MỤC LỤC 1.ĐẶT VẤN ĐỀ .3 TỔNG QUAN VỀ VI NẤM NỘI SINH 2.1 Vi nấm nội sinh: 2.2.Quan hệ vi nấm nội sinh thực vật: 2.3 Nguyên tắc để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh [14,29]: .4 2.3.1 Thực vật sống môi trường sinh học bất thường: .4 2.3.2 Thực vật sử dụng dược liệu dân gian: 2.3.3 Thực vật có tính đặc thù sinh thái: 2.4 Một số vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học: .5 2.4.1 Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh: 2.4.2 Vi nấm nội sinh sản xuất chất có tác động sinh học khác 2.5 Ly trích vi nấm nội sinh: .6 2.6 Nuôi cấy chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh: TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3.1 Các nghiên cứu ở nước 3.2 Các nghiên cứu nước MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 10 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 5.1 Đối tượng nghiên cứu 10 5.2 Các phương pháp nghiên cứu 10 5.2.1 Ly trích vi nấm nội sinh từ thực vật 10 5.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi nấm nội sinh .12 5.2.3 Định danh chủng vi nấm có hoạt tính ở mức Chi [16] 12 5.2.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học 13 5.2.5 Chiết tách chất biến dưỡng có tác động sinh học từ chủng vi nấm nội sinh 13 5.2.6 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh 13 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI CỦA VẤN ĐỀ SẼ ĐI SÂU NGHIÊN CỨU 14 NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 14 [12] Deborah KB Runyoro, Mecky IN Matee, Olipa D Ngassapa, Cosam C Joseph, Zakaria H Mbwambo, (2006), Screening of Tanzanian medicinal plants for anti-Candida activity, BMC Complement Altern Med 15 [13] E Christine Davis, Joseph B Franklin, A Jonathan Shaw and Rytas Vilgalys, (2003), Endophytic Xylaria (Xylariaceae) among liverworts and angiosperms: phylogenetics, distribution, and symbiosis, American Journal of Botany 90(11),1661-1667 15 [25] Rios J.L, Recio M.C., Villar A., (1988), Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of the literature, Journal of Ethnopharmacology, Volume 23, pp 127–149 16 [26] Ranganathan S, Balajee SA., (2000), Anti-Cryptococcus activity of combination of extracts of Cassia alata and Ocimum sanctum, Mycoses.43(7-8), pp 299-301 .16 [27] Sai-Cheong Lee, Chang-Phone Fung, Ning Lee, Lai-Chu See, Jen-Seng Huang, Chi-Jen Tsai, Kuo-Su Chen, Wen-Ben Shieh (2001), Fluconazole Disk Diffusion Test with Methylene Blue- and GlucoseEnriched Mueller-Hinton Agar for Determining Susceptibility of Candida Species, J Clin Microbiol., 39(4), pp 1615–1617 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 80% dân số giới từ nước phát triển dựa chủ yếu vào loại thuốc truyền thống (chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật) để chăm sóc sức khỏe Trong 119 loại hợp chất hóa học, 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, loại thuốc sử dụng ngày nhiều nhiều quốc gia (theo Balick cộng sự, 1996) Hiện có nhiều chất chiết xuất từ có tác dụng chữa bệnh, vấn đề đặt chất có hoạt tính sinh học sinh kết mối liên hệ tương sinh với vi sinh vật nội sinh có ích mô thực vật Vi sinh vật nội sinh thực vật (endophyte) vi sinh vật phát triển bên mô sâu thường không gây bệnh cho chủ [14] Trong đó, vi khuẩn vi nấm vi sinh vật nội sinh thường gặp Tần số ly trích vi sinh vật nội sinh vi nấm chiếm tỷ lệ cao hơn, hội tìm chủng vi nấm nội sinh từ cao Những nghiên cứu gần Hawksworth Rossman ước tính có đến triệu loài vi nấm khác nhau, khoảng 100.000 loài mô tả [17,16] Hiện tương lai vi nấm nội sinh nguồn đa dạng sinh học dồi dào, lạ có nhiều loài chưa biết đến Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với chủ, chúng sử dụng chất dinh dưỡng để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho tạo sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học hormon sinh trưởng, chất kháng sinh có khả bảo vệ khỏi vi sinh vật gây bệnh Nhiều tài liệu cho thấy sống cộng sinh mô thực vật, vi nấm nội sinh sản sinh nhiều chất có hoạt tính sinh học