Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Chương I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Các dược liệu có nguồn gốc từ thực vật phong phú đa dạng Từ bao đời nay, nhân dân ta biết sử dụng loài cỏ xung quanh làm thuốc chữa bệnh, từ loại bệnh thông thường đến bệnh khó chữa trị, đặc biệt đồng bào người miền núi, họ sống phụ thuộc nhiều vào núi rừng Việt Nam nơi có nguồn tài nguyên thiên nhiên vô phong phú đa dạng cộng với vốn kiến thức người dân địa tích lũy từ bao đời việc tìm kiếm, nghiên cứu phát huy việc sử dụng dược liệu có nguồn gốc thực vật việc làm cần thiết Hiện theo thống kê giới dược liệu châu Âu có tới 1482 chữa bệnh, châu Á có 3650 chữa bệnh với nhiều nhóm công dụng khác Hiện có khoảng 30% tổng giá trị thuốc chữa bệnh dược liệu cung cấp khai thác từ tự nhiên trồng trọt Sau khảo sát thuốc nhiều phương diện khác nhau, thấy phạm vi riêng biệt ngành dược, phương thức sử dụng phong phú Ngoài việc sử dụng phương thức cổ truyền dùng nguyên dạng hay dạng bào chế, ngày cỏ sử dụng nhiều để chiết xuất chất có hoạt tính sinh học dùng bào chế thành dạng thuốc chữa bệnh Ngày nay, phủ nhận tầm quan trọng việc điều trị dược phẩm tây y bên cạnh hiệu điều trị, dược phẩm thường để lại tác dụng phụ Vì thế, xu hướng giới quay lại nghiên cứu nguồn thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật Trong xu hướng đó, núi Bà Nà – Đà Nẵng có thuốc thượng thường người dân dùng để trị thương chưa nghiên cứu rộng rãi Để bảo tồn phát triển dược liệu việc định danh nghiên cứu công tác cần thiết Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 1.2 Yêu cầu Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 1.3 Nội dung thực Áp dụng phương pháp sắc kí cột để tách Alkaloid Sử dụng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra có mặt Alkaloid thuốc thượng CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY THUỐC THƯỢNG Tên thông dụng: thuốc Thượng, thuốc Mọi, Da xà lắc, thuốc dấu cà doong Tên khoa học: Phaeanthus vietnamensis Ban Giới: Thực vật Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Magnoliales Họ: Annonaceae (Na) Chi: Phaeanthus Mô tả: Cây gỗ nhỏ bụi, cao 2-10m Cành non gần không lông Lá thuôn gần hình mác, dài 9-16cm, rộng 3-6,5cm, đầu có mũi dài mọn, gốc hình nêm lệch, không lông; gân bên 9-11 đôi; cuống dài 5-6mm hoa mọc sole với lá, thường thành xim hoa Hoa có cuống dài 1,5-3cm, mang 4-6 bắc nhỏ; đài cánh hoa giống nhau, dài 1mm; nhị nhiều, xoăn nhiều Thân hình trái xoan, cỡ 12-15 x 6-7mm, lông, chín màu vàng sau chuyển thành màu mận chín; cuống dài 13-15mm , vỏ mỏng Ra hoa tháng 5-12, có tháng 6-1 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Nơi sống thu hái: thấy trung Việt Nam: Thừa Thiên – Huế (Phú Lộc), Quảng Nam – Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn) Công dụng: Dân gian dùng non hấp chín nồi cơm, lấy nước nhỏ mắt chữa đau mắt đỏ Vỏ rễ, vỏ thân đem nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy Cây có tác dụng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lị, tác dụng cầm máu vết thương da Là loài gặp, bị khai thác thường xuyên nên cần bảo vệ giữ giống Hình Thân, lá, trái thuốc thượng 2.2 Đại cương alkaloid Hình Alkaloid nhân dị vòng Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Alkaloid có nhân dị vòng Hình alkaloid dẫn xuất nhân quinolin Hình Alkaloid có khung aporphine: roemerin củ bình vôi Alkaloid nhóm hợp chất tự nhiên diện nhiều họ thực vật với cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học đa dạng Trên thực tế có nhiều loài thực vật có alkaloid mức độ vết tỉ lệ phần vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, xem có alkaloid phải chứa 0.05% alkaloid so với mẫu khô Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Do danh sách phân loại dựa vào cấu trúc nhân đáp ứng cho số lượng alkaloid nhiều đa dạng, nên để tiện lợi, alkaloid chia làm loại: alkaloid thật, protoalkaloid giả alkaloid (Pseudoalkaloid) - Alkaloid thật hợp chất có hoạt tính sinh học, có tính base, thường có chứa nguyên tử nito vòng dị hoàn, thường sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn thực vật diện dạng muối acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, acid aristolochir, alkaloid tứ cấp Các alkaloid dạng thường chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp chúng (ornithin, lysin, phenylalanin, - tryptophan, histidin, acid antranilic, ) theo vòng dị hoàn Các protoalkaloid xem amin có hoạt tính sinh học kể mescalin N, N-dimetyltryptamin Chúng amin đơn giản, tổng hợp từ amino acid, nguyên tử nito không vòng - dị hoàn Các giả alkaloid, hợp chất không bắt nguồn từ amino acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn alkaloid steroid alkaloid terpenoid (thí dụ conessin) purine (cafein) Hầu hết alkaloid diện có hoa, loại mầm, người ta thấy alkaloid động vật, côn trung, sinh vật biển, vi sinh vật, Chỉ có đặc điểm chung thường gặp tên alkaloid thường tận chữ “ine” Các đặc tính hóa- lý alkaloid Đa số alkaloid không màu, trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định có khoảng nhiệt độ phân hủy Một vài alkaloid dạng nhựa vô dịnh hình, vài alkaloid dạng lỏng (nocotin, coniin) vài alkaloid có màu (berberin màu vàng, betanidin màu đỏ) Alkaloid hợp chất có tính base yếu, có mặt nguyên tử nito Tính base alkaloid khác tùy theo diện nhóm R (mang nhóm chức khác nhau) gắn nguyên tử nito Các alkaloid tính base yếu phải cần môi trường acid mạnh, để tạo thành muối, tan nước Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Các alkaloid dạng base tự không tan nước, thường tan tốt dung môi hữu chloroform, dietyl eter, alcol bậc thấp Các muối alkaloid tan nước, alcol không tan dung môi hữu chloroform, dietyl eter, benzen Các protoalkaloid giả alkaloid thường dễ tan nước Tính hòa tan alkaloid đóng vai trò quan trọng việc chiết tách alkaloid khỏi kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống Nói chung alkaloid hợp chất tương đối bền, vậy, số hợp chất thuộc loại dẫn xuất indol, dễ bị hủy biến chất gặp ánh sáng tác nhân oxid hóa Các thuốc thử để định tính alkaloid:     Thuốc thử Mayer Thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Wagner Thuốc thử Iodoplatinat Định tính Alkaloid Muốn định tính alkaloid phải chiết alkaloid loại chất kèm theo gây trở ngại cho phản ứng Sau làm phản ứng tạo tủa để xác định xem có alkaloid hay không Muốn xác định xem alkaloid làm phản ứng màu đặc hiệu, ngày thường kết hợp với phương pháp sắc kí sắc kí lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh 2.3 Kĩ thuật sắc kí 2.3.1 Đại cương sắc kí 2.3.1.1 Khái niệm sắc kí Hình Sự tương tác tướng tĩnh tướng động với chất cần phân tích Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Sắc ký (Chromatography) phương pháp tách, phân ly, phân tách chất dựa vào phân bố khác chúng hai pha động tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, cấu tử hỗn hợp phân bố pha động pha tĩnh tương ứng với tính chất chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc ký có phân tử pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác có lực khác với pha động pha tĩnh Trong trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh đến lớp pha tĩnh khác, lặp lặp lại trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ chất có lực lớn với pha tĩnh chuyện động chậm qua hệ thống sắc ký so với chất tương tác yếu pha Nhờ đặc điểm mà người ta tách chất qua trình sắc ký 2.3.1.2 Cơ sở khoa học phương pháp sắc kí Phương pháp sắc ký dựa vào phân bố khác chất hai pha động tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến phân bố khác chất, lặp lặp lại tượng hấp phụ - phản hấp phụ chất dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh nguyên nhân chủ yếu việc tách sắc ký Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 2.3.1.3 Phân loại sắc kí Trong phương pháp sắc ký, pha động phải lưu thể (các chất dạng khí