BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN PHƯƠNG LOAN ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN PHƯƠNG LOAN ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS PHẠM THANH LIÊM TS BÙI MINH TÂM 2016 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn - Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp – TNTN, Phòng Quản trị Thiết bị, Bộ môn Thuỷ Sản, Trƣờng Đại học An Giang cho phép tạo điều kiện thuận lợi để tham gia học tập triển khai thực nghiên cứu trƣờng - Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học, Phòng Quản lý khoa học tất quý Thầy Cô Khoa Thuỷ Sản, Trƣờng Đại học Cần Thơ quan tâm giúp tham gia hoàn thành chƣơng trình học tập dành cho nghiên cứu sinh - Ban Giám đốc, Phòng Quản lý Khoa học - Sở Khoa học & Công nghệ Tỉnh An Giang hỗ trợ kinh phí thực số nội dung luận án Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Thanh Liêm TS Bùi Minh Tâm tận tình hƣớng dẫn khoa học, động viên giúp đỡ suốt trình thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận án Tôi biết ơn giúp đỡ chân tình quý Thầy Cô sở đào tạo: PGS.TS Nguyễn Tƣờng Anh, ThS Nguyễn Văn Tƣ, PGS.TS Lam Mỹ Lan, TS Dƣơng Thúy Yên, TS Lý Văn Khánh, TS Lê Quốc Việt, ThS Nguyễn Thị Kim Hà, ThS Lê Công Quyền tất quý Thầy Cô Khoa Thủy Sản truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình hỗ trợ thời gian tham gia học tập hoàn thành luận án Xin cảm ơn GS.TS Nguyễn Anh Tuấn, PGS.TS Trƣơng Quốc Phú, TS Phạm Trƣờng Yên, PGS.TS Nguyễn Văn Kiểm, TS Nguyễn Tuần PGS.TS Đỗ Thị Thanh Hƣơng có góp ý chân thành sâu sắc nội dung luận án Hội đồng bảo vệ luận án cấp sở Cuối cùng, lời cảm ơn đến gia đình động viên hỗ trợ nhiều suốt thời gian học tập nghiên cứu Xin ghi nhận cảm ơn tất ngƣời giúp đỡ, động viên chia sẻ để hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! i TÓM TẮT Nghiên cứu “Đặc điểm thành thục sinh dục ứng dụng hormon steroid sinh sản nhân tạo cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851)” đƣợc thực Khoa Thuỷ Sản, Trƣờng Đại học Cần Thơ Khoa Nông Nghiệp - Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trƣờng Đại học An Giang thời gian từ năm 2011-2014 Mục tiêu luận án nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản tiêu sinh lý cá rô biển, làm sở khoa học cho việc xây dựng quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tƣợng này; đồng thời so sánh tác dụng xác định loại, liều lƣợng hormon steroid (17,20P; 17P P) với chất kích thích sinh sản thông thƣờng (HCG LRH-A+DOM) sinh sản nhân tạo cá rô biển Mẫu cá rô biển dùng để nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản đƣợc thu tự nhiên dọc theo tuyến sông Hậu thuộc địa bàn Tỉnh An Giang Cá đƣợc đánh bắt từ đống chà với ngƣ cụ nhƣ cào, dớn, lƣới bén, lú… ngƣ dân Mẫu cá đƣợc thu điểm chợ địa bàn Định kỳ thu mẫu lần/tháng thu khoảng 30 cá thể cỡ khác suốt 12 tháng Kết nghiên cứu cho thấy, cá rô biển bắt đầu thành thục sinh dục đạt chiều dài 11,68 cm Tỷ lệ đực:cái mẫu cá rô biển thu địa bàn tỉnh An Giang 1:1,58 Hệ số thành thục cá rô biển vào mùa sinh sản cao đạt 14,68% cá rô biển đực 4,75% Mùa vụ sinh sản cá rô biển chủ yếu tập trung vào tháng 5, 6, 7, dƣơng lịch Sức sinh sản tƣơng đối trung bình cá rô biển 453.314 trứng/kg sức sinh sản tuyệt đối đạt 41.884 trứng/cá Kết nghiên cứu tiêu sinh lý cá rô biển cho thấy, trình phát triển tuyến sinh dục chịu tác động nguồn protein từ gan Hàm lƣợng vitellogenin cá rô biển cao (74,01-148,42 µg ALP/mg protein) thay đổi theo giai đoạn phát triển tuyến sinh dục Hàm lƣợng protein gan cá rô biển đực khoảng từ 22,4-32,4 39,3-53,2 mg protein/g mẫu tƣơi không chịu ảnh hƣởng phát triển tuyến sinh dục Nghiên cứu nuôi vỗ cá rô biển giai lƣới đặt ao đất với mật độ 0,5 kg/m2 loại thức ăn cá tạp, thức ăn công nghiệp 35% protein cá tạp kết hợp thức ăn công nghiệp (tỷ lệ 50%:50% theo khối