MỤC LỤC MỤC LỤC Hiện có số nghiên cứu trình tự genom chủng vi khuẩn Xoo, gần cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom ba chủng phổ biến là: MAF311018 (Nhật Bản) KACC10331 (Hàn Quốc), PXO99A (Philippin) LỜI CẢM ƠN .i ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v TÓM TẮT vi Phần MỞ ĐẦU .3 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh bạc lúa .6 2.1.1 Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lúa 2.1.2 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc 2.1.3 Quy luật yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 2.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển .7 2.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh .7 2.1.4 Chẩn đoán bệnh bạc 2.1.5 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc 2.2 Vi khuẩn Xoo 2.2.1 Đặc điểm đặc trưng 2.2.2 Đặc điểm genom Xoo Hiện có số nghiên cứu trình tự genom chủng vi khuẩn Xoo, gần cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom ba chủng phổ biến là: MAF311018 (Nhật Bản) KACC10331 (Hàn Quốc), PXO99A (Philippin) 2.2.2.1 Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018 2.2.2.2 Cấu trúc genom Xoo chủng KACC10331 10 2.2.2.3 Cấu trúc genom Xoo chủng PXO99A 11 2.2.3 Những gen quy định tính độc vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related genes) 12 - Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity): 12 - Gen điều hòa HrpX 13 - Nhóm gen avr (avirulence) .15 2.2.4 Trình tự lặp lại (Repeitive sequence) gen vi khuẩn Xoo 16 2.3 Đa dạng chủng Xoo .17 2.3.1 Định nghĩa đa dạng di truyền 17 2.3.2 Thành phần chủng Xoo .17 2.3.2.1 Trên giới 17 2.3.2.2 Tại Việt Nam 18 2.3.3 Các nghiên cứu đa dạng di truyền Xoo 19 2.3.3.1 Các loại thị phân tử ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 19 2.3.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền Xoo giới .19 2.3.3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền Xoo miền Bắc Việt Nam 20 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu 22 3.2.1 Kết nuôi cấy vi khuẩn 22 3.2.2 Phương pháp xác định vi khuẩn Xoo kỹ thuật PCR 23 3.2.3 Phương pháp đánh giá khả sinh trưởng vi khuẩn 25 3.2.5 Phương pháp dùng thị phân tử DNA xác định thành phần chủng vi khuẩn Xoo 27 3.2.6 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 28 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết phân lập, ni cấy xác định xác vi khuẩn Xoo 30 4.1.1 Kết phân lập nuôi cấy 30 4.1.2 Kết xác định vi khuẩn Xoo kỹ thuật PCR 30 4.2 Kết nghiên cứu tốc độ sinh trưởng mẫu vi khuẩn 32 4.3 Kết xác định đa dạng di truyền DNA mẫu vi khuẩn Xoo phương pháp Rep - PCR 35 4.4 Kết lây nhiễm nhân tạo 39 4.5 Mối quan hệ sinh trưởng tính gây bệnh mẫu vi khuẩn nghiên cứu: 40 4.6 Kết so sánh phương pháp nghiên cứu đa dạng mẫu Xoo nghiên cứu 41 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Đề nghị 46 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) gây bệnh nhiệt đới điển hình vùng trồng lúa, đặc biệt vùng thâm canh cao Ở miền Bắc nước ta, bệnh gây hại vụ xuân lẫn vụ mùa hại nhiều giống khác nhau, đặc biệt vụ mùa giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Bên cạnh đó, chủng vi khuẩn Xoo ngày phong phú phức tạp, thành phần lồi tính độc Để phịng trừ bệnh bạc người ta sử dụng nhiều biện pháp khác như: dùng thuốc hóa học; bón phân sớm, cân đối; vệ sinh đồng ruộng; mật độ gieo trồng hợp lý; dùng giống kháng bệnh Trong sử dụng giống kháng bệnh giải pháp quan trọng, có hiệu kinh tế, khơng gây ảnh hưởng tới chất lượng nông sản an tồn với người sử dụng, khơng gây nhiễm mơi trường Muốn tạo giống kháng bệnh bền vững trước hết phải có nguồn gen kháng hữu hiệu, phải xác định xác số lượng thành phần chủng lồi gây bệnh có vùng Tuy nhiên, gen kháng kháng chủng lại không kháng chủng khác, chủng nhiễm giống lúa giống lúa khác không bị nhiễm Vì để tạo giống kháng bạc bền vững cần lai quy tụ nhiều gen kháng vào giống luá Hiện người ta phân lập 30 chủng vi khuẩn Xoo, tương ứng xác định 30 gen kháng bệnh bạc khác Ở nước có số chủng gây bệnh định, Philippin có chủng, Ấn Độ có chủng, Nhật Bản có 12 chủng Phan Hữu Tơn cộng sự, 2002 phân lập 12 chủng Xoo miền Bắc Việt Nam sở lây nhiễm dòng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm tạm thời phân miền Bắc tồn 10 chủng; đồng thời xác định gen kháng hữu hiệu Xa4, xa5, Xa7 Xa21 kháng mạnh kháng hầu hết chủng vi khuẩn phân lập Nếu việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc cần đưa gen Xa4, xa5, Xa7, Xa21 vào giống, cơng việc dễ dàng nhiều so với chuyển đa gen kháng Tuy nhiên có phải chủng vi khuẩn không khác nhiều nên đánh giá tính kháng gen kháng chưa xác? Vì vấn đề xác định xác mức độ đa dạng thành phần chủng vi khuẩn Xoo thực cần thiết để tạo giống lúa kháng bạc bền vững Theo phương pháp truyền thống, để xác định thành phần chủng, tiến hành phân lập vi khuẩn từ bị bệnh, sau lây nhiễm nhân tạo dòng đẳng gen, sở phổ kháng nhiễm phân chủng Tuy nhiên, phương pháp lây nhiễm nhân tạo có số nhược điểm phụ thuộc vào thời tiết, địa hình, tốn thời gian, nhiều kết thu chưa thật xác Để khắc phục nhược điểm cần thiết phải xác định cách xác đa dạng di truyền chủng mức phân tử Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu xác định thành phần chủng vi sinh vật gây bệnh Lee cộng 2005 lần công bố xác định trình tự genome vi khuẩn Xoo, vịng genome dài 4,9 triệu bp Đã xác định vùng gen bảo thủ đặc trưng cho vi khuẩn Xoo vùng biến động nhiều chủng Đồng thời xác định phổ enzyme, phổ protein vi khuẩn Xoo Với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, phương pháp sử dụng thị phân tử (DNA, Protein hay Isozyme) xác định đa dạng di truyền chủng áp dụng gặt hái nhiều thành công Nghiên cứu Phan Thanh Tùng 2008 sử dụng kỹ thuật rep-PCR IS-PCR xác định đa dạng số chủng vi khuẩn thu thập số tỉnh miền Bắc Việt Nam năm 2007, so sánh với chủng Phan Hữu Tôn cs thu thập 2002; kết cho thấy số lượng chủng bạc miền Bắc nước ta tăng lên nhanh chóng đa dạng, địi hỏi cần phải có nghiên cứu xác chủng vi khuẩn Xoo tồn để lựa chọn gen kháng hữu hiệu, từ có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững Do việc thu thập mẫu bệnh phân loại chúng công việc cần phải làm thường xuyên Vì hướng dẫn môn CNSHƯD, tiến hành đề tài: “Xác định đa dạng di truyền chủng vi khuẩn bạc lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae miền Bắc Việt Nam thị phân tử” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu đa dạng di truyền mức phân tử DNA mẫu vi khuẩn Xoo, từ phân chia thành nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lúa 1.2.2 Yêu cầu - Nuôi cấy, tách chiết DNA vi khuẩn xác định xác mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu - Xác định khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Xoo phương pháp đo OD - Sử dụng kỹ thuật rep-PCR để xác định đa dạng di truyền chủng vi khuẩn Xoo, sở phân chia chủng - Lây nhiễm dòng đẳng đơn gen, đa gen, xác định tính độc mẫu vi khuẩn phổ kháng nhiễm Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh bạc lúa 2.1.1 Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lúa Bệnh bạc lúa phát Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884 Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh acid đất (Bokura, 1911) Nhưng không lâu sau đó, người ta cơng nhận ngun nhân vi khuẩn gây nên theo Ishiyama, 1922 thuộc loại Bacillus oryzae Vi khuẩn sau Mizukami, Wakimoto, 1969 đặt tên Pseudomonas oryzae, cuối Oku, 1972 xác định vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên Bệnh bạc lúa trở nên phổ biến tất vùng trồng lúa khắp giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 kỉ XX, đặc biệt nước trồng lúa Châu Á như: Indonexia (1950), Philippin (1957), Trung Quốc (1957), Ấn Độ (1990) … Hàng năm, theo thống kê suất lúa toàn giới giảm từ 10-20% bệnh vi khuẩn, 50% bệnh bạc gây nên (Mew, 1989) Tác hại bệnh chủ yếu làm cho địng sớm tàn khơ xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm suất lúa 2.1.2 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc Vi khuẩn Xoo gây triệu chứng điển hình bệnh bạc lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn gọi Kresek) Cho đến mối quan hệ triệu chứng chưa làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm nhà lưới chứng minh tượng Kresek bạc khác rõ rệt chúng triệu chứng ban đầu nhiễm bệnh Khi bị bệnh, vết bệnh lan dần từ mép vào phiến lá, kéo dài theo gân chính, có vết bệnh từ phiến lan rộng Vết bệnh lan từ mép ngồi vào gân theo đường gợn sóng Vào lúc trời ẩm buổi sáng sớm, đầu mép có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn màu hổ phách Hình 2.1 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lúa 2.1.3 Quy luật yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 2.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển Bệnh bạc phát sinh phát triển mạnh vụ mùa tỉnh phía Bắc Bệnh phát triển, lây lan nhanh điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90%, đặc biệt có mưa to gió lớn làm rập nát lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan Vì vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng vụ xuân Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai đoạn lúa làm địng đến chín sữa giai đoạn lúa mẫn cảm với bệnh bạc Sự có mặt chủng vi khuẩn bạc phụ thuộc vào cấu giống lúa điều kiện tự nhiên vùng 2.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến phát sinh phát triển bệnh Ẩm độ lượng mưa hai yếu tố định cho phát sinh phát triển bệnh bạc lá, lượng mưa lớn nhiều kèm theo gió bão khơng làm tổn thương đến khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn lây lan nhanh chóng Phân bón thời kỳ bón yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến phát sinh phát triển bệnh Lượng đạm bón lớn làm thân phát triển mạnh, mềm yếu dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh Đất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ; đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng, bệnh phát triển mạnh Giống yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh phát triển bệnh bạc 2.1.4 Chẩn đoán bệnh bạc Hiện có nhiều phương pháp khác để chẩn đoán bệnh bạc Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Có thể kể vài phương pháp kỹ thuật chẩn đoán phổ biến sau: quan sát trực tiếp mẫu bệnh; phương pháp giọt dịch; phương pháp Test ELISA; phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct tissue blotting), sử dụng que DNA/RNA; phương pháp thấm hút nén (Squash blot method); phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Xoo XOR-R2 XOR-F Trong số phương pháp kể phương pháp xác định vi khuẩn Xoo kỹ thuật PCR tiên tiến cho kết xác Phương pháp khắc phục nhược điểm phương pháp khác phương pháp thích hợp sử dụng điều kiện nghiên cứu phòng thí nghiệm 2.1.5 Các biện pháp phịng trừ bệnh bạc Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốc trừ bệnh, bón phân cách, thích hợp, điều chỉnh mực nước hợp lý trồng giống kháng bệnh Ngồi cịn có biện pháp xử lý hạt giống trước gieo Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh coi biện pháp có hiệu khả thi 2.2 Vi khuẩn Xoo 2.2.1 Đặc điểm đặc trưng Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu trịn, có lơng roi đầu, kích thước 0.7-2 x 0,4-0,7 µm Trên mơi trường nhân tạo khuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình trịn, màu vàng sáp (do hình thành sắc tố xanthomonadin), rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm Xoo tạo nhiều polysacharide ngoại bào EPS, có vai trị quan trọng việc hình thành giọt dịch vi khuẩn bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô tạo điều kiện cho vi khuẩn phát tán nhờ gió, mưa Vi khuẩn khơng có khả phân giải nitrat, khơng dịch hố gelatin, khơng tạo NH3, tạo H2S, tạo khí khơng tạo axít mơi trường có đường Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 30 0C, nhiệt độ tối thiểu - 50C, tối đa 400C cao 530C làm vi khuẩn chết Vi khuẩn sống phạm vi pH rộng từ 5,7 - 8,5, thích hợp pH 6,8 - 7,2 Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Xoo khuẩn lạc Xoo môi trường nhân tạo 2.2.2 Đặc điểm genom Xoo Hiện có số nghiên cứu trình tự genom chủng vi khuẩn Xoo, gần cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom ba chủng phổ biến là: MAF311018 (Nhật Bản) KACC10331 (Hàn Quốc), PXO99A (Philippin) 2.2.2.1 Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018 Cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 thể tám vòng tròn Vòng biểu chiều dài vùng gen đơn vị 100 kb, vòng thứ biểu vị trí gen theo hướng phiên mã khác tương ứng Những gen xác định rõ chức ký hiệu màu vàng, gen chưa xác định rõ chức ký hiệu màu xanh Vịng trịn thứ tư biểu vị trí tụ tập gen hrp gen gây độc avr ký hiệu màu xanh Vòng tròn thứ năm biểu vị trí trình tự gắn chèn Vịng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + G trung bình 20kb đoạn Vịng số bẩy biểu vị trí gen mã hóa tạo tRNA rRNA vi khuẩn Cuối vịng số tám biểu vị trí prophage gen phage Hình 2.3 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 Theo genom Xoo chủng MAFF311018 gồm nhiễm sắc thể vòng dài 4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7% Bên khơng phát thấy có chứa thể plasmid Trong phát thấy có hai copy operon rrn thứ tự liền kề số gen sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành tRNAs đại diện cho 43 loại tRNA khác Trong tổng số 4.372 khung đọc mở phát (ORFs) genom chủng MAFF311018 có 2.799 (64%) gen xác định chức năng, 1.383 (32%) proteins xác định tương đồng với nhiều protein điển hình vi khuẩn Xoo chưa biết rõ chức Có 190 gen (4%) xác định không tương đồng rõ rệt với gen xác định công bố trước vi khuẩn 2.2.2.2 Cấu trúc genom Xoo chủng KACC10331 Theo Lee cộng sự, 2005 genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có cấu trúc sau: tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439bp, với hàm lượng C + G chiếm 63.7% Genom có 4637 khung đọc mở, có 3340 (72.0%) xác định chức Khoảng 80% số gen phát thấy 10 135 1 0 0 1 0 6/ 16 134 1 0 0 0 1 0 0 4/ 16 59 0 0 0 0 0 0 0 2/ 16 49 0 0 0 1 0 0 4/ 16 47 0 0 0 1 1 0 4/ 16 R7 0 0 0 0 0 0 0 2/ 16 R10 0 0 0 0 0 0 3/6 R14 0 0 0 0 1 1 1 6/16 52 507 0 0 0 0 0 0 0 2/16 554 0 0 0 0 0 0 3/16 568 0 1 1 0 0 0 6/16 596 1 1 1 0 0 0 7/16 664 1 1 1 0 0 0 7/16 679 0 0 0 0 0 0 0 1/16 743 0 0 0 0 0 0 2/16 791 1 1 1 0 0 0 8/16 Bảng Hệ số đồng dạng di truyền 16 mẫu vi khuẩn nghiên cứu dựa phản ứng Rep-PCR "SIMQUAL: input=C:\Documents and Settings\home\My Documents\ca moi.xls, coeff=SM" by Cols 16L 16 135 134 59 49 47 R7 R10 R14 507 554 568 596 664 679 743 791 135 0.842 0.711 0.763 0.526 0.763 0.632 0.763 0.605 0.789 0.632 0.474 0.526 0.605 0.763 0.526 134 59 49 47 R7 R10 R14 507 554 568 596 664 679 743 791 0.816 0.763 0.605 0.921 0.737 0.710 0.711 0.842 0.737 0.579 0.474 0.658 0.763 0.421 0.842 0.632 0.842 0.711 0.632 0.632 0.763 0.658 0.553 0.447 0.684 0.737 0.447 0.605 0.789 0.658 0.684 0.579 0.763 0.605 0.447 0.447 0.526 0.737 0.500 0.605 0.632 0.658 0.605 0.579 0.579 0.684 0.421 0.553 0.553 0.526 0.763 0.737 0.737 0.868 0.763 0.605 0.500 0.684 0.789 0.500 0.710 0.868 0.842 0.842 0.737 0.632 0.658 0.868 0.632 0.684 0.763 0.711 0.500 0.500 0.632 0.789 0.500 0.763 0.763 0.605 0.553 0.632 0.737 0.553 0.842 0.632 0.579 0.711 0.921 0.579 0.789 0.684 0.605 0.816 0.684 0.684 0.553 0.658 0.789 0.605 0.658 0.737 0.684 0.447 0.658 53 Bảng Chiều dài vết bệnh lây nhiễm nhân tạo dòng đẳng đơn gen IR24(cm) IR BB1 BB2 BB3 BB4 BB5 22,5 26,8 18,3 22,4 5,18 17,1 6,10 16,8 15,5 10,7 7,08 16,5 0,66 12,4 12,8 12,6 3,82 13,9 2,22 16,0 7,02 12,5 6,24 12,3 2,60 15,4 1,38 14,7 15,4 13,8 2,56 18,2 18,3 12,9 7,86 11,5 1,12 24,9 27,2 14,8 1,48 12,5 24,4 14,6 7,04 20,9 1,73 10,3 12,3 12,4 2,00 9,08 20,0 21,7 13,6 20,2 8,34 12,4 14,2 1,64 26,1 2,20 19,8 13,5 2,60 26,0 23,9 13,6 7,94 5,30 15,8 10,5 1,90 1,00 BB7 Mẫu R7 R10 R14 135 134 59 49 47 507 554 568 596 664 679 743 791 BB1 BB1 BB1 BB2 24.31 3,86 0,96 26,51 24,27 15,40 15.24 0,82 22,00 19,56 11,50 14.85 5,20 20,10 18,24 15,06 20.27 0,48 2,20 12,44 12,92 13,32 18.92 1,22 12,32 3,38 1,32 8,48 0,92 12.07 4,38 14,02 13.58 0,86 8,64 17,04 10,98 15.95 2,80 12,2 13,08 21,42 9,98 1,68 14.05 25,46 8,66 16.58 6,48 14,88 14,68 1,20 13.57 0,92 13,30 3,76 2,34 24 23.08 18.22 17.94 17.00 16.75 15.92 18.90 12.20 24.70 15.78 15.28 17.68 1,56 23,16 19,32 10,44 14.75 17.72 0,44 12,2 1,06 0,60 2,78 2,98 13,50 15,26 7,36 1,48 19,88 21,36 17,88 0,58 16,36 22.06 12,82 4,70 20,56 23,78 13.60 25,98 21.37 0,36 0,16 54 0,14 8,14 55 Bảng Chiều dài vết bệnh lây nhiễm nhân tạo dòng đẳng đa gen (cm) IRBB 1/5 1/7 1/10 1/11 20.2 3.2 13 1.5 16 1.8 3.5 R14 135 134 1.6 2.6 17 3.8 1.3 2.3 4.2 7.2 4.2 19.6 15.2 1.7 6.3 14.2 1.8 12.3 16.1 5.2 2.4 15.5 16.4 59 49 47 507 554 7.8 13.5 6.2 19.2 11 15.6 4.5 7.3 6.2 7.6 4.1 1.5 10.2 1.3 2.5 14.1 13.0 12.6 19.6 15.6 17.5 5.3 12.5 17.6 24.5 0.9 3.1 7.0 8.4 2.1 10.2 18.2 18.2 13.0 7.0 568 18 7.1 0.3 8.2 18.3 2.0 11.5 6.3 10.2 5.6 3.5 1.8 0.7 10.2 1.9 13.7 Mẫu R7 R10 596 664 679 743 791 1/4 3/7 3/10 4/5 4/7 4/10 4/11 5/7 5/10 5/11 23.1 14.2 2.6 6.2 0.2 4.1 0.4 16.3 5.6 4.2 0.3 0.8 0.6 8.5 5.6 4.9 20.2 20.3 4.5 5.1 0.8 5.2 8.2 1.2 7.6 4.3 1.5 3.2 0.4 2.5 2.0 1.5 0.4 0.6 0.7 7.6 0.8 0.9 8.0 4.8 14.6 0.8 1.3 3.0 1.2 0.8 13.0 15.1 17.5 20.2 5.3 1.5 7.1 1.5 1.4 1.2 1.7 1.2 10.2 19.2 7.7 15.8 20.6 17.6 12.7 13.8 16.4 18.8 14.3 4.0 2.3 5.1 5.1 5.6 14.3 12.9 13.4 17.5 18.6 55 4.2 4.0 1.5 6.1 8.3 10.7 9.1 13.2 15.0 5.6 4.3 7.4 7.1 1.8 12.6 3.2 13.4 2.1 9.0 5.4 8.1 12.3 7.5 5.1 5.1 10.5 6.2 5.1 9.4 13.5 6.5 9.4 4.8 10.3 4.2 6.4 1.8 3.6 1.5 2.1 2.4 0.6 14.6 3.1 1.2 2.4 5.1 4.0 6.5 7/10 8.2 3.5 9.4 14.2 1.9 1.5 2.0 0.8 12.5 13.0 5.6 8.7 14.0 0.5 5.6 1.3 5.4 10.5 13.0 7.2 14.8 12.0 1.6 5.8 6.1 5.3 7.6 8.0 12.3 1.8 4.5 7.3 10.2 Bảng Bảng thống kê kháng nhiễm dòng thị với mẫu vi khuẩn nghiên cứu dạng nhị thức (nhiễm trung bình ghi 1, kháng ghi 0) IRBB 10 11 21 7/10 1/4 1/5 1/7 1/10 1/11 3/7 3/10 4/5 4/7 4/10 4/11 5/7 5/10 5/11 Mẫu Xoo R7 1 0 0 R10 1 0 R14 1 1 0 135 1 0 134 0 0 59 1 1 0 49 1 0 47 1 1 0 507 1 0 1 554 1 1 0 568 1 1 1 596 1 1 0 664 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 56 0 0 0 0 1 679 1 1 743 1 0 791 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 57 0 Bảng Hệ số đồng dạng di truyền 16 mẫu vi khuẩn nghiên cứu dựa phản ứng kháng nhiễm " SIMQUAL: input=G:\SIMILARITY KIEU HINH.xls, coeff=SM " by Cols 16L 16 R7 R7 R10 R14 135 134 59 49 47 507 554 568 596 R10 0.88 R14 0.92 135 0.60 134 0.72 0.88 0.72 0.68 0.60 0.64 0.56 59 49 47 507 554 568 596 0.76 0.8 0.64 0.76 0.80 0.60 0.76 0.72 0.76 0.68 0.72 0.84 0.64 0.80 0.84 0.80 0.72 0.76 0.88 0.68 0.84 0.52 0.64 0.48 0.60 0.64 0.52 0.60 0.72 0.68 0.68 0.72 0.60 0.64 0.72 0.80 0.88 0.76 0.88 0.84 0.84 0.68 0.80 0.76 0.64 0.72 0.64 0.76 0.72 0.80 0.64 0.60 0.76 0.80 0.72 0.76 664 0.64 0.72 0.80 0.56 0.68 0.76 0.76 0.52 0.64 0.72 0.80 0.56 0.56 0.56 0.64 0.48 0.84 0.76 0.84 0.60 0.64 0.72 0.88 0.72 0.68 0.68 0.84 0.68 0.60 0.76 0.76 0.76 0.72 0.64 0.88 0.72 0.52 0.68 0.76 0.60 0.56 0.72 0.72 0.64 0.72 0.72 0.80 0.64 679 743 791 57 664 679 743 791 0.68 0.76 0.52 0.76 0.60 0.76 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐĐề tài: Xác định đa dạng di truyền chủng vi khuẩn bạc lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae miền Bắc Việt Nam thị phân tử Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phan Hữu Tôn KS Tống Văn Hải Sinh viên thực Lớp Bộ môn CNSH ứng dụng : Tạ Văn Hạnh : CNSH – K51 “ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nơng nghiệp Hà Nội phần yêu cầu trình độ đại học ngành Cơng nghệ sinh học” HÀ NỢI - 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài thực tập tốt nghiệp nỗ lực, phấn đấu thân tơi, tơi cịn nhận giúp đỡ thầy, giáo, gia đình, bạn bè người thân Với lịng chân thành tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Phan Hữu Tôn người chu đáo, tận tình, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập hoàn chỉnh báo cáo tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Tống Văn Hải, người ln tận tình, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hoàn thành luận văn Đồng thời xin cảm ơn anh Phan Thanh Tùng, người hướng dẫn, bảo tơi q trình thực đề tài chỉnh sửa luận văn Bên cạnh đó, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới hai thầy TS Hà Viết Cường TS Nguyễn Xuân Nghiêm đóng góp cho tơi tài liệu tham khảo có ý nghĩa Qua đây, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người bên cạnh động viên, quan tâm, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 02 tháng 08 năm 2010 Sinh viên Tạ Văn Hạnh i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AD Activated Domain avr Avirulence CNSH Công nghệ Sinh học CNSHƯD Công nghệ Sinh học Ứng dụng CRISPR Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats cs Cộng dNTP Deoxyribose Nucleotide Triphosphate ERIC Enterobachterial Repetitive Intergensis Conversus ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EST Esterase EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid EPS Extracellualar polysacharide G6PH Glucose 6-phosphate dehydrogenase hrp hypersensitive reaction and pathogenicity IS-PCR Insert - Polymerase Chain Reaction IS Insertion NST Nhiễm sắc thể NLS Nuclear Localization Signal ORFs Open Reading Frames OD Optical Density PXO Philippin Xanthomonas oryzae pv oryzae RAPD Random Amplified Polymorphic DNA REPs Repetitive Extragensis Palidromic Rep-PCR Repetitive sequence primed - PCR RFLP Retriction Fragment Lenght Polymorphism RNA Ribose Nucleic Axit SKDH Shikimate dehydrogenase Tris-HCl Xac Tris hydroxymethyl aminomethane X axonpodis pv Citri ii Xcc X campestris pv campestris iii DANH MỤC BẢNG Hiện có số nghiên cứu trình tự genom chủng vi khuẩn Xoo, gần cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom ba chủng phổ biến là: MAF311018 (Nhật Bản) KACC10331 (Hàn Quốc), PXO99A (Philippin) - Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity): .12 - Gen điều hòa HrpX 13 - Nhóm gen avr (avirulence) 15 Bảng 2.2 Bảng liệt kê 17 copy thành viên họ gen avrBs3/pth 15 Bảng 3.1 Danh sách nguồn gốc mẫu vi khuẩn phân lập 21 Bảng 3.2 Các kiểu phản ứng với dòng đẳng đơn gen chủng vi khuẩn Xoo miền Bắc Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2003) 29 Bảng 4.1 Kết đo OD 10 mẫu vi khuẩn .33 Bảng 4.2 Thời gian pha sinh trưởng mẫu vi khuẩn 34 Bảng 4.3 Kết đánh giá lây nhiễm nhân tạo (phổ kháng nhiễm) với dòng đẳng đơn gen 37 Bảng 4.4 Kết đánh giá lây nhiễm nhân tạo (phổ kháng nhiễm) với dòng đẳng đa gen 38 Bảng 4.5 So sánh kết phương pháp phân loại Rep-PCR lây nhiễm nhân tạo 43 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lúa Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Xoo khuẩn lạc Xoo mơi trường nhân tạo Hiện có số nghiên cứu trình tự genom chủng vi khuẩn Xoo, gần cơng trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom ba chủng phổ biến là: MAF311018 (Nhật Bản) KACC10331 (Hàn Quốc), PXO99A (Philippin) Hình 2.3 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 .10 Hình 2.4 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 11 Hình 2.5 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng PXO99A 12 - Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity): .12 Hình 2.6 So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp loài vi khuẩn Xoo, Xcc Xac .13 - Gen điều hòa HrpX 13 - Nhóm gen avr (avirulence) 15 Hình 2.7 Bản đồ vị trí gen khơng độc avr/pth vi khuẩn Xoo 16 Hình 4.1 Vi khuẩn ni cấy môi trường thạch nghiêng ống nghiệm 30 Hình 4.2 Kết điện di DNA tổng số vi khuẩn Xoo 31 Hình 4.3 Kết PCR cặp mồi XOR – R2 XOR – F .32 Hình 4.4 Vi khuẩn nuôi môi trường lỏng lắc .32 Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng 10 mẫu vi khuẩn .33 Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi BOXA1RF 36 Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi ERIC 1RF 36 Hình 4.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi ERIC 2F 37 Hình 4.9 Cây phân loại dựa trình tự nhân lên từ mồi BOXA 1RF, mồi ERIC 1RF mồi ERIC 2F 16 mẫu vi khuẩn nghiên cứu .38 Hình 4.10 Cây phân loại dựa phổ kháng nhiễm dòng lúa thị 16 mẫu vi khuẩn nghiên cứu 42 Hình 4.11 So sánh phân loại phương pháp nghiên cứu hệ số tương đồng 0,9 43 v TÓM TẮT Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra, bệnh nhiệt đới nguy hiểm lúa Ở miền Bắc nước ta, bệnh gây hại vụ xuân lẫn vụ mùa hại nhiều giống khác nhau, đặc biệt vụ mùa giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Bên cạnh số lượng chủng bạc miền Bắc nước ta tăng lên nhanh chóng đa dạng, địi hỏi cần phải có nghiên cứu xác chủng vi khuẩn Xoo tồn để lựa chọn gen kháng hữu hiệu, từ có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững Do việc thu thập mẫu bệnh phân loại chúng công việc cần phải làm thường xuyên Trong nghiên cứu này, mười tám mẫu vi khuẩn Xoo phân loại thành nhóm khác dựa phương pháp, PCR sử dụng trình tự mồi đơn thiết kế dựa trình tự lặp lại gen Xoo (Rep-PCR) lây nhiễm nhân tạo dòng đẳng gen chứa gen kháng đơn đa Kết phân loại 14 nhóm vi khuẩn phương pháp Rep-PCR 11 nhóm dựa phương pháp lây nhiễm nhân tạo; đồng thời lý giải sai khác phương pháp Trong nghiên cứu bước đầu cho thấy mối quan hệ tốc độ sinh trưởng Xoo với mức độ nhiễm bệnh Thông qua lây nhiễm nhân tạo, khẳng định lại gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 kháng tốt với mẫu vi khuẩn phân lập miền Bắc Việt Nam Đồng thời dòng lúa đa gen chứa gen kháng kháng tốt với mẫu vi khuẩn nghiên cứu Điều có ý nghĩa thực tiễn nhà chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững miền Bắc Việt Nam vi ... tài: ? ?Xác định đa dạng di truyền chủng vi khuẩn bạc lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae miền Bắc Vi? ??t Nam thị phân tử? ?? 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu đa dạng di truyền mức phân tử DNA... mẫu vi khuẩn Xoo, từ phân chia thành nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lúa 1.2.2 Yêu cầu - Nuôi cấy, tách chiết DNA vi khuẩn xác định xác mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu - Xác định khả sinh trưởng chủng. .. chủng vi khuẩn Xoo phương pháp đo OD - Sử dụng kỹ thuật rep-PCR để xác định đa dạng di truyền chủng vi khuẩn Xoo, sở phân chia chủng - Lây nhiễm dòng đẳng đơn gen, đa gen, xác định tính độc mẫu vi