hay lỏng), pha tĩnh chất trạng thái lỏng rắn Dựa vào trạng thái tập hợp pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (Gas Chromatography- GC) sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) Dựa vào chế trao đổi chất hai pha động tĩnh người ta lại chia phương pháp sắc ký thành nhóm nhỏ • • • • Sắc kí cột Sắc kí lớp mỏng Sắc kí trao đổi ion Sắc kí gel 2.3.2 Sắc kí cột 2.3.2.1 silca gel 2.3.2.1.1 silica gel pha thường Silica gel làm pha tĩnh sắc ký chế tạo cách thủy giải silicat natri (cho tác dụng với acid sulfuric) để tạo thành acid polysilisic, ngưng tụ polymer hóa để đạt tiêu vật lý cần thiết có hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng bề mặt yêu cầu Các nhà sản xuất trộn thêm chất làm bám dính để silica gel bám dính lên mỏng (loại dùng để tráng mỏng) Tiếp vĩ ngữ “G” sử dụng thống giới biết silica gel có trộn thêm khoảng 10% (w/w) chất kết dính [CaSO4, (0.5 H2O)] Các nghiên cứu cho thấy diện ion calci không làm ảnh hưởng đến khả tách chất silica gel Cũng hiệu chỉnh tính hấp thu silica gel cách cho silica gel kết hợp với hợp chất khác base, dung dịch đệm mức pH xác định Cũng thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả tách hợp chất, alcen Silica gel polymer ba chiều đơn vị tứ diện oxyd silicon SiO 2, H2O bề mặt hạt gel có lỗ rỗng Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng 40- 200µm, lỗ rỗng có đường kính Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng trung bình khoảng 40- 300Å, diện tích bề mặt khoảng 100- 800m 2/g Loại silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng có đường kính hạt khoảng 5- 25µm, đường kính lỗ rỗng 6nm, nên tạo phần tính chất đuổi hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 500- 1000 Dalton Hạt silica gel dùng cho loại sắc ký cột HPLC để định tính, có diện tích bền mặt 200- 500m 2/g, có kích thước nhỏ 2- µm Hạt silica gel HPLC để cô lập hợp chất, có diện tích bề mặt 500- 800m 2/g, có kích thước lớn 40- 60 µm Các vị trí hoạt động bề mặt hạt silica gel nhóm silanol, nhóm cách 5Å Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt silica gel cần thêm loại bớt nước Khi silica gel hấp thu nước, phân tử nước che khuất vị trí hoạt động bề mặt silica gel làm hạt bị giảm hoạt tính; muốn silica gel tăng hoạt tính trở lại, cần đun nóng để loại bỏ nước Đây trính thuận nghịch, muốn làm giảm hoạt silica gel cần cho thêm nước vào Tuy nhiên, đun nóng khoảng 400- 500 0C, trình thuận nghịch biến mất, silica gel bị vĩnh viễn hoạt tính bề mặt, hai nhóm silsnol kề bên bị phân tử nước, tạo thành nối ester, hoạt tính sắc ký Bản chất hóa học bề mặt hạt silica gel nhóm silanol-OH; tâm hoạt động tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất sắc ký Vì thế, sắc ký cột với cột nhồi silica gel, hợp chất phân cực (có mang nhóm chức –OH,NH2, -COOH ) có khả tạo nối hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại cột bị giải ly muộn so với chất khác có tính phân cực alcan, terpen (là hợp chất không chứa nhóm chức tạo nên nhóm hydrogen)ít bị silica giữ lại, khổi cột sớm Tuy nhiên cần nhớ với hợp chất bị silica gel giữ lại cột, giải ly chất khỏi cột hay không tùy vào việc sử dụng dung môi giải ly mạnh hay yếu Dung môi tạo nối hydrogen mạnh dung môi thích hợp để giải ly hợp chất phân cực mạnh khỏi cột silica gel Methanol thường dduocjw chọn để đuổi hết chất sót lại cột silica gel Hơn nữa, muốn đuổi hết hợp chất phân cực thí dụ flavonoid glycosid, triterpen glycosid nên dùng 1-2% acid acetic methanol Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Lưu ý sử dụng dung môi methanol nước, hai loại dung môi hòa tan lượng nhỏ silica gel khiến cho dung dịch giải ly hứng có chứa silica gel, gây hiểu lầm hợp chất thu Silica gel dễ dàng hòa tan nước có pH nhỏ 2.3.2.1.2 silica gel chế hóa Silica gel tác dụng với chlorodimetylalkylsilan R-Si(CH 3)2-Cl để biến đổi silica gel thành loại chất hấp thu có tính không phân cực Dây alkyl R