA 0,05% trong ổn định nước cam tự nhiên và 0,1- 0,2% trong sản phẩm giò lụa cho kết quả tốt Chế phẩm γ- PGA có thể dùng để thay thế hàn the trong chế biến bảo quản giò cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt khác Các hƣớng nghiên cứu tiếp tục dự kiến - Nghiên cứu ứng dụng γ PGA trong lĩnh vực nông nghiệp và mỹ phẩm - Nghiên cứu tạo γ PGA từ các phụ phẩm. .. KDa 3.8.2 Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ- PGA Từ γ- PGA được tạo thành từ Bacillus subtilis B5 sau khi thủy phân băng axit và làm sạch sản phẩm đến độ tinh khiết nhất định, tiến hành đo độ phân cực của hỗn hợp đồng phân quang học D và L glutamic Sau khi tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit là 47,97/52,03 trong hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh bởi Bacillus subtilis B5... quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ nhớt γ- PGA tỷ lệ nghịch với nhiệt độ, khi bị tác động của nhiệt độ càng cao độ nhớt của γ- PGA càng giảm Mức độ giảm độ nhớt của γ- PGA là rất nhỏ trong khoảng nhiệt độ từ 75-100OC Đây cũng là một đặc tính ưu việt khi sử dụng γ- PGA áp dụng cho mỗi loại sản phẩm trong thực tế 3.9 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ PGA 3.9.1 Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ PGA... gia thực phẩm an toàn Sau khi áp dụng những quy chuẩn kỹ thu t, sản 16 phẩm γ- PGA được đem đi phân tích kiểm nghiệm tại các phòng thí nghiệm đươc nhà nước công nhận Từ các kết quả phân tích cùng một số mẫu được kiểm tra tại cơ quan chức năng, sản phẩm γ- PGA đã được Cục vệ sinh An toàn thực phẩm xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm cho sản phẩm PGA Liều lượng sử dụng của các sản phẩm. .. được sử dụng trong nghiên cứu gồm γ- PGA, sodium tripolyphosphate (STPP), borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) và chitosan là những phụ gia đã được sử dụng và không được sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm hiện nay Các phụ gia được sử dụng mức giới hạn của Bộ Y tế cho phép và phụ gia bị cấm trong danh mục (hàn the) được sử dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%), mục đích của việc sử dụng phụ... 3.9.1 Đánh giá mức độ an toàn của γ- PGA trong việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm Căn cứ theo quy chuẩn kỹ thu t quốc gia về phụ gia thực phẩm – Chất làm dày (QCVN 4-21:2011/BYT) ban hành năm 2011 đối với các loại phụ gia làm dày Căn cứ vào công bố sử dụng γ- PGA sản xuất từ vi khuẩn B subtilis của Công ty Ajinomoto đã công bố đến Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ về việc chấp nhận sử dụng γ- PGA... trình nghiên cứu, luận án đã thu được kết quả cơ bản sau: - Từ các mẫu thực phẩm đã phân lập được 27 chủng vi khuẩn và đã tuyển chọn được chủng B5 có khả năng sinh tổng hợp γ- PGA cao từ sản phẩm tương Bần Bằng phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, sinh học phân tử đã định tên được chủng B5 là B subtilis B5 - Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố và phương pháp quy hoạch thực nghiệm... thế của γ- PGA trong quá trình ứng dụng 3.11.3 Khảo sát nồng độ γ- PGA đến chất lượng của giò Nghiên cứu về ảnh hưởng của γ- PGA đến khả năng ổn định, cải thiện cấu trúc của giò cho thấy ở nồng độ 0,1% γ- PGA cải thiện được chất lượng giò tốt hơn các phụ gia hiện đang sử dụng trên thị trường Tuy nhiên để tối ưu nồng độ sử dụng cho sản phẩm cần có những nghiên cứu sơ bộ về γ- PGA khi sử dụng trong sản phẩm. .. trình tổng hợp γ- PGA Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h và bắt đầu giảm khi đi vào cuối pha cân bằng Điều này có thể thấy sự tạo thành sinh khối mạnh sau 48h lên men đã tạo ra lượng enzim PGA synthetase lớn làm xúc tác cho quá trình tổng hợp γ- PGA Trong giai đoạn cuối pha cân bằng một phần γ- PGA được vi khuẩn sử dụng làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm Trong toàn bộ quá trình sinh. .. nguồn gốc chủng giống sinh tổng hợp γ- PGA là Bacillus subtilis 3.8.3 Nghiên cứu tính bền axit của γ PGA Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất của γ PGA trên các môi trường axit citric có nồng độ từ 0 – 30g/l qua việc xác định độ nhớt của dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nồng độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm của γ PGA tại nồng độ 1 g/l Kết quả khi nồng độ axit tăng (độ pH giảm) ... axit poly γ glutamic từ vi sinh vật Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp. .. giống cho trình nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp γ PGA 3.3.1 .Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ PGA Những nghiên cứu sinh tổng hợp γ PGA cho thấy... tổng hợp γ PGA từ sản phẩm thực phẩm Khảo sát tối ưu điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic Tinh sạch, thu nhận khảo sát đặc điểm axit poly γ glutamic Bước đầu ứng dụng thử