lƣợng) Kết nghiên cứu cho biết, cá rô biển thành thục sinh dục tốt điều kiện nuôi vỗ khác biệt hệ số thành thục sinh dục cá đƣợc cho ăn loại thức ăn Nghiên cứu khả gây chín noãn bào cá rô biển loại hormon steroid 17,20P; 17P P đƣợc thực cá nuôi vỗ thành thục sinh dục ii (tuyến sinh dục giai đoạn IV), khối lƣợng từ 50-100 g/con Cá đƣợc tiêm 17,20P với liều lƣợng 3, mg/kg cá; 17P với liều 7, 10 15 mg/kg cá P với liều 10, 15 20 mg/kg cá Kết nghiên cứu xác định đƣợc loại steroid C21 gây chín noãn bào cá rô biển; đó, 17,20P có hiệu cao liều mg/kg, 17P liều 10 mg/kg P liều 15 mg/kg cá với tỷ lệ noãn bào chín có giá trị lần lƣợt 92,22%, 75,55% 73,33% Nghiên cứu chứng minh, cá rô biển đƣợc kích thích sinh sản liều định 17,20P, 17P P sau liều sơ HCG LRHA3+DOM đạt hiệu sản xuất; 17,20P liều mg/kg cá có hiệu với tỷ lệ cá đẻ đạt 86,67% Quá trình phát triển cá rô biển giai đoạn phôi đến 30 ngày tuổi rằng; điều kiện nhiệt độ dao động từ 27-31oC, pH 6,8-7,0 hàm lƣợng ôxy hòa tan từ ppm trở lên thời gian phát triển phôi cá từ 13-14 Cá nở có chiều dài trung bình 1,84±0,02 mm Thời gian cá dinh dƣỡng noãn hoàng 72 giờ; sau hết noãn hoàng, cá có chiều dài trung bình 3,17±0,08 mm, cỡ miệng 90o 382,96±56,53 µm Ống tiêu hoá cá rô biển phân biệt đƣợc xoang miệng, thực quản, dày ruột cá đƣợc ngày tuổi ống tiêu hóa phát triển hoàn chỉnh giống cá trƣởng thành thời điểm 20 ngày tuổi Nhiệt độ dƣới gây chết cá rô biển lần lƣợt 15,2-15,7oC 40,342,9oC; ngƣỡng ôxy tiêu hao oxygen cá rô biển có xu hƣớng giảm dần theo ngày tuổi, ngƣỡng ôxy tiêu hao oxygen dao động khoảng từ 0,80 mg O2/L 2,34 mg O2/g.giờ (cá ngày tuổi) đến 0,54 mg O2/L 0,26 mg O2/g.giờ (cá 30 ngày tuổi) pH cao thấp gây chết cá rô biển nằm khoảng 9,0-9,6 3,0-3,4 Độ mặn gây chết cá rô biển nằm khoảng 11,1-11,8‰ iii ABSTRACT Study on the "Characteristics of sexual maturity and application of steroid hormones in artificial propagation of Malayan leaffish Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851)" was carried out at the College of Aquaculture and Fisheries - Can Tho University and the College of Agriculture and Natural Resources - An Giang University from 2011 to 2014 Main objectives of the study were to investigate the biologically reproductive characteristics and physiological parameters in order to provide basic scientific data for establishing the procedure of artificial seed production of Malayan leaffish, as well as to find out suitable method and dosage of steroid hormones (17,20P, 17P and P) in comparison with traditional reproductive stimulants (HCG and LRH-A+DOM) for induced spawning the fish Malayan leaffish used for biologically reproductive study was collected from the wild along the Hau River of An Giang province Fish samples were caught from piles of scrub along the river and by a variety of fishing tools such as bottom trawl net, fixed net, gillnet, fykes and traps The samples were also collected in fish markets Thirty fish at different size were collected monthly for 12 months Results showed that P fasciata reached first sexual maturity at a length of 11.68 cm The female-male ratio of the samples in An Giang area was 1:1.58 Highest gonado-somatic index (GSI) of female and male fish in spawning season reached up to 14.68% and 4.75%, respectively Main spawning season was in first half of rainy season, from May to August yearly Average relative fecundity of the females was 453,314 eggs/kg and absolute fecundity was 41,884 eggs/female Results on biologically reproductive characteristics showed that ovary development was affected by protein sources from muscle and liver The concentration of vitellogenin was high, ranged from 74.01 to 148.42 µg ALP/mg protein and varied according to the stages of ovary development The protein concentration in muscle and liver of male fish ranged from 