C-1, C-2, C-6, C-8, C-10 C-18, nhiên, người ta thường hay chế tạo dây C-8 C-18 Trong loại silica gel thương phẩm, 40-60% nhóm silanol bị biến thành dẫn xuất Các loại silica gel bền, chịu dung môi áp suất 6000psi khoảng pH 2.0- 8.5 vài loại dẫn xuất polystyrene, divinylbenzen bền silica gel C-18, chịu khoảng pH 1.0- 13.0 Loại silica gel pha đảo có tính phân cực, nên có lực mạnh với hợp chất phân cực, giữ chặt hợp chất lại cột Pha động thường nước Bên cạnh dung môi nước, người ta thêm vào dung môi hữu methanol, acetonitril, tetrahydrofuran với nồng độ tăng dần trình sắc ký (nghĩa trình giải ly, dung môi giải ly lúc kén phân cực), hợp chất phân cực giải ly khỏi cột trước chất phân cực sau Người ta thường thêm vào tỉ lệ nhỏ 0.01- 0.1 acid trifluoroacetic (TFA) vào pha động 2.3.2.2 Sắc kí cột hở Sắc ký cột hở tiến hành điều kiện áp suất khí Pha tĩnh thường hạt có kích thước tương đối lớn (50- 150 µm), nạp cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tách đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đặt phía cao Dung môi giải ly khỏi cột phần bên cột, hứng vào lọ nhỏ đặt ống dẫn cột Hệ thống thường làm cho tách chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột hở có ưu điểm pha tĩnh dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; triển khai với lượng lớn mẫu chất 10 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 3.1.2.1 Lịch sử thành lập phát triển Trung tâm sâm dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, tiền thân đơn vị nghiên cứu chuyên đề sâm KS (1978) trung tâm sâm Việt Nam (1985), sáp nhập vào Viện Dược liệu theo định thành lập số 1229/BYT-QĐ ngày 20/6/1997 Bộ Y Tế Trung tâm sâm dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đơn vị nghiên cứu khoa học công nghệ thuốc, với chức nghiên cứu nghiên cứu triển khai, ứng dụng vào sản xuất thử nghiệm dược liệu phía Nam nhằm mục đích phục vụ cho công tác nghiên cứu thuốc từ dược liệu, đặc biệt từ loài thực vật thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae) 3.1.2.2 Sơ đồ tổ chức GIÁM ĐỐC PGS.TS Trần Công Luận PHÓ GIÁM ĐỐC KINH TẾ PHÓ GIÁM ĐỐC CHUYÊN MÔN ThS Nguyễn Đức Dục PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương BỘ MÔN TÀI VƯỜN BẢO BỘ BỘ MÔN XƯỞNG NGUYÊN DƯỢC DƯỢC LIỆU - TỒN GEN MÔN VÀ GIỐNG HÓA CÂY CHẾ THUỐC PHẨM SẢN XUẤT HÀNH - LÝ- SINH THỬ HÓA PHÒNG NGHIỆM THÔNG CHÍNH TIN - THƯ TỔNG VIỆN HỢP 31 PHÒNG Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Trung tâm có 23 cán gồm tiến sĩ, thạc sĩ 10 cán nghiên cứu khoa học thuộc ngành dược học, sinh học 3.1.2.3 Nhiệm vụ Nghiên cứu nguồn tài nguyên dược liệu, tổ chức bảo tồn nghiên cứu biện pháp lưu giữ nguồn gen giống loài sâm dược liệu Nghiên cứu hóa học, dược lý - sinh hóa, độc tính chế phẩm từ dược liệu thuốc y học cổ truyền Nghiên cứu dạng bào chế thích hợp từ sâm dược liệu Tiến hành thử tác dụng lâm sàng thuốc từ sâm dược liệu Sản xuất thử nghiệm, chuyển giao công nghệ sâm dược liệu Thông tin, tuyên truyền phổ biến việc sử dụng phát triển dược liệu đặc biệt thuốc họ Nhân Sâm Hợp tác với viện nghiên cứu trường đại học nước Nhật Bản, Thái Lan, Ba Lan, … 3.1.2.4 Những công trình nghiên cứu khoa học chủ yếu • Nghiên cứu tòan diện sâm Việt Nam: Điều tra trữ lượng, khoanh vùng bảo vệ - Trồng trọt - Nghiên cứu thành phần hóa học - Tác dụng dược lý chế phẩm Nghiên cứu tòan diện đinh lăng: trồng trọt, thành phần hóa học, tác dụng dược lý chế phẩm Nghiên cứu sàng lọc thuốc họ Nhân sâm có tác dụng chống stress tăng lực • Nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc từ loài Schefflera elliptica, Schefflera corymbiformis Schefflera sp3 có tác dụng chống stress tăng lực Nghiên cứu ứng dụng tác dụng tăng lực chống stress sâm Việt Nam đinh lăng Nghiên cứu hoàn thiện dạng chế phẩm từ sâm Việt Nam • Nghiên cứu chế phẩm Ruvintat có tác dụng hạ huyết áp hạ cholesterol huyết từ dược liệu phối hợp • Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa số thuốc họ Nhân sâm • Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ dược liệu Việt Nam • Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan dược liệu phối hợp 32 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng • Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch sâm Việt Nam đinh lăng dược liệu phối hợp • Nghiên cứu phân lập chất chuẩn majonosid-R2, ginsenosid-Rb1 ginsenosid-Rg1 từ saponin sâm Việt Nam • Nghiên cứu quy trình chiết xuất phân đoạn hợp chất có hoạt tính anti-herpes cao từ mảnh cộng • Lập hệ thống danh mục thuốc phía Nam • Thu thập - bảo quản mẫu chuẩn hóa danh pháp mẫu dược liệu từ nguồn thuốc phía Nam 3.1.2.5 Một số sản phẩm trung tâm Hình Một số sản phẩm trung tâm 3.1.2.6 An toàn lao động phòng cháy chữa cháy Mỗi thành viên trang bị đầy đủ kiến thức đặc điểm hóa chất, phản ứng hóa học, dự kiến cố xảy đề phương pháp phòng ngừa, xử lý Thực yêu cầu sau phòng cháy chữa cháy:  Có bình chữa cháy  Có hệ thống dự trữ nước cho phòng cháy chữa cháy Thường xuyên tổ chức hội thao phòng cháy chữa cháy để huấn luyện cho cán công nhân viên biết ý thức phòng cháy chữa cháy Quần áo dính dầu mỡ phải giặt treo tủ kín tránh bắt lửa  Sau làm việc phải vệ sinh phân xưởng sản xuất, kho dự trữ 33 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng  Cấm hút thuốc nơi dễ phát sinh lửa, điện 3.2 VẬT LIỆU 3.2.1 Nguyên liệu Cao thuốc thượng trích từ thuốc thượng dung môi cloroform 3.2.2 Hóa chất sử dụng       Cồn 960 Methanol Cloroform Nước cất Silcagel chạy cột Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck) Silica gel G 0,04-0,06mm (Merck) 3.2.3 Thiết bị          Máy sấy SANYO, KC-65 Cân phân tích METER TOLEDO AB204; Precisa XR205 SM-DR Máy cô quay giảm áp Buchi Bình hút ẩm Bồn chiết siêu âm ELMA LC60H (Đức) Bếp đun cách thủy MEMMERT (Đức) Đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE Cột sắc ký kích thước Cốc chạy sắc kí lớp mỏng 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp sắc kí cột 3.3.1.1 Chuẩn bị điều kiện chạy sắc kí 3.3.1.1.1 Cột sắc kí Chuẩn bị cột sắc kí với điều kiện: • • • • Chiều dài cột sắc kí :60cm Đường kính:30mm Giá đỡ Chiều cao cột silicagel 30 cm 34 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 3.3.1.1.2 Silicagel Sử dụng hạt silicagel hạt mịn kích thước 40-63 mesh xuất sứ Ấn Độ 3.3.1.1.3 Chuẩn bị hệ dung môi chạy cột Lựa chọn hệ dung môi chạy cột Ở lựa chọn hệ dung môi tùy giai đoạn chạy cột 3.3.1.1.2.4 Nhồi cột Ta thực nhồi cột khô:dùng miếng gòn nhỏ hay thủy tinh nhồi chặt vào đáy cột 3.3.1.1.5 Nạp silicagel vào cột Cân xác silicagel sau sấy cho vào cột sau gõ cho silicagel phân bố đề cột 3.3.1.1.6 Nạp mẫu vào cột Cân g cao dạng bột khô xác cân số sau hòa tan dung môi cho vào lượng silicagel khoảng 50 gam trộn lên Sau vặn điều chỉnh cho lượng dung môi cột hạ thấp xuống ngang mặt silicagel tiến hành cho mẩu vào Ta từ từ cho mẫu dạng sệt vào cột cách sau châm dung môi đầy cột Chú ý ta để lớp gòn phía lớp cao để hạn chế ảnh hưởng tượng khô cột 3.3.1.1.7 Chạy sắc kí cột Tiến hành mở van cho dung môi chảy xuống ta dùng ống nghiệm hay ống bi thu đánh số tránh nhầm lẫn thuận tiện cho trình phân tích Mỗi ống ta hứng lượng dung môi với thể tích khoảng 15 ml Trong trình chạy sắc kí tránh tượng khô cột Vì khô cột xảy nổ cột,nứt cột ảnh hưởng đến kết thí nghiệm 35 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 3.3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 3.3.2.1 Lựa chọn hệ dung môi chạy sắc kí lớp mỏng Để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho chạy sắc kí mỏng ta tiến hành dò hệ Dò hệ ta tiến hành pha dãy hệ dung môi có tỉ lệ thay đổi Clorofom Methanol từ 9:1-9,5:0.5-8:2… Sau dò hệ ta chọn hệ chạy phù hợp hệ 8:2 3.3.2.2 Chuẩn bị mỏng chạy sắc kí Bản mỏng sắc kí sử dụng loại F254 Mỗi mỏng ta kích thước chuẩn 10 cm gồm giới hạn • Giới hạn cách mép 0.5 cm • Giới hạn cách mép đưới cm • chấm sắc kí cách 0.5 cm cách biên 0.5 cm 