kháng khuẩn kháng nấm, ví dụ Kennedia nigriscans, loài leo Úc dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thương, sát trùng; từ ly trích chủng Streptomyces sp NRRL 30562 sản xuất kháng sinh munumbicin phổ rộng [29] Ở quy mô rộng, vi nấm nội sinh có tác động quan trọng nông nghiệp, rừng quan tâm nghiên cứu tiềm chúng có ý nghĩa lớn lĩnh vực y học, nông nghiệp công nghiệp Họ Rutaceae Việt Nam đa dạng, có khoảng 140 loài cam, chanh, quýt, bưởi trồng phổ biến, có nhiều ứng dụng dược phẩm, thực phẩm…Thân, cành, lá, hoa vỏ loại chứa nhiều tinh dầu…Nhiều công trình nghiên cứu thực vật người cho thấy tinh dầu vỏ họ Rutaceae có tác dụng an thần, chữa cảm cúm Bên cạnh đó, thuộc họ Zingiberaceae có vai trò quan trọng đời sống người Từ xa xưa, gừng trở thành gia vị, thức ăn, vị thuốc quan trọng người Á đông Theo nghiên cứu Nguyễn Nghĩa Thìn cộng số lượng loài có khả chữa bệnh ung thư 50 loài thuộc 36 chi 24 họ, số đó, họ Zingiberaceae đa dạng (16%) Trên giới có nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học tính kháng viêm, chống lão hóa, kháng khuẩn mạnh, ức chế khối u… nhiều tác dụng khác họ Gừng, đặc biệt gừng, riềng, nghệ Từ đặc tính cho thấy, tiềm họ chứa hệ endophyte phong phú, tiết nhiều chất biến dưỡng có ý nghĩa việc điều trị bệnh Tuy vậy, nay, Việt Nam nói riêng giới nói chung chưa có nhiều nghiên cứu endophyte loài thuộc họ Rutaceae Zingiberaceae Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm chủng vi nấm nội sinh có khả tạo chất biến dưỡng có lợi có khả sản sinh chất có hoạt tính sinh học với hy vọng dùng để điều trị bệnh cho người công việc thú vị nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Từ lí trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học vi nấm nội sinh phân lập từ họ Rutaceae Zingiberaceae” với mục tiêu tìm chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao họ thực vật TỔNG QUAN VỀ VI NẤM NỘI SINH 2.1 Vi nấm nội sinh: Endophyte vi sinh vật sống mô sâu thực vật không gián tiếp trực tiếp gây bất lợi cho [24] Vi nấm nội sinh thành phần chiếm tỉ lệ cao hàng ngũ đông đảo endophyte thực vật Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với chủ, chúng sử dụng chất dinh dưỡng để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho tạo sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học hormon sinh trưởng, chất kháng sinh có khả bảo vệ khỏi vi sinh vật gây bệnh 2.2.Quan hệ vi nấm nội sinh thực vật: Giữa vi nấm nội sinh thực vật có mối quan hệ cộng sinh tương sinh, vi nấm nội sinh xuất phát từ số bệnh lý thực vật trình tiến hóa Sự tương tác chủ vi sinh vật gây bệnh suốt trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất đột biến gen từ vi sinh vật gây bệnh chủng vi nấm nội sinh hữu ích Chúng xem tác nhân giúp cân hệ vi sinh chủ nhằm ngăn chặn tác nhân vi sinh gây bệnh [16,28] Vi nấm nội sinh thúc đẩy khả thích nghi sinh thái thực vật chủ Ở số loài cỏ có vi nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả gia tăng sức chịu đựng khô hạn chịu độc tính nhôm nguồn nước, môi trường sống… Ngoài việc bảo vệ chống lại số yếu tố bất lợi cho kí chủ động vật ăn cỏ côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên sinh từ vi nấm nội sinh quan sát, theo dõi kết luận khả ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác xâm nhập mô thực vật Trước thực tế này, câu hỏi đặt rằng: hoạt chất quí giá sản xuất kết mối quan hệ tương sinh vi nấm nội sinh có ích mô thực vật chủ sinh Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy số chất biến dưỡng vi nấm nội sinh tác động mầm bệnh thực vật mà có khả trị liệu vi khuẩn, nấm, virus sinh vật đơn bào gây bệnh cho người động vật 2.3 Nguyên tắc để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh [14,29]: Trên giới có hàng triệu loài thực vật Đó số lượng lớn mà ta thử nghiệm hết chọn lựa cách ngẫu hứng đưa vào nghiên cứu Do đó, việc chọn thực vật để ly trích vi nấm nội sinh cần phải dựa đối tượng có đặc điểm sinh học Một số nguyên tắc sau thường áp dụng: 2.3.1 Thực vật