22.4 to 32.4 and from 39.3 to 53.2 mg protein/g, respectively These values were not affected by stage of testis development For broodstock rearing, breeders were stocked in hapas suspended in earthen ponds at the density of 0.5 kg/m2 and fed with three different types of feed namely trash fish, commercial pellet (containing of 35% crude protein), and the combination of 50% trash fish and 50% commercial pellet It was found that P fasciata could reach fully sexual maturity in the captive iv conditions There was no statistical difference in the GSI of the breeder groups fed with three different types of feed The study on ability of final oocyte maturation (FOM) induced by three steroid hormones namely 17.20P, 17P and P was carried out on matured female fish (stage IV of gonad development) having body weight of 50-100 g reared in captive conditions The females were injected with 17.20P (3, 4, mg/kg), 17P (7, 10, 15 mg/kg), and P (10, 15, 20 mg/kg), respectively Results revealed that all three types of steroid C21 hormones could induce FOM; of which 17,20P showed highest effectiveness at the dose of mg/kg; 17P at the dose of 10 mg/kg; and P at the dose of 15 mg/kg with a FOM rate of 92.22%, 75.55% and 73.33%, respectively The study also pointed out that successfully induced spawning by using 17.20P, 17P or P after a preliminary injection of HCG or LRH-A+DOM was achieved and satisfied practical production requirements Particularly, the dose of mg/kg of 17.20P was the most effectiveness among steroid treatments with an ovulation rate of 86.67% The early ontogeny of P fasciata showed that embryonic development took place about 13-14 hours at water temperature of 27-31oC, pH of 6.8-7.0 and dissolved oxygen concentration of ppm or higher Newly hatched larvae were 1.84±0.02 mm in body length Within 72 hours after hatching, larvae reached 3.17±0.08 mm in mean body length; mouth gape (at angle of 90o) was 382.96±56.53 µm; and yolk was completely consumed Three days post hatching, four parts of digestive tract could be distinguished as buccal pharynx, oesophagus, stomach and intestine The digestive tract reached full function at the day of 20th post hatching Lower and upper lethal temperatures of P fasciata were 15.2-15.7oC and 40.3-42.9oC, respectively There was a negative relationship between dissolved oxygen threshold and oxygen consumption, and age Dissolved oxygen threshold was of 0.80-0.54 mg /L and dissolved oxygen consumption was of 2.34 mg /g.h (1-day old fish) to 0.26 mg /g.h (30-day old fish) Low and high lethal pH values of the fish were 9.0-9.6 and 3.0-3.4, respectively Lethal salinity of the fish was 11.1-11.8‰ v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án hoàn thành dựa kết nghiên cứu khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh “Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất giống cá rô biển (Pristolepis fasciata) An Giang” từ nguồn kinh phí Sở Khoa học Công nghệ tỉnh An Giang Tất số liệu kết trình bày luận án trung thực chƣa công bố luận án cấp khác Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Tác giả PHAN PHƢƠNG LOAN vi vii MỤC LỤC Trang Chƣơng 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa luận án 1.5 Những điểm luận án Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sinh học cá rô biển 2.1.1 Hình thái phân loại 2.1.2 Phân bố 2.1.3 Tập tính dinh dƣỡng 2.1.4 Đặc điểm sinh trƣởng 2.1.5 Đặc điểm sinh sản 2.2 Quá trình phát sinh noãn hoàng (Vitellogenesis) 2.3 Vai trò thức ăn nuôi vỗ thành thục sinh dục cá 11 2.4 Vấn đề sử dụng chất kích thích sinh sản nhân tạo cá 13 2.4.1 Cơ chế hormon kiểm soát trình tạo trứng cá 13 2.4.2 Nguyên lý chung kích thích sinh sản cá 16 2.4.3 Các chất kích thích sinh sản đƣợc sử dụng phổ biến sản xuất nhân tạo cá giống 17 21 2.4.4 Các steroid C gây chín noãn bào cá ứng dụng 20 2.5 Ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng đến hoạt đống sống cá 28 2.5.1 Nhiệt độ 28 2.5.2 pH 31 2.5.3 Ôxy hoà tan 33 2.6 Kỹ thuật mô học ứng dụng nghiên cứu mô học cá 35 2.7 Quá trình phát triển ống tiêu hoá cá 41 Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 45 3.2 Đối tƣợng nghiên cứu 45 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản cá rô biển 45 3.3.1.1 Phƣơng pháp thu mẫu 45 3.3.1.2 Các tiêu phân tích 45 3.3.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh lý sinh sản cá rô biển 47 3.3.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu 47 3.3.2.2 Các tiêu phân tích 48 viii B3 KÍCH THÍCH SINH SẢN BẰNG 17,20P, 17P VÀ P SAU KHI TIÊM LRHA3+DOM  Thời gian hiệu ứng N Total 3 3 12 Between Groups Within Groups Total Std Std Mean Deviation Error 632,67 5,508 3,180 546,00 7,000 4,041 640,00 7,000 4,041 630,67 5,132 2,963 612,33 40,513 11,695 Sum of Squares df 17745,333 309,333 18054,667 11 95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum 618,99 646,35 627 638 528,61 563,39 538 551 622,61 657,39 632 645 617,92 643,41 625 635 586,59 638,07 538 645 Mean Square F 5915,111 38,667 Sig 152,977 ,000  Tỷ lệ rụng trứng N Total 3 3 12 Std Std Mean Deviation Error 1,3563 ,37153 ,21450 1,1418 ,37153 ,21450 ,8327 ,16385 ,09460 ,7381 ,16385 ,09460 1,0172 ,35507 ,10250 Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df ,727 ,660 1,387 95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum ,4334 2,2792 ,93 1,57 ,2189 2,0647 ,93 1,57 ,4257 1,2397 ,64 ,93 ,3311 1,1451 ,64 ,93 ,7916 1,2428 ,64 1,57 Mean Square 11 F ,242 ,082 Sig 2,941 ,099  Sức sinh sản N Total 3 3 12 Between Groups Within Groups Total Std Std Mean Deviation Error 150,4667 8,94725 5,16570 145,4000 7,98999 4,61303 148,4500 4,59429 2,65251 148,2233 11,78807 6,80584 148,1350 7,66924 2,21392 Sum of Squares df 39,072 607,919 646,991 95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum 128,2405 172,6929 140,20 156,60 125,5518 165,2482 136,60 152,20 137,0372 159,8628 145,60 153,75 118,9402 177,5065 139,67 161,67 143,2622 153,0078 136,60 161,67 Mean Square F 13,024 75,990 11 Sig ,171 ,913  Tỷ lệ thụ tinh N Total 3 3 12 Std Std Mean Deviation Error 1,0695 ,03152 ,01820 1,1962 ,04581 ,02645 1,1209 ,04084 ,02358 ,9862 ,04597 ,02654 1,0932 ,08734 ,02521 Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df ,070 ,014 ,084 95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum ,9912 1,1478 1,04 1,10 1,0824 1,3100 1,14 1,22 1,0195 1,2224 1,10 1,17 ,8720 1,1004 ,94 1,04 1,0377 1,1487 ,94 1,22 Mean Square 11 F ,023 ,002 Sig 13,612 ,002  Tỷ lệ nở N Total 3 3 12 Std Std Mean Deviation Error 1,1276 ,01358 ,00784 1,2234 ,02942 ,01699 1,1541 ,05939 ,03429 ,9624 ,04559 ,02632 1,1169 ,10594 ,03058 Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df ,110 ,013 ,123 95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum 1,0939 1,1613 1,12 1,14 1,1503 1,2965 1,19 1,25 1,0065 1,3016 1,12 1,22 ,8491 1,0757 ,91 1,00 1,0496 1,1842 ,91 1,25 Mean Square 11 F ,037 ,002 Sig 22,065 ,000  Tỷ lệ sống cá bột N Total 3 3 12 Std Std Mean Deviation Error 1,0908 ,03278 ,01893 1,2038 ,01629 ,00941 1,1123 ,01295 ,00747 1,0098 ,01080 ,00623 1,1042 ,07417 ,02141 Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df ,057 ,003 ,061 95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum 1,0093 1,1722 1,06 1,12 1,1633 1,2443 1,19 1,22 1,0801 1,1445 1,10 1,12 ,9829 1,0366 1,00 1,02 1,0570 1,1513 1,00 1,22 Mean Square 11 F ,019 ,000 Sig 47,013 ,000 C CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU Phụ lục 3.1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MÔ HỌC Tiêu mô học buồng trứng thực theo qui trình xử lý mẫu nhuộm Hematoxylin Eosin (Hinton, 1990) theo phương pháp mô học chuẩn (Standard histological techniques) Drury and Wallington (1967); Kiernan (1990) Tuyến sinh dục cá cố định dung dịch Bouin trung tính, thời gian cố định 24 giờ, sau lấy mẫu rửa vòi nước phút, chuyển mẫu sang dung dịch cồn 70%, sau cố định tuyến sinh dục cắt thành phần nhỏ với độ dầy 3-5 mm cho vào histocasset ngâm cồn 70% đến xử lý Qui trình xử lý mẫu Hóa chất Cồn 80% Cồn 95% Cồn 100% Cồn 100% Cồn 100% Xylen Xylen Xylen Paraffin + Xylen (5:5) Paraffin + Sáp ong (5:5) Paraffin + Sáp ong (7:3) Thời gian 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 Đúc khối: sau xử lý đặt mẫu khung paraffin khoảng 30 phút để mẫu ngấm paraffin tốt; dùng kẹp gắp mẫu đặt khung inox định hướng mẫu cho đổ paraffin nóng chảy (57-600C) vào khuôn đồng thời làm lạnh khuôn để mẫu cố định vững ấn cho mẫu sát vào đáy khuôn tiếp tục đổ paraffin vào đầy khuôn; đặt khung mẫu vào ngăn lạnh hay tủ lạnh để paraffin đặc lại; lấy khối mô khỏi khuôn đặt vào tủ lạnh để làm rắn lại Cắt mẫu: mẫu cắt thành băng dài mỏng máy cắt (microtome) với độ dày 4-6 µm; dùng kim mũi giáo tách lấy đoạn mẫu không bị vỡ đặt lát cắt lên lam nhỏ sẵn nước ấm (45-500C) cho lát cắt căng ra; đặt lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45500C thời gian 12-24 để paraffin tan mẫu khô Nhuộm dán mẫu: dán lame vào vùng có mẫu lam keo Canada balsam làm khô mẫu Hóa chất Xylen Xylen Xylen Cồn 100% Cồn 100% Cồn 70% Rửa nước Haematoxylin Rửa nước Rửa nước Eosin Cồn 95% Cồn 100% Cồn 100% Xylen Xylen Thời gian phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút 15 phút Đọc kết quả: tiêu quan sát kính hiển vi với vật kính có độ phóng đại 10X, 20X, 40X chụp hình tiêu đặc trưng để xác định giai đoạn phát triển tuyến sinh dục Phụ lục 3.2 CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN SINH DỤC Quá trình phát triển tuyến sinh dục cá xác định sở quan sát hình dạng, kích cỡ màu sắc tuyến sinh dục theo bậc thang thành thục sinh dục Xakun and Buskaia (1968) phân chia bậc sau: Tuyến sinh dục cá Giai đoạn I II III Mô tả Chỉ gặp cá thể thành thục lần đầu, buồng trứng hai sợi nhỏ mãnh mô liên kết chưa phát triển Chúng nằm sát dọc hai bên xương sống Màu trắng hay trắng xám mạch máu chưa phát triển Mắt thường không phân biệt đực Buồng trứng giai đọan có hình dẹp bằng, kích thước lớn nhiều giai đọan I mô liên kết phát triển Mạch máu tăng số lượng kích thước buồng trứng có màu trắng hồng hay hồng nhạt Thể tích buồng trứng tăng lên nhanh Bề mặt buồng trứng có màu xám IV V VI nhạt trắng hồng nhạt Mắt thường phân biệt tế bào trứng, tế bào trứng khó tách khỏi trứng Đường kính tế bào trứng 250-500 µm Các tế bào trứng gần mạch máu thường có kích thước lớn tế bào xa Buồng trứng giai đọan tồn với thời gian dài (1-3 tháng) Hệ số thành thục 3-6% Thể tích buồng trứng chiếm 2/3 thể tích xoang bụng Buồng trứng có màu xám nhạt trắng xám Hạt trứng tròn căng dễ tách khỏi trứng Buồng trứng trở nên mềm Hệ số thành thục đạt giá trị cực đại chiếm tới 22% khối lượng thể Buồng trứng tình trạng sinh sản, đại đa số tế bào trứng chín rụng Ngoài buồng trứng chứa nang trứng tế bào trứng giai đọan I, II, III Toàn buồng trứng mềm nhão, bề mặt tế bào trứng có màu đỏ bầm tượng xuyết huyết Buồng trứng đẻ xong trở nên mềm nhão, teo nhỏ lại Trong lòng buồng trứng chứa đày nang trứng số trứng rụng không đẻ với tế bào trứng giai đọan đầu trình tạo trứng Khi trình thoái hóa xảy ra, nang trứng tự biến thành số tổ chức nội tiết để tham gia vào trình Kết thúc thoái hóa buồng trứng trở giai đoạn II III tùy loài Tuyến sinh dục cá đực Giai đoạn Mô tả Chỉ gặp cá thể thành thục lần đầu chưa phân biệt đực Tinh sào nhỏ hai sợi nhỏ nằm sát hai bên xương sống, bên không thấy I túi sinh tinh Trên lát cắt kính hiển vi, thấy tinh nguyên bào nằm bào nang thời kỳ sinh sản Tinh sào có dạng hai dải mỏng có màu hồng nhạt (có thể từ giai đoạn I phát triển II lên từ giai đoạn VI sau thoái hóa) Về mặt tổ chức học thấy rõ túi sinh tinh, tế bào sinh dục đực thời kỳ sinh trưởng Tinh sào có màu trắng phớt hồng, cuối giai đoạn có màu trắng ngà Trong ống dẫn tinh chứa đầy bào nang có tế bào sinh dục thời kỳ phát triển Khoảng cách ống dẫn tinh hẹp Về mặt tổ chức học, III ống dẫn tinh có nhiều túi nhỏ trình tạo tinh xảy mạnh mẽ Trong tinh sào có tinh nguyên bào, tinh bào cấp I, tinh bào cấp II, tinh tử tinh trùng Dùng dao cắt ngang tinh sào mép cắt phẳng (không bị tù) dao (không dính tinh dịch) Tinh sào có màu trắng sữa, đạt kích thước lớn nhất, bên chứa tinh tử tinh trùng, tinh bào sơ cấp, trình tạo tinh kết thúc Trong ống dẫn tinh chứa đầy tinh trùng chín muồi thoát khỏi bào nang tinh nguyên bào IV (là nguồn dự trữ cho chu kỳ sau) Ở giai đoạn này, tinh trùng dễ dàng thoát có tác động học cá quẫy mạnh Nếu dùng dao cắt ngang tinh sào mép cắt không phẳng mà tù, dao có dính tinh dịch V VI Tinh sào cá trạng thái sinh sản Tinh trùng chứa đầy ống dẫn tinh Ngoài ống dẫn tinh có lượng đáng kể tế bào sinh dục phase trước Là giai đoạn tinh sào cá sinh sản xong Bề mặt tinh sào có màu đỏ hồng nhạt, mềm nhão Trong ống dẫn tinh tinh trùng chín, bào nang có tế bào sinh dục phase phát triển khác Phụ lục 3.3 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU MÁU CÁ Đa số loài cá xương có hệ thống tuần hoàn giống bao gồm tim, thống động mạch hệ thống tĩnh mạch nối liền với Máu lấy từ động mạch cuống đuôi ống tiêm nhựa tích mL với đầu kim tiêm nhỏ, gồm bước sau: - Trước lấy mẫu máu, ống tiêm kim tiêm tráng qua heparin (heparin chất chống đông máu – anticoagulant sử dụng người); ống tiêm kim tiêm sử dụng riêng cho mẫu cá - Ống chứa máu 1,5 mL (ependoff) chuẩn bị riêng cho mẫu - Lượng máu lấy cá khoảng mL giữ lạnh nước đá suốt thời gian lấy mẫu - Sau lý tâm lạnh 40C vòng phút (6.000 vòng/phút) - Dùng ống tiêm nhựa tích 1ml hút phần huyết tương (bỏ phần cô đặc) cho vào ependoff 0,5ml trữ tủ -800C phân tích tiêu protein phosphat protein huyết tương (vitellogenin) Phụ lục 3.4 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM HỒNG CẦU Hồng cầu đếm buồng đếm Neubauser sử dụng phương pháp pha loãng mẫu máu (được lấy trực tiếp từ cá) 200 lần với dung dịch Natt-Herrick (gồm 3,88 g NaCL; 2,5 g Na2SO4; 2,91 g Na2HPO4.12H2O; 0,25 g KH2PO4; 7,5 mL Formalin 37% 0,1 g methylviolet pha thành 1000 mL; để qua đêm sau lọc qua giấy lọc chuẩn pH mức 7,3) Dùng pipet cho µl máu thu cho vào ependoff có chứa 995 µl dung dịch NattHerrick sau trộn đều; Dùng pipet cho dung dịch vào buồng đếm neubauer Đếm số lượng hồng cầu có ô lớn (mỗi ô lớn chứa 16 ô nhỏ) tổng số 25 ô có buồng đếm Số lượng hồng cầu H (tế bào/mm3) = (Cx200/80) x (0,00025x 106) Trong đó: C tổng số hồng cầu đếm vùng ô đếm (80 ô) 200: số lần pha loãng; 0,00025: thể tích ô đếm Phụ lục 3.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỶ LỆ HUYẾT CẦU (HEMATOCRIT, %), THỂ TÍCH HỒNG CẦU Phương pháp xác định tỷ lệ huyết cầu (Hematocrit, %): Máu thu cá thể cá rô biển cho vào ống thủy tinh để đo tỷ lệ huyết cầu Ly tâm máy ly tâm chuyên dùng phút với tốc độ 12.000 vòng/phút; dùng thước đo có chia vạch từ 1-100% để xác định tỷ lệ huyết cầu (Larsen and Snieszko, 1961 trích dẫn từ Đỗ Thị Thanh Hương Nguyễn Văn Tư, 2010) Các số có liên quan đến huyết cầu tính dựa theo phương pháp Weinberg et al., 1972 trích dẫn từ Đỗ Thị Thanh Hương Nguyễn Văn Tư (2010) Thể tích hồng cầu (MCV) MCV (µm3) = 10 x[tỷ lệ huyết cầu(%)/số lượng hồng cầu (106/mm3) Phụ lục 3.6 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN Phương pháp thu mẫu gan cá: Mẫu hay gan cá để xác định hàm lượng protein thu bảo quản theo trình tự sau: - Ống chứa hay gan cá (ependoff 1,5 mL) chuẩn bị riêng cho loại mẫu riêng - Mẫu hay gan thu khoảng 0,1 - 0,3 gam cho vào ống ependoff 1,5 mL giữ lạnh nước đá suốt thời gian lấy mẫu - Nghiền mẫu hay gan mL dung dịch phosphate 50 mM KH2PO4/K2HPO4 50 mM (pH 7,5) - Ly tâm lạnh 40C vòng 10 phút (10.000 vòng/phút) - Lấy phần nước cho vào ống ependoff 0,5 mL trữ tủ -800C phân tich tiêu protein Phương pháp phân tích protein cơ, gan: lượng protein xác định theo phương pháp Lowry ctv, (1951), sử dụng Albumine bovine (BSA, sigma) làm đường chuẩn Chuẩn bị hóa chất BSA: 10 mg/mL H2O Hỗn hợp A: 150 mL Na2CO3 + 1,5 mL CuSO4 1% + 1,5 mL NaK Tartrate 2% Folin: 10 mL Folin + 10 mL H2O Quá trình phân tích protein Đường chuẩn Hóa chất mg protein BSA (µl) Mẫu (µl) H2O (µl) NaOH 1N -500 500 0,05 mg protein -495 500 0,1 mg protien 0,2 mg protien 0,5 mg protien Mẫu 10 -490 500 20 -480 500 50 -450 500 -10 490 500 Ủ 30-120 phút Hỗn hợp A (mL) 5 5 5 Ủ 15 phút Folin (µl) 500 500 500 500 500 500 Ủ 30 phút Đọc bước sóng 660 nm Dựa vào đường chuẩn Albumin bovine cho phép xác định protein (mg Protein/mL huyết tương) có mẫu Phụ lục 3.7 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG PHOSPHATE PROTEIN HUYẾT TƯƠNG (VITELLOGENIN) Phương pháp: Hàm lượng vitellogenin xác định thông qua hàm lượng phosphate protein huyết tương (phần lớn hàm lượng phosphate protein huyết tương hàm lượng vitellogenin Trong hầu hết loài động vật có xương sống, vitellogenin có chứa 1,4% phosphate) Hàm lượng phosphate protein huyết tương xác định phương pháp ALKALI-LABILE PHOSPHATE (ALP) dựa vào đường chuẩn phosphorus standard so màu bước sóng 660 nm Hóa chất phân tích Acid Molybdate: 0,625 mg Amonium molyddate/50 mL H2SO4 2,5M Reducer: 1,58g/10 mL H2S TCA 20%: 20g Trichloro acetic acid/100 mL H2O NaOH 2N: 8g/100 mL H2O HCl 2N: 83,4 mL/16,6 mL HCl Ethanol absolute Acetone Diethylether Chloroform Quá trình phân tích sau: 30 µl plasma + mL TCA 20% 15 phút Ly tâm 10 phút (40C): RMP = 3.300 rpm Dùng pipet lấy phần cô đặc 1ml Ethanol Để vào nước nóng 600C vòng 10 phút Ly tâm phút (40C); RPM = 8.000rpm Lấy phần cô đặc 1mL chloroform: mL diethylether: mL ethanol phút Ly tâm phút (40C); RPM = 8.000 rpm Lấy phần cô đặc mL aceton phút Ly tâm phút (40C); RPM = 8.000 rpm Lấy phần cô đặc 1mL diethylether phút Ly tâm phút (40C); RPM = 8.000 rpm Lấy phần cô đặc sấy khô khoảng (50-600C) 500µl NaOH 2N Để vào nước nóng 1000C 15 phút Lấy để nguội 500µl NaCl 2N Dùng pipet hút 400 µl cho vào ống nghiệm tiến hành sau: Mẫu Mẫu Phosphorus Standard Nước Acid Molybdate Reducer Tổng 400 400 200 50 1.050 µg/l 800 200 50 1.050 0,2 µg/l 10 790 200 50 1.050 0,5 µg/l 25 775 200 50 1.050 µg/l 50 750 200 50 1.050 µg/l 100 700 200 50 1.050 µg/l 200 600 200 50 1.050 µg/l 300 500 200 50 1.050 Đường chuẩn Chờ 10 phút So màu bước sóng 660 nm Thiết lập phương trình cho mẫu chuẩn từ dựa đường chuẩn độ hấp thu để tính toán hàm lượng ALP (µg ALP/mL huyết tương) mẫu Kết µg ALP/mL huyết tương phosphate protein huyết tương = µg ALP = mg protein/mL huyết tương mg protein [...]... liệu mới về các đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển như: xác định được chiều dài thành thục sinh dục đầu tiên của cá là 11,68 cm; hệ số thành thục sinh dục (cao nhất ở cá cái là 14,68%, ở cá đực là 4,75%); Sức sinh sản tương đối trung bình của cá rô biển là 453.514 trứng/kg và sức sinh sản tuyệt đối đạt 41.884 trứng /cá cái, mùa vụ sinh sản của cá rô biển tập trung vào các tháng 5, 6, 7 và 8 dương... thành thục sinh dục cá rô biển 91 4.3.2 Sự thành thục sinh dục của cá rô biển trong quá trình nuôi vỗ 93 4.3.2.1 Biến động giai đoạn thành thục sinh dục của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ 93 4.3.2.2 Biến động hệ số thành thục sinh dục của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ 95 4.3.2.3 Biến động đƣờng kính noãn bào cá rô biển theo thời gian nuôi vỗ 94 4.3.3 Nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá rô biển. .. VÀ THẢO LUẬN 64 4.1 Một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển 64 4.1.1 Phân biệt giới tính 64 4.1.2 Tỷ lệ đực cái, khối lƣợng, chiều dài của cá qua các tháng thu mẫu 65 4.1.3 Đặc điểm hình thái tuyến sinh dục cá rô biển cái và đực 67 4.1.3.1 Đặc điểm tuyến sinh dục cái (buồng trứng) 67 4.1.3.2 Đặc điểm tuyến sinh dục đực (buồng tinh) 69 4.1.4 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục cá rô biển. .. Với các lý do trên, đề tài Đặc điểm thành thục sinh dục và ứng dụng hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) được thực hiện 2 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát Bổ sung dữ liệu khoa học về các đặc điểm sinh học của cá rô biển, về khả năng gây chín và rụng trứng của hormon steroid trên cá rô biển, cung cấp cơ sở lý luận để phát triển quy trình sản. .. và P) với chất kích thích sinh sản thông thường (HCG và LHRHa+DOM) và xác định loại, liều lượng các hormon steroid trong kích thích sinh sản nhân tạo cá rô biển 1.3 Nội dung nghiên cứu 1 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển 2 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý của cá rô biển 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn nuôi vỗ lên sự thành thục sinh dục của cá rô biển 4 Nghiên cứu xác định... cá rô biển bố mẹ 49 Hình 3.4 Vi bụng cá đực (trái) và cá cái (phải) 49 Hình 3.5 Các loại hormon steroid sử dụng trong nghiên cứu 53 Hình 3.6 Cách tiêm hormon cho cá 53 Hình 3.7 Cách đo cỡ miệng cá rô biển 60 Hình 4.1 Hình dáng bên ngoài của cá rô biển đực và cái 65 Hình 4.2 Khối lƣợng trung bình của cá rô biển qua các tháng thu mẫu 66 Hình 4.3 Chiều dài tổng cộng trung bình của cá rô biển qua các tháng... thành thục cá rô biển 50 Bảng 3.2 Thành phần dƣỡng chất trong thức ăn nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển 50 Bảng 3.3 Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon steroid P ở các liều lƣợng khác nhau 54 Bảng 3.4 Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon steroid 17P ở các liều lƣợng khác nhau 55 Bảng 3.5 Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon steroid. .. về đặc điểm sinh học của cá rô biển trên thế giới và ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, đặc biệt là sinh học sinh sản Các thông số về mùa vụ sinh sản, hệ số thành thục, các kết quả về sức sinh sản tương đối, tuyệt đối chưa đầy đủ Để có cơ sở đưa cá rô biển vào thuần dưỡng và nuôi vỗ thành thục sinh dục cần có nghiên cứu về đặc điểm sinh học sinh sản của loài này 2.2 Quá trình phát sinh noãn hoàng (Vitellogenesis)... sử dụng kích dục tố, LHRHa; đặc biệt là cá bố mẹ sau khi sinh sản có thời gian tái thành thục ngắn và chi phí trong sinh sản nhân tạo cá thấp hơn hoặc bằng so với việc dùng các chất kích thích sinh sản khác Vì vậy, nhóm hormon này rất có triển vọng bên cạnh các chất kích thích sinh sản truyền thống trong sản xuất giống cá (Nguyễn Tường Anh, 1999a) Hiệu quả sử dụng các chất kích thích sinh sản trên các... đực và cái qua các tháng thu mẫu 70 4.1.4.1 Sự quan hệ giữa giai đoạn thành thục sinh dục và kích thƣớc cá cái theo thời gian 70 4.1.4.2 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục cá cái theo thời gian 72 4.1.4.3 Sự quan hệ giữa giai đoạn thành thục sinh dục và kích thƣớc cá đực theo thời gian 73 4.1.4.4 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục cá đực theo thời gian 75 4.1.5 Sự biến đổi hệ số thành thục ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN PHƯƠNG LOAN ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) LUẬN ÁN. .. cá rô biển bắt đầu thành thục sinh dục đạt chiều dài 11,68 cm Tỷ lệ đực:cái mẫu cá rô biển thu địa bàn tỉnh An Giang 1:1,58 Hệ số thành thục cá rô biển vào mùa sinh sản cao đạt 14,68% cá rô biển. .. hệ số thành thục sinh dục (cao cá 14,68%, cá đực 4,75%); Sức sinh sản tương đối trung bình cá rô biển 453.514 trứng/kg sức sinh sản tuyệt đối đạt 41.884 trứng /cá cái, mùa vụ sinh sản cá rô biển