3.3.2.3 Chuẩn bị dung môi chạy sắc kí Tiến hành pha hệ dung môi chạy sắc kí hệ thống bình lắc Dùng pipet hút xác ml cloroform ml methanol cho vào bình lắc sau nhỏ giọt NH vào bình sau lắc để yên 15’ Sau xã bỏ dung dịch phía bình lắc hứng phần dung môi lại vào ly chạy sắc kí Tiếp tục để yên cho dung môi bão hòa 30’ 3.3.2.4 Tiến hành chấm sắc kí Ta dùng mao quản hút hỗn hợp dung dịch ống hứng chấm lên sắc kí chuẩn bị sẵn Chú ý phải chấm tay tránh làm thủng sắc kí không chấm mờ 3.3.2.5 Chạy sắc kí Sau chấm sắc kí lên mỏng ta tiến hành chạy sắc kí Từ từ đưa sắc kí vào ly chạy sắc kí chuẩn bị trước Quan sát ta thấy dung môi bắt đầu chạy theo sắc kí từ lên Sau dung môi chạy đến vạch giới hạn phía ta ngừng chạy khéo léo lấy sắc kí Sau sấy 30s nhiệt độ 750C 36 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 3.3.2.6 Quan sát đèn UV Để sắc kí vào buồn đền UV quan sát vạch chất 3.3.2.7 Quan sát màu sau thử dragendorff Sau quan sát đèn UV ta tiến hành nhúng sắc kí vào thuốc thử dragendorff để quan sát vết 3.3.2.8 Đọc kết Sau thử thuốc thử ta đưa kết luận phân đoạn giống phân đoạn từ ta tiến hành gom phân đoạn giống lại với công tác phân tích,tách chiết sau.Hay ta so sánh với chất chuẩn để định tính chất Ở Alkanoid 3.4 KẾT QUẢ TH ĐƯỢC TRONG QUÁ TRÌNH CHẠY CỘT VÀ CHẤM SẮC KÍ LỚP MỎNG Sau thời gian thực tập chúng em tách phân đoạn sau đây: Từ sắc kí phân đoạn lắc, ta thấy mẫu nguyên liệu có alkaloid phân cực không phân cực Ta tiến hành chạy cột cao alkaloid tổng (đã loại tạp) hệ dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh Các hệ dung môi khai triển ether dầu hỏa (60:90) – aceton, aceton, aceton – methanol - Sử dụng cột sắc kí với thông số sau (Cột I): Chất hấp phụ: Silica gel 60 F254 Quy cách cột: cm x 60 cm Chiều cao cột silica gel: 30 cm Khối lượng mẫu: 1,5535 g Tốc độ dòng: 40 giọt/phút Thể tích bình hứng: 25 ml Tổng số phân đoạn: 37 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Cột sắc kí I Phâ n đoạn I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 Bình hứng → 45 46 → 99 100 → 134 135 → 299 300 → 373 374 → 468 469 → 600 Dung môi rửa giải Thể tích(ml) Khối lượng(g) ether dầu - acetone (7:3) 1125 0,0770 1350 0,0508 875 0,2101 4125 0,6810 1850 0,2781 2375 0,1804 3300 0,0654 ether dầu - acetone (5:5) aceton 100% aceton - methanol (9:1) aceton - methanol (7:3) aceton - methanol (5:5) methanol 100% Bảng 1: Các phân đoạn cột sắc kí I Để kiểm tra thành phần tách bình hứng trình chiết tách, dùng SKLM, khai triển với hệ dung môi: CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2), thuốc thử phát Dragendorff UV 365 nm Hình Sắc kí lớp mỏng phân đoạn cột I (alkaloid tổng – I – II – III – IV – V – VI – VII) Ta nhận thấy phân đoạn I,II, III vết Phân đoạn IV có vết alkaloid nhiều, phân đoạn từ V đến VII vết hơn, phân cực mạnh nên vết kéo dài bảng sắc ký Phân đoạn I4 ta 0,6810 g cao với số vệt alkaloid đẹp Tiến hành chạy cột I4 để thu nhận alkaloid Sử dụng cột sắc kí với thông số sau: 38 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng - Chất hấp phụ: Silica gel 60 F254 Quy cách cột: cm x 60 cm Chiều cao cột silica gel: 20 cm Tốc độ dòng: 25 giọt/phút Khối lượng mẫu: 0,6810 g Thể tích phân đoạn: 15 ml.A Tổng số phân đoạn: Phân đoạn I4-1 I4-2 I4-3 I4-4 I4-5 Bình hứng → 33 34 → 59 60 → 107 108 →121 122 → Cột sắc kí II Dung môi rửa giải Thể tích(ml) CHCl3 100% 660 0,0549 520 0,2423 960 0,1650 280 0,1311 260 0,0723 CHCl3 – CH3OH (95:5) CHCl3 – CH3OH (90:10) CHCl3 – CH3OH (80:20) CH3OH 100% Khối lượng(g) Bảng 2: Các phân đoạn cột sắc kí II Để kiểm tra thành phần tách bình hứng trình chiết tách, dùng SKLM, khai triển với hệ dung môi: CHCl3: MeOH: NH3 (8:2:0,2), thuốc thử phát Dragendorff 39 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng UV 365 nm Hình 10: Sắc kí lớp mỏng phân đoạn cột II (I4 – I4-1 – I4-2 – I4-3 – I4-4 – I4-5) Từ sắc kí phân đoạn lắc, ta thấy mẫu nguyên liệu có alkaloid phân cực không