sống môi trường sinh học bất thường: Với loài thực vật này, môi trường bất thường điều kiện tự nhiên khắc nghiệt bắt buộc muốn tồn cần có yếu tố đặc biệt giúp có khả chống chịu cao Và người ta mong đợi nhân tố vi nấm nội sinh có ích Ví dụ: Rhyncholacis penicillata loài sống nước Tây Nam Venezuela, nơi mà môi trường nước khắc nghiệt, bị va đập tác dụng nước cuốn, mảnh vụn, đá sỏi…làm cho bị tổn thương Từ nấm gây bệnh thực vật xâm nhập, khỏe mạnh, bảo vệ vi nấm nội sinh có Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng Serratia marcescens ly trích từ R penicillata có khả sản xuất oocydin A, hợp chất kháng nấm 2.3.2 Thực vật sử dụng dược liệu dân gian: Một số loài thực vật sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời sang đời khác để chữa lành vết thương, kháng nấm, kháng khuẩn…ví dụ như, Kennedia nigriscans, loài leo Úc dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thương, sát trùng Từ ly trích chủng Streptomyces sp NRRL 30562 sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng nấm gây bệnh thực vật, vi khuẩn Plasmodium 2.3.3 Thực vật có tính đặc thù sinh thái: Các thực vật có tuổi thọ cao bất thường, phát triển vùng có biến đổi sinh học lớn, hay sống khu vực đất đai cổ xưa…cũng đối tượng nghiên cứu lý tưởng để cung cấp vi nấm nội sinh lạ 2.4 Một số vi nấm nội sinh sản xuất chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học: Nhiều vi nấm sống nội sinh ly trích, chúng có khả sản sinh chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa hoạt tính sinh học khác 2.4.1 Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh: – Fusarium sp vi nấm ly trích từ Selaginella pallescens, thu nhập từ vùng Bảo vệ thực vật Guanacaste Costa Rica, sản xuất pentaketide CR 337 cho tác dụng mạnh C.albicans – Pestralotiopisis microspora thường gặp rừng mưa, sản xuất nhiều chất có tác dụng sinh học, chất acid ambuic có tác dụng kháng nấm Chất ly trích từ nhiều chủng P.microspora cho chất tượng trưng sản xuất endophyte thực vật nhiều rừng mưa giới Ngoài ra, nhiều chủng nấm chi Pestalotiopsis ly trích từ nguồn thực vật khác, chủng nấm sản xuất kháng sinh kháng nấm Bảng Petralotiopisis spp chất biến dưỡng sinh học Chủng nấm Nguồn ly trích Kháng sinh Tác động sinh học P.microspora Torreya axifolia Pestalopyrone Kháng sinh thực vật Hydroxy-pestalopyrone P.jesteri Các mọc sông Hydroxyl-jesterone Kháng nấm gây bệnh thuộc Papua New jesterone thực vật Guinea – Colletotrichum gloeosporioides loại vi nấm nội sinh Artemisia mongolica sản xuất acid colletotric có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm Helminthosporium sativum – Colletotrichum sp ly trích từ Artemissia annua sản xuất chất biến dưỡng kháng khuẩn, kháng vi nấm gây bệnh cho người vi nấm gây bệnh cho thực vật – Muscodor albus vi nấm ly trích từ cành Quế (Cinnamomum zeylanicum), vi nấm sản xuất số chất bay ức chế vi khuẩn nấm Thành phần hợp chất xác định cấu trúc hóa học GC-MS (sắc ký khí ghép với khối phổ), từ tổng hợp hóa học Các chất tổng hợp có hiệu kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với người – Nodulisporium sp ly trích từ Bontia daphnoides sản xuất hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng ruồi xanh, nhặng… – Muscodor vitigenus ly trích từ dây leo Paullina paullinioides sản sinh napthalen có tác động trừ rệp 2.4.2 Vi nấm nội sinh sản xuất chất có tác động sinh học khác Từ môi trường nuôi cấy vi nấm nội sinh, số chất có tác động chống oxy hóa, làm hạ đường huyết, gây ức chế miễn dịch ly trích Bảng Các vi nấm nội sinh sản xuất chất có tác động sinh học khác STT Vi nấm Nguồn ly trích Tên chất Tác động sinh học Pestalotiopsis Termialia Pestacin Kháng khuẩn chống microspora morobensis Isopestacin oxy hóa Pseudomasssaria Thực vật rừng Nonpeptidal Giảm glucose huyết với sp mưa Châu Phi (L-783,281) chế tương tự insulin sử dụng qua đường uống Fusarium T-wifordii Subglutinol A Giảm lympho bào B T subglutinans Subglutinol B (ức chế miễn dịch) 2.5 Ly trích vi nấm nội sinh: Vi nấm nội sinh có mặt khắp nơi giới thực vật, số lượng chúng tìm thấy thay đổi tùy thuộc vào phận cây, chủng loại môi trường sống Đã có nhiều kĩ thuật ly trích vi nấm nội sinh đề nghị nhiều tác giả khác Nhưng tất quy trình ly trích dựa sở chung là: giải tốt giai đoạn xử lý bề mặt, diệt sinh vật ngoại nhiễm chất sát trùng phương pháp sát trùng Sau tạo điều kiện không nhiễm để thu nhận endophyte phát triển từ nội mô thực vật Tiếp theo chọn nuôi cấy môi trường thích hợp thử hoạt tính sinh học [14,28,29] 2.6 Nuôi cấy chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh: Rất nhiều chất có hoạt tính sinh học tạo vi nấm nội sinh trình sinh trưởng phát triển Tìm kiếm khám phá hoạt chất đích ngắm mà nhà nghiên cứu sinh dược học không ngừng vươn tới Rất nhiều phương pháp ứng dụng để phục vụ công việc Sau chọn lọc chủng vi nấm nội sinh môi trường thích hợp để sản sinh hoạt chất mong muốn, thông thường chủng đưa vào môi trường nuôi cấy lỏng với thông số điều kiện nuôi cấy phù hợp Bước dùng dung môi chiết tách hoạt chất Sản phẩm thu thử hoạt tính sinh học tinh khiết hóa kĩ thuật sắc kí Nuôi cấy nấm nội sinh PDB Nhiệt độ phòng, thu hồi sau tuần V dịch nuôi cấy (20lít) Chiết đồng thể tích EtOAC x lần to phòng Dịch chiết Cô áp suất giảm Cắn (12 g) SKC silicagel (n-hexan:EtOAc 99:1 1:1) Phân đoạn phân đoạn SKC silicagel (n-C6H6:EtOAc 8:2) Xác định cấu trúc Hoạt tính sinh học hợp chất: KS14-1 (12mg) KS14-5 (15mg) Sơ đồ Tiến trình chiết tách tinh khiết hóa ergosterol peroxid phân lập từ chủng nấm Trichomonas konilangbra nội sinh khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.) [1] TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3.1 Các nghiên cứu ở nước Năm 1955, giới tìm 500 chất kháng sinh 20 năm sau, năm 1975 tìm 5.000 chất kháng sinh Theo Berdy, năm 1984 giới biết 13.000 chất kháng sinh sản xuất từ thiên nhiên Theo đó, từ năm 1990, Taxomyces andreanae lần ly trích từ Taxus brevifolia, vi nấm sản xuất paclitaxel - chất ức chế thoi phân bào trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự paclitaxel chiết xuất từ thông đỏ (Taxus) Một số nhà khoa học nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh thuộc chi Thông đỏ tìm thấy hoạt chất taxol (một hoạt chất sử dụng hiệu điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) nấm nội sinh tổng hợp Chi thông đỏ (Taxus) nguồn giàu nấm nội sinh Năm 1995 – 1996, nhà nghiên cứu phân lập hàng trăm loài nấm nội sinh từ thông đỏ Châu Âu, Châu Á Bắc Mỹ Có thể nói thông đỏ kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa phát đáng ý, chúng tương tác với với chủ Những nấm biết có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora Ngoài ra, thông qua chứng miễn dịch học, người ta phát tổng hợp taxol nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng Penicillium sp., Pestalotiopsis sp Truncatella sp Bảng Một số vi nấm nội sinh sản xuất paclitaxel STT Vi nấm nội sinh Nguồn ly trích Pestalotiopsis microspora Taxus wallichiana Pestalotiopsis guepini Wollemia nobilis (cây quý hiếm) Seimatoantlerium Maguireothamnus sprciosus Năm 2000, Strobel cộng nghiên cứu vai trò vi nấm nội sinh Streptomyces sp chủng NRRL 30562 ly trích từ Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) Bacillus anthracis, M.tuberculosis đa kháng số vi khuẩn kháng thuốc khác Streptomyces sp chủng NRRL 30562 phát triển Grevilea pteridifolia phát triển Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin echinomycin cho tác động kháng P.falciparum với LD50=7-10ng/ml [29] Năm 2001, Tan Zou chứng minh vi nấm nội sinh công nhận nguồn phong phú chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học Năm 2003, Strobel cộng nghiên cứu chủng vi nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina ly trích từ Tripterigeum wilfordii, vi nấm sản xuất cryptocandin cryptocin Trong đó, cryptocandin kháng số vi nấm gây bệnh cho người Candida albicans, Trichophyton spp chống số nấm gây bệnh thực vật Sclerotinia sclerotiorum Botrytis cinerea Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae số vi nấm gây bệnh thực vật [16] Cùng năm 2003, T Taechowisan S.lumyong nghiên cứu endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ Zingiber officinale Alpinia galanga Năm 2006, N.S.H.Raviraja cộng nghiên cứu khả kháng nấm vi nấm nội sinh từ dược liệu miền Tây Ấn Độ… Năm 2007, Li cộng tìm vi nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrate có khả sản xuất huperzine A có tác dụng chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, dùng điều trị bệnh Alzheimer Năm 2009, Kusari cộng phân lập Fusarium solani từ Camptotheca acuminate có khả sản xuất camptothecin dẫn xuất (9-methoxycamptothecin 10hydroxycamptothecin) có khả chống ung thư Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy cộng nghiên cứu endophyte Nghệ (Curcuma longa) Các chất dinh dưỡng thân rễ nghệ môi trường sống đa dạng cho nhóm vi khuẩn khác Một số vi khuẩn nội sinh liên quan thúc đẩy tăng trưởng Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp phân lập từ thân rễ củ nghệ hai chủng tìm thấy có khả để sản xuất IAA qua phân tích HPLC [7] Năm 2012, Cui cộng phát vi nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân lập từ Ginkgo biloba có khả sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch 3.2 Các nghiên cứu nước Từ năm 1994, nhà nghiên cứu nước phân lập chủng nấm nội sinh từ vỏ thông đỏ; định tên chủng nấm Đây loài thực vật đặc hữu có Việt Nam, từ lâu nhân dân ta sử dụng vị thuốc Chúng thường phân bố Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, chủ yếu Lâm Đồng Trong đáng ý chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai có mặt tất mẫu vỏ thông đỏ lấy mẫu Chúng phù hợp với hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp tìm thấy vỏ thông đỏ Mỹ nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí mỏng với chất taxol chuẩn [30] Năm 2005, Lê Mai Hương cộng phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn 45 mẫu lấy vùng Yên Tử, Hà Nội vườn thuốc Mê Linh thu 89 chủng vi nấm nội sinh có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập) Từ 32 chủng có hoạt tính, phương pháp lên men tách chiết sơ chọn chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 phân lập từ họ Chôm có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) Fusarium oxyporum [2] Năm 2009, Trần Thị Như Hằng cộng nghiên cứu vi nấm nội sinh khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, chống oxy hóa hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính kháng S.aureus với MIC=25mg/ml Chất ergosterol peroxid biểu hoạt tính độc tế bào mạnh với dòng tế bào thử ung thư gan, ung thư màng tử cung ung thư màng tim [1] Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga cộng sàng lọc chủng vi nấm nội sinh thực vật ngũ sắc (Lanata camara L.) thu chủng Pseudeurotium NS-T1 kháng C.albicans, mã đề (Plantago major L.) thu chủng Fusarium MĐ-TR1 MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng C.albicans MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu chủng Trichoderma TT-L1 kháng C.albicans MRSA; trầu (Piper betle L.) thu chủng Fusarium TR-T1 kháng C.albicans…[3] Năm 2010, nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên đưa biểu đồ quy luật phân bố chủng nấm nội sinh phận thông đỏ (Taxus wallichiana) Theo đó, vi nấm nội sinh phân bố tất phận khác nhau, nhiều (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) (1 chủng) Thử hoạt tính sinh học dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với dòng tế bào ung thư mẫu chiết chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình thái sinh học phân tử định tên chủng nấm Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101và Gongroniella butleri SHT106 Hợp chất SHT46.1 thể hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vân với giá trị IC50 4,19 μg/ml Hợp chất SHT 101.1 biểu khả kháng mạnh vi khuẩn S aureus với MIC 25 μg/ml Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư phổi ung thư vân với giá trị IC50 tương ứng 4,0 3,06 μg/ml Kết thực nghiệm cho thấy chủng nấm lựa chọn có khả ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng Với kết đạt được, dự án góp phần tích cực vào công tác bảo tồn phục hồi hữu hiệu loài thông quý bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam, đồng thời giúp nhà quản lý hiểu biết tốt vai trò vi nấm nội sinh sản phẩm chúng việc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư [30] Năm 2014, Đàm Sao Mai cộng phát môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum phân lập Thông đỏ (Taxus wallichiana) vùng Lạc Dương, Lâm Đồng lượng taxol sinh môi trường nuôi cấy 250,98 mg/kg khối lượng khô MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Phân lập sàng lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học số thuộc họ Rutaceace Zingiberaceae - Định danh chủng mạnh khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu phần mềm BC pharsofl - Chiết tách hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh - Nghiên cứu cấu trúc hóa học tác dụng hoạt tính hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi nấm nội sinh phân lập từ số thuộc họ thực vật Rutaceae Zingiberaceae 5.2 Các phương pháp nghiên cứu 5.2.1 Ly trích vi nấm nội sinh từ thực vật 5.2.1.1 Lấy mẫu dược liệu [29]: a Đối tượng thu mẫu: Thực vật nghiên cứu có đặc điểm sau kết hợp nhiều đặc điểm: • Những tài liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm • Những thuốc theo kinh nghiệm dân gian sử dụng để rửa, chữa trị vết thương lỡ loét bệnh nấm da b Xác định tên khoa học thực vật: dựa theo tên gọi dân gian, mô tả hình thái thực vật, đặc điểm hoa, quả, hạt (nếu có) phận khác, để từ có sở đem so sánh với khóa phân loại tài liệu tham khảo chuyên biệt để xác định tên khoa học thực vật c Nguyên tắc chọn mẫu: • Chọn khỏe mạnh, không còi cọc, không bị sâu hại hay biểu bệnh đốm lá, úng lá… • Thu tất phận rễ, thân, cành, lá, hoa họ thực vật nghiên cứu Mẫu sau thu hái rửa vòi nước, để nơi khô mát sau xử lý phải giữ nhiệt độ thấp (khoảng oC) vòng 24 kịp xử lý 5.2.1.2 Phương pháp xử lý mẫu [14,24,29]: Mẫu xử lý PTN, điều kiện vô trùng tủ cấy bước theo sơ đồ 10 Sơ đồ Quy trình xử lý mẫu Chú ý: Kích thước vị trí cắt để đưa mẫu vào ly trích vi nấm nội sinh: • Rễ: cắt thành đoạn dài 1cm • Lá: cắt thành mảnh vuông diện tích 1x1 cm, vị trí dọc gân lá, bên thịt vị trí đầu, giữa, cuối cuống • Thân cành: cắt bỏ vỏ dao vô trùng, chẻ nhỏ dọc theo thân, cắt thành đoạn dài cm 5.2.1.3 Ly trích vi nấm nội sinh: Giai đoạn 1: Mẫu sau xử lý đặt môi trường thạch, không chứa chất dinh dưỡng khác Các vi nấm nội sinh phát triển chất dinh dưỡng lấy từ mẫu Đĩa thạch đặt mẫu ủ nhiệt độ phòng theo dõi phát triển vi nấm nội sinh khoảng từ 1-2 tuần Vi nấm nội sinh phân biệt với vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát khóm nấm khóm vi khuẩn Sau cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp Từ phân biệt chủng giống khác nhau, ký hiệu chủng Giai đoạn 2: Cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp Dựa vào đặc điểm hình thái mô tả vi học để gộp chung chủng giống nhau, phân biệt chủng khác ký hiệu chủng Các môi trường thường sử dụng thạch khoai tây đường (PDA), thạch Czapeck-Dox (CDA), thạch Sabouraud (SDA) Ủ nhiệt độ phòng theo dõi phát triển vi nấm nội sinh từ 1-2 tuần lâu tùy theo tốc độ phát triển vi nấm nội sinh [14,24] 11 5.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh phóng thích chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học vào môi trường nuôi cấy trình phát triển Các tác động phát đánh giá phương pháp khuếch tán đĩa thạch Phương pháp khuếch tán đĩa thạch: - Cấy chủng vi nấm nội sinh môi trường thích hợp, ủ to phòng từ – 14 ngày cho vi nấm phát triển - Cắt khóm nấm thành khoang thạch tròn đường kính mm (gọi khoanh thạch thử) - Đặt khoanh thạch thử lên mặt thạch trải vi nấm C.albicans (SDA) vi khuẩn MRSA, E.coli, Staphylococcus sp., Streptomyces sp (TSA), mẫu đặt khoanh Làm mẫu chứng - Ủ 37oC 24h vi khuẩn 48h vi nấm - Đọc kết quả: vi nấm cho chất biến dưỡng có tác động kháng