phân cực Ta tiến hành sử dụng cao alkaloid tổng (hay gọi alkaloid toàn phần) để chạy cột sắc kí I Ở cột I, phân đoạn tách theo vệt từ phân cực đến phân cực mạnh (các tạp phân cực phân cực mạnh, tạp màu loại bớt) Dựa kết SKLM, phân đoạn I4 có vết alkaloid nằm riêng biệt có khối lượng tương đối nhiều so với phân đoạn khác nên tiến hành chọn phân đoạn I4 để chạy cột sắc kí II Ở cột II, phân đoạn I4-5 có vết alkaloid Phân đoạn I 4-2 cho ta vết với khối lượng tương đối Từ vết ta tiến hành sắc ký giấy chế hóa ( PTLC ) để thu alkaloid tinh Tiến hành dò hệ chế hóa, nhận thấy hệ chloroform – iso propanol – methanol – ammoniac 25% ( 4:4:2:1) cho kết chế hóa phân đoạn I 4-2 I 4-3 đẹp thời gian hạn chế, chế hóa để có chất tinh Ta thấy phân đoạn 2,3,4,5,8,9 có vết xuất Alkaloid phân đoạn lại không có.Ở phân đoạn 2,3,4,5,8,9 ta tiếp tục tiến hành chạy sắc kí để tách hẵn Alkaloid 40 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng CHƯƠNG IV THU HỒI TÀI NGUYÊN 4.1 Đối với dung môi 4.1.1 Đơn dung môi Đối với dung môi đơn chất sau sử dụng xong ta cho vào máy cô quay để thu hồi sử dụng lần sau 4.1.2 Hệ dung môi Đối với hệ dung môi ta cô quay thu hồi chất, dung môi bỏ không tỉ lệ ban đầu 4.2 Đối với silicagel RỬA BẰNG RỬA BẰNG ACID RỬA BẰNG RỬA BẰNG SẤY NƯỚC SUNFUARID JAVEL METANOL SILICAGEL E Mỗi công đoạn tiến hành ngày 41 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 4.2.1 Rửa nước Lấy silicagel cho vào thau nhựa rửa nước nhiều lần Ta chắt nước bẩn tiếp tục rửa nước hết màu 4.2.2 Rửa acid sunfuaride Cho acid sulfuride 25% vào thau silicagel ngâm rửa nhiều lần Mục đích acid sulfuride để đốt cháy chất hữu silicagel 4.2.3 Rửa javel Ta rửa nước javel nhiều lần để tẩy hết màu silicagel 4.2.4 Rửa methanol Ta rửa silicagel methanol nhiều lần để rửa trôi hết chất sót lại silicagel 4.2.5 Sấy silicagel Ta cho silicagel vào máy sấy nhiệt độ 105 oC để làm khô silicagel Sau ta cho vào bình đựng cho lần sử dụng sau 42 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng CHƯƠNG V Ý KIẾN ĐỀ NGHỊ Qua tuần thực tập trung tâm chúng em học tập nhiều kinh nghiệm quý báu từ chúng em rút ưu khuyết điểm kiến nghị sau: Ưu điểm Môi trường làm việc thân thiện thích thú Cơ sở vật chất trang thiết bị trung tâm đầy đủ Sách tài liệu phong phú phục vụ cho công tác nghiên cứu Sự hướng dẫn tận tình quý thầy cô công nhân viên trung tâm với thực tập sinh Khuyết điểm chuyến thực tập Thời gian thực tập ngắn học hỏi nhóm chúng em hạn chế Diện tích phòng ban trung tâm nhỏ so với nhu cầu sử dụng, hoạt động trung tâm Lực lượng cán công nhân viên trung tâm có trình độ độ tuổi cao Ý kiến đề nghị Qua đợt thực tập chúng em xin đóng góp ý kiến cá nhân: Trung tâm có kế hoạch mở rộng phạm vi nghiên cứu diện tích trung tâm để xứng tầm với tầm vóc quy mô trung tâm Trung tâm cần có sách đãi ngộ nhân lực trẻ có kiến thức để trẻ hóa lực lượng nhân trung tâm Và cuối nhóm em mong muốn mối quan hệ Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học trung tâm ngày khăng khít để có nhiều sinh viên Bộ Môn có điều kiện thực tập trung tâm 43 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng CHƯƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong trình thực tập nghiên cứu chúng em tham khảo tài liệu sau: Nguyễn Thị Kim Phụng 2007.Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Trần Hùng.2007.Phương pháp nghiên cứu dược liệu.Bộ môn dược liệu,khoa dược, đại học Y Dược Tp.HCM 44 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 45 [...]