khuẩn, kháng nấm hoạt chất khuếch tán từ khoanh thạch thử môi trường cho vòng vô khuẩn xung quanh khoanh thạch thử (KTT) Bảng Mức độ kháng khuẩn, kháng nấm dựa theo đk vòng kháng sinh KTT Mức độ hoạt lực Đường kính vòng kháng sinh (mm) Kháng hoàn toàn Kháng không hoàn toàn +++ ≥ 20 ≥ 30 ++ 13 – 19 20 – 29 + – 12 10 – 19 +/≤1 < 10 0 5.2.3 Định danh chủng vi nấm có hoạt tính mức Chi [16] Tên khoa học chủng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng môi trường có tác động kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa… xác định đến mức chi dựa đặc điểm vi nấm  Các qui tắc định danh - Chủng nấm tuyệt đối khiết (không lẫn nấm mốc VSV khác) - Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần phù hợp - Quan sát ghi lại đặc điểm phân loại chủng vi nấm cần định danh (đặc điểm khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học…) - Dùng chuyên luận nhóm phân loại để định loại nấm đến mức chi - Kiểm tra chủng vi nấm định danh với chủng nấm có sưu tầm mẫu - Viết tên nhóm phân loại với danh pháp quốc tế  Định danh - Định danh sơ kính hiển vi sau nhuộm với Lacto phenol cotton blue để sơ phân loại nấm - Cấy nấm vào môi trường chuyên biệt - Dựa vào hình thái khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, hình dạng…) sắc tố vi nấm tiết môi trường để định danh - Các vi nấm nội sinh định danh theo khóa phân loại Guy St Germain, năm 1995 12 5.2.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học - Môi trường nuôi cấy (nguồn nitơ carbon, nguồn dầu môi trường nuôi cấy) - Nhiệt độ - pH môi trường - Độ thoáng khí - Thời gian nuôi cấy 5.2.5 Chiết tách chất biến dưỡng có tác động sinh học từ chủng vi nấm nội sinh Chiết tách: Thăm dò dung môi chiết tối ưu: n-hexan, dichloromethan (CH 2Cl2), ethyl acetat (EtOAc), chloroform Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy [20,27]: nhằm định tính nhanh hoạt lực chất thu giai đoạn chiết tách - Dịch chiết để bay dung môi đến cắn, hòa cắn methanol dung môi hữu Lấy 10µl dịch thu tẩm vào đĩa giấy kháng sinh - Trải vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp - Đặt đĩa giấy kháng sinh tẩm lên mặt thạch - Ủ 37 oC 24 vi khuẩn 48 vi nấm 5.2.6 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh  Nghiên cứu hoá học • Sắc ký cột Nạp dung môi khai triển tiến hành thu phân đoạn, theo dõi khả phân tách (quan sát màu, chấm silicagel F254 soi UV) Gộp phân đoạn theo dõi sắc ký lớp mỏng • Sắc ký lớp mỏng Thăm dò hệ dung môi khai triển Phát vết UV 254 365 nm, kiểm tra tác động kháng khuẩn vết sắc ký đồ kỹ thuật hình sinh học • Kỹ thuật hình sinh học Dịch chiết cô cắn chấm mỏng khai triển hệ dung môi thích hợp Phát phân tách hợp chất cách soi UV bước sóng 254 nm, 365 nm, thuốc thử vanillin sulfuric… xác định số vết Rf Trải vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp Bản mỏng khai triển, đuổi hết dung môi cắt thành mảnh nhỏ tương ứng với vết sắc ký đồ, đặt đĩa petri trải vi nấm thử nghiệm Để 12 nhiệt độ thấp ([...]... với nấm da Đọc kết quả bằng mắt thường MIC là nồng độ thấp nhất của chất thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn 6 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI CỦA VẤN ĐỀ SẼ ĐI SÂU NGHIÊN CỨU - Phân lập và sàng lọc các vi nấm nội sinh từ một số chi thực vật họ Rutaceace và Zingiberaceace - Định danh đến mức chi các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học - Nghiên cứu chuyên biệt từ một đến hai chủng vi nấm nội sinh sản sinh. .. sinh sản sinh các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hoặc phổ kháng khuẩn rộng và tiến hành định danh ở mức loài - Thu nhận sinh khối các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao đã phân lập được, chiết các hoạt chất và đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất chiết được - Từ kết quả sàng lọc hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh; tiến hành chiết tách, tinh sạch và xác định... Sabouraud (SDA) Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm nội sinh từ 1-2 tuần hoặc lâu hơn tùy theo tốc độ phát triển của vi nấm nội sinh [14,24] 11 5.2.2 Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh sẽ phóng thích chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học vào môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển Các tác động này được phát hiện và đánh giá bằng phương pháp... sẽ được đặt trên môi trường thạch, không chứa các chất dinh dưỡng khác Các vi nấm nội sinh sẽ phát triển bằng chính các chất dinh dưỡng lấy từ mẫu cây Đĩa thạch đã đặt mẫu cây được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm nội sinh trong khoảng từ 1-2 tuần Vi nấm nội sinh được phân biệt với các vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát của khóm nấm và khóm vi khuẩn Sau đó cấy chuyền vi nấm. .. trong methanol hoặc các dung môi hữu cơ Lấy 10µl dịch thu được tẩm vào đĩa giấy kháng sinh - Trải các vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp - Đặt đĩa giấy kháng sinh đã được tẩm lên mặt thạch - Ủ ở 37 oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với vi nấm 5.2.6 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh  Nghiên cứu về hoá học • Sắc ký cột... trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh - Thử nghiệm hoạt tính sinh học các chất kháng khuẩn, kháng nấm thu được 7 NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Luận văn được thực hiện tại: - Bộ môn Vi Sinh – Kí sinh, Khoa Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp HCM - Khoa Dược, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành 8 TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tài liệu tiếng Vi t 14 [1] Trần Thị Như Hằng và cộng sự (2009), Xác định cấu trúc và thử hoạt tính. .. tính sinh học của ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh trên cây Khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep), Tạp chí dược học (400), trang 60-65 [2] Lê Mai Hương và cộng sự (2005), Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn các chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ một số vườn thuốc phía Bắc Vi t Nam, Tạp chí dược học (352), trang 20-23 [3] Nguyễn Đinh Nga và. .. Bản chất GC-MS là sự kết hợp của sắc ký khí (Gas Chromatography) và khối phổ (Mass Spectometry) Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram Xác định thành phần hóa học và định danh các cấu tử trong các hợp chất Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng chất tinh khiết Khối phổ (MS): xác định định tính và định lượng  Nghiên cứu về hoạt tính sinh học Các chủng vi nấm nội. .. chủng vi nấm có hoạt tính ở mức Chi [16] Tên khoa học của các chủng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng ra môi trường có tác động kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa… sẽ được xác định đến mức chi dựa trên các đặc điểm của vi nấm  Các qui tắc chính trong định danh - Chủng nấm tuyệt đối thuần khiết (không lẫn nấm mốc và VSV khác) - Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần phù hợp - Quan sát và ghi... cotton blue để sơ bộ phân loại nấm - Cấy nấm vào các môi trường chuyên biệt - Dựa vào hình thái khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, hình dạng…) và các sắc tố vi nấm tiết ra môi trường để định danh - Các vi nấm nội sinh sẽ được định danh theo khóa phân loại của Guy St Germain, năm 1995 12 5.2.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để các chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học - Môi trường nuôi ... Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học vi nấm nội sinh phân lập từ họ Rutaceae Zingiberaceae với mục tiêu tìm chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao họ thực vật TỔNG QUAN VỀ VI NẤM... thích hợp thử hoạt tính sinh học [14,28,29] 2.6 Nuôi cấy chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh: Rất nhiều chất có hoạt tính sinh học tạo vi nấm nội sinh trình sinh trưởng phát... chất có hoạt tính sinh học mạnh - Nghiên cứu cấu trúc hóa học tác dụng hoạt tính hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi nấm nội