... chiều cao phù hợp trong cột mà cột vẫn còn chỗ để chứa dung môi Với lượng chất hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc ký với kích thước phù hợp 12 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng 2.3.2.2.5 tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong cột sẮc ký Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt... cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu 17 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng cột nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn Trong quá trình sắc ký, cần thay nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần (độ phân cực tăng dần) để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột Muốn tăng tính phân... dùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất 13 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột hứng, lượng dung... trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly Lưu ý: • Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và của sắc ký cột giống nhau 11 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng • Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm nêu trên, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn... thu lên bề mặt tấm bản mỏng Các hạt phải đồng đều và có đường kính trong khoảng 10-25µm Một số chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng:       Silica gel Kieselguhr Alumina Bột giấy Lớp polyamid Sephadex 21 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng 2.3.3.3 Dung môi giải ly Các đơn dung môi được sắp xếp theo tính phân cực tăng dần theo hằng số điện môi hoặc momen lưỡng cực hoặc... là công ụ cần thiết cho các nghiên cứu viên trong phòng thí nghiệm, trong một số công việc như sau: 2.3.3.5.1 Đề công bố đặt điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập Để công bố đặt điểm của một hợp chất, bên cạnh các số liệu phổ RMN, các đặc tính vật lý, cũng cần cho biết giá trị Rf của hợp chất đó 25 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng Một hợp chất tinh khiết có một vết với... kín tránh bắt lửa  Sau giờ làm việc phải luôn vệ sinh sạch sẽ phân xưởng sản xuất, các kho dự trữ 33 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng  Cấm hút thuốc ở những nơi dễ phát sinh lửa, điện 3.2 VẬT LIỆU 3.2.1 Nguyên liệu Cao thuốc thượng được trích từ cây thuốc thượng bằng dung môi cloroform 3.2.2 Hóa chất sử dụng       Cồn 960 Methanol Cloroform Nước cất Silcagel chạy... hay ống bi thu và được đánh số tránh nhầm lẫn và thuận tiện cho quá trình phân tích Mỗi một ống ta hứng một lượng dung môi với thể tích khoảng 15 ml Trong quá trình chạy sắc kí tránh hiện tượng khô cột Vì khi khô cột sẽ xảy ra hiện nổ cột,nứt cột ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm 35 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng 3.3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 3.3.2.1 Lựa chọn hệ dung... nhỏ, chứa một ít aceton để dành rửa vi quản Khi aceton trong lọ hết thì châm mới thêm một ít Lọ có nắp đậy bằng nhựa Khi cần chấm mẫu, rút vi quản ra khỏi lọ aceton, dí nhẹ đầu vi quản lên một tờ giấy thấm để hút bỏ aceton đang có trong ống, nhúng đầu vi quản vào dung dịch mẫu cần sắc ký 22 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng để chấm lên bản sắc ký Tiếp theo, muốn dùng vi quản... một ít dung môi lên đầu cột, dung môi sẽ trong suốt không màu (không bị lây màu của chất mẫu) Cho một lớp cát dày khoảng 3-6mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột Nếu không có cát, có thể sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, 15 Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid trong cây thuốc thượng giấy lọc có đường kính vừa bằng với đường kính trong của cột Cẩn thận để không làm xáo trộn .. .Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 1.2 Yêu cầu Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng 1.3 Nội dung thực Áp dụng phương pháp sắc kí cột để tách Alkaloid Sử... oxid hóa Các thuốc thử để định tính alkaloid:     Thuốc thử Mayer Thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Wagner Thuốc thử Iodoplatinat Định tính Alkaloid Muốn định tính alkaloid phải chiết alkaloid. .. thượng 2.2 Đại cương alkaloid Hình Alkaloid nhân dị vòng Tìm hiểu quy trình định tính Alkaloid thuốc thượng Alkaloid có nhân dị vòng Hình alkaloid dẫn xuất nhân quinolin Hình Alkaloid có khung aporphine: