PHƯƠNG PHAP PHAT HIẸN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN I/ SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN LÀ GÌ ? Sinh vật biến đổi di truyền (hay có tên khác sinh vật biến đổi gen, GMO) sinh vật mà vật liệu di truyền bị biến đổi theo ý muốn chủ quan người Ngoài có sinh vật tạo trình lan truyền gen tự nhiên Ví dụ trình lai xa cỏ dại với trồng biến đổi gen có họ hàng tạo loài cỏ dại mang gen biến đổi Sinh vật biến đổi gene có nhiều loại khác Nó dòng lúa mỳ thương Cá chép mại (Common có gen bị carp) biếnchuyến đổi dogen tia điện hormone từ (tia sinh X) trưởng tia phóng xạ từ năm 1950 Nó động vật thí nghiệm chuyển gen chuột bạch loại vi sinh vật bị biến đổi cho mục đích nghiên cứu di truyền Tuy nhiên, nói đến GMO người ta thường đề cập đến thể sinh vật mang gen loài khác để tạo dạng chưa tồn tự nhiên II/ ỨNG DUNG CỦA CÁC SINH VẨT BIỂN GEN Đôn ợ vât biến đổi ợen • Taọ động vật có tốc độ lớn nhanh, hiệu sử dụng thức ăn cao Trong hướng này, người ta tập trung chủ yếu vào việc đưa tổ hợp bao gồm gen cấu trúc hormone sinh trưởng promoter methallothionein vàoPhi động vật Cho đến người đưa sinh thành Cá trê Châu (Channel catỷỉsh) chuyển gentahormone trưởng công gen vào thỏ, lợn cừu Kết động vật chuyển gen không to lên chuột Bò Động vật Thời Thời Số Sản Số lượng sữa tiết gian gian tháng lứa man thành tiết Bảng 4.1: Một vài thông số liên quan đến việc tiết sữa động vật có vú (Pollock Daniel p., 1999) 15 4001 600 8001 18 16 18 30 Cá hồi chuyến gen hormone sinh trưởng (phải) cá hồi đối chứng (trái) • Tạo động vật chuyên sản xuất protein quý dùng y dược Sản xuất protein thông qua việc sản xuất sữa có nhiều lợi thế: -Tuyến sữa động vật có vú quan sản xuất sinh học thích nghi cao độ cho tiết -Tuyến sữa hệ thống sản xuất khổng lồ có khả tạo từ 23g (bò sữa) đến 205g (chuột) protein/kg thể thời kỳ tiết sữa tối đa - Nồng độ tế bào tuyến sữa động vật có vú lớn nuôi cấy tế bào thông thường từ 100 đến 1000 lần - Nhiều protein sản xuất tuyến sữa động vật có vú có hoạt tính dược cao quan có đủ điều kiện thực “chín hóa“ (maturation) protein - Sữa dịch tiết thể thu nhận cách dễ dàng nhất, đặc biệt từ động vật nhai lại - Sự biểu gen tuyến sữa động vật có vú Tăng a-CN Íi-CN Tăng khả bền vững sữa đông cho việc làm phó-mát, cải tiếnGen tính bền vững nhiệt tăng hàm lượng calcium lợn, cừu, mở khả tạo giống vật nuôi miễn dịch Tăng vị trí phosphoryl hoánhiều Tăng lượng cải gen chống lạnh với bệnh hàm cá, ngườicalcium ta chuyển casein tiến AFP (antifreeze protein) hoá nhũ tạo tương giống cá có khả thể chống (cá hồi, cá vàng ) Đưa trình tự bảo phânvệ giải protein Tănglại tốclạnh độgiáphát triển kết cấu vào casein (cải tiến chín phó-mát) • Nâng cao suất chất lượng động vật cách thay đổi Tăng nồng độ kappa-CN Tăng chuyển tính ổn sựđộng kết vật tụ đường hóađịnh trongcủa thể casein, giảm kích thước mixen keo (gelation) Nhiều phươnggiảm phápđông đề xuất để đông nâng cao chất lượng tụ (coagulation) dinh dưỡng để cải tiến hiệu sản phẩm sản xuất Tiết Íi-LG từ sữa phó-mát, sữa chua Giảmkem đông keo (Bảng nhiệt 4.4) độ cao, cải tiến tính tiêu hoá, giảm dị ứng nguồn cysteinnghiên sơ cấp Trong hướng giảm bật cứu nâng cao chất lượng sữa bò, sữa cừu sữa cách chuyển gen lactose vào đối tượng quan tâm Sự biểu gen điều khiển Giảm a-LA Giảm lactose, tăng khả promoter củaT Thu tuyến sữa Trong sữa động vật chuyển gen nhận sừa từ động vật chuyển gen thương mại sữa, giảm (VVall R J, 1997) hình thành tinh thể nước đá, • Tạo vật nuôi làm chuyển gen nội quan cấy ghép cho giảm sựcung điềucấp khiển tính thấm người củadược tuyến tiếtsữa Thêm lactoterin người Tăng cường hấp thu sắt Yếu tố việc tạo vật nuôi chuyển gen để cung tr bảo vệ chống lại nhiễm trùng cấp nội quan cấy ghép cho bệnh nhân ngăn cản loại thải ruột o tố bổ sung thuộc hệ miễn dịch thể ghép nhờ hoạt hoá nhân Tăng tốc độ chín Thêm trình tự người phânCácgiải nhà khoa học tạophó-mát lợn chuyển gen biểu gen protein vào ?-CNmã hoá nhân tố ngăn cản bổ sung người (human complement inhibitory nhân làm tăng Giảm biểu acetylGiảm tactors) hàm lượng mỡ,tố cải tiến nhanh phân tactor) dinh (Rosengard, CoA cacboxylasehuỷ (decay-accelerating chất lượng dưỡng 1995) giảm Mục tiêu tiếp tục nghiên cứu.sản xuất sữa giá thành Biểu gen Ig Bảo vệ (Jeff chống lại các1994) bệnh D Hardin, Sẩn phẩm tinh khiết gen quan tâm Salmonella Listeria Tạo sữa giống sữa người Thay gen protein sữa bò gen protein sữa người • Tạo động vật chống chịu bệnh tật thay đồi điều kiện môi trường Cystic íibrosis CFTR 0’Neal,1993; Dorin, Đến người ta biết 1992; đượcSnovvaert, số gen có khả kháng 1992 bệnh chống chịu thay đổi điều kiện môi trường vật Atherosclerosis ApoTiêm E, gen Ape(a), Apolợn AHavel, 1989; Zhang, nuôi Mx vào để tạo giống lợn miễn dịch với II 1992; Shimano, 1992; Fabry, 1993 kháng 1989; VVarden, 1993 Thiếu máu hồng R>s (và dạng đột cầu hình liềm biến) Bệnh viêm ruột Yokode, 1990 lnterleukine-2, Podolsky,1991; lnterleukine-10,T-cell Mombaerts, 1993; receptor, p, MHC II Kuhn, 1993; Sadlack, 1993 Rag-1, Rag-2 Thiếu hụt miễn dịch kết hợp nặng Rubin, 1991; Mombaerts, 1992 Dystrophin Liệu pháp gen loạn dưỡng Shinkai, 1992 Bệnh Alzhemers Cox,1993; Sandhu, 1991 (3-amyloid Neurotilament heavy ALS (Amyotrophic Chain lateral sclerosis) Kavvabata, 1993 Interíeron Bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin stevvart, 1993 Ung thư Các Fowlis, 1993 gen ung thư gen ức chế ung thư Thử nghiệm chất gây ung thư Thưc vât biến đổi pen Nhìn chung, việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng đến việc tạo chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng giá trị dinh dưỡng có đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A sắt • Tạo động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu chất - độc Khoai họctây tăng hàm lượng tinh bột -Phần Vaccine thựcdòng phẩmđộng (edible ngôsử khoai lớn vậtvaccine) chuyểnởgen dụng tây chất độc học để thử nghiệm chất gây đột biến chất gây ung thư Nhữnghợp giống ngô có gây thể trồng đượccác điều kiện nghèo Trong- trường chất đột biến, phương pháp phát dinh dưỡng đột biến gen giới hạn chủ yếu in vitro Các phương pháp in vitro phần lớn liên quan đến việc phân tích tổn - Dầu ăn sắc có lợithể chotrong sức khoẻ nànhbiệt cải thương nhiễm loại từ môđậu riêng đốidầu với tác động gây đột biến Lý việc sử dụng động vật chuyển bên cạnh xét ưu phát điểm cũngchất có gen làTuy để nhiên, phát triển nghiệm gây độtnguy biếncơin tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Bao gồm: vivo loạt loại mô khác nhau, kể tế bào mầm Tuy vậy, số vấn đề đáng lo ngại Để giải vấn đề kết luận thu phải dựa thông tin tin cậy có sở khoa học Cuối cùng, tầm quan trọng lương thực thực phẩm cho người, nên sách liên quan tới chuyển gen phải dựa tranh luận cởi mở trung thực có tham gia thành phần xã hội Cà rốt biến đổi gen có nhiều canxi Đu đủ chuyến gen kháng virus (trên) đu đủ đối chứng (dưới) III/ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIÊN SINH VẦT CHUYỂN GEN Southern blot Southern blot phương pháp trung tâm Sinh học phân tử Nó có tên gọi khác Southern blotting, phương pháp lai Southern hay phương pháp lai DNA Nguyên tắc Southern blot màng lai nitrocellulose có khả tiếp nhận DNA biết từ lâu sử dụng nghiên cứu lai axit nucleic khác vào thập niên 1950 1960 Vào thời kỳ DNA cố định không phân đoạn, đơn giản bao gồm DNA tồng số gắn màng lai nitrocellulose Sự đời phương pháp điện di gel vào đầu thập niên 1970 cho phép đoạn DNA cắt enzyme hạn chế phân tách dựa sở kích thước chúng Từ bước phát triển phương pháp chuyển đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose Phương pháp E M Southern mô tả Đại học Edingburgh vào năm 1975 Phương pháp Southern blot đơn giản hiệu Mặc dù cải tiến phương pháp sử dụng nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương pháp ban đầu Southern blot bao gồm bước sau: - Cắt DNA enzyme hạn chế thích hợp -Điện di sản phẩm cắt gel agarose - Làm biến tính DNA (thông thường gel): ví dụ nhúng vào dung dịch NaOH 0.5M, DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn Chỉ DNA sợi đơn chuyển lên màng lai - Chuyển DNA biến tính lên màng lai Thông thường màng lai sử dụng màng nitrocellulose Người ta sử dụng hơn, khoảng tiếng Trong trình chuyển, vị trí đoạn DNA giữ nguyên không thay đổi - Lai DNA cố định màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu Quá trình dựa nguyên tắc bổ sung (giữa DNA màng lai với mẫu dò) Để đánh dấu người ta thường sử dụng p32, biotin/streptavidin mẫu dò phát quang sinh học -Định vị phân tử lai DNA-mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, sử dụng biotin/streptavidin dùng phương pháp so màu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học phát phát quang Phương pháp Southern blot thiết kế để xác định diện, kích thước, số lượng sao, tính đồng dạng DNA phức hợp Ví dụ, Southern blot sử dụng để phát gen đặc biệt genome nguyên vẹn Northern blot Sau E M Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, người ta dùng phương pháp tương tự để xác định đoạn RNA đặc biệt gọi Northern blot Phương pháp gọi Northern blotting, phương pháp lai Northern hay phương pháp lai RNA Hình 2.5: ANDi - khỉ rhesus chuyển gen chào đời vào ngày tháng 10 năm 2000 Với phương pháp nhà khoa học hy vọng lấp chỗ trống khoa học chuột chuyển gen người Kết thu cung cấp công cụ nghiên cứu đầy tiềm hữu hiệu để khám phá nguyên nhân bệnh ung thư, Parkinson, Alzheimer, tiểu đường, tim mạch, bệnh trí tụê Nghiên cứu cho thấy bước hướng liệu pháp gen dòng mầm (germ line genetic therapies) Các gen xác định vấn đề di truyền đưa cách trực tiếp vào trứng người chưa thụ tinh thể mẹ biết mang gen bệnh định Cho đến tất nghiên cứu liệu pháp gen người giới hạn để tập trung vào mục tiêu tế bào gen đưa vào không trở thành phận genome ■ Muỗi chuyển gen Theo Tổ chức Sức khoẻ Thế giới (The VVorld Health Organization), hàng năm, bệnh sốt rét ảnh hưởng đến khoảng 500 triệu người trái đất Nguyên nhân gây bệnh ký sinh trùng sốt rét Ký sinh trùng sốt rét truyền từ muỗi Nó gây sốt, co cứng cơ, đổ mồ hôi, run cướp triệu sinh mạng năm, phần lớn trẻ em Châu Phi tuổi Trong phương pháp thông thường để kiểm soát bệnh sốt rét hiệu trước đời biện pháp cấp thiết Thế giới thành công việc đưa gen ngoại lai vào genome muỗi Anopheles stephensi tạo muỗi chuyển gen Thành tựu có ý nghĩa lớn, giúp nhà khoa học đến bước gần để tạo muỗi không truyền bệnh sốt rét Nói cách khác, truyền bệnh quái ác kiểm soát thông qua thao tác gen muỗi để phá vỡ tương tác qua lại muỗi với ký sinh trùng sốt rét, cách tạo môi trường thể muỗi mà ngăn cản ký sinh trùng sốt rét sống Cũng thay đổi tập tính muỗi làm cho thích hút máu động vật máu người tạo muỗi bất dục đực cách chọn lọc để làm giảm quần thể muỗi Các nhà khoa học trí tiềm to lớn phát triển để chống lại bệnh sốt rét cho thời gian tới muỗi chuyển gen tạo ổn định, an toàn khả truyền bệnh sốt rét Các nhà nghiên cứu xen vào phôi A stephensi gen mã hoá protein huỳnh quang màu xanh cây- GFP (green tluorescent protein) sử dụng yếu tố vận động Drosophila hydei Gen mã hoá protein sử dụng hoạt động marker GFP tạo thành có khả nhìn thấy dễ dàng tia uv để nhận biết muỗi tích hợp thành công gen ngoại lai Sự biểu GFP ấu trùng vi tiêm cao, chiếm gần 50% số ấu trùng sống sót sau vi tiêm Tuy nhiên, đến giai đoạn trưởng thành khoảng 10% Sự xâm nhập vào nhiễm sắc thể di truyền gen GFP cho hệ sau chứng minh cách chi tiết Một vấn đề khó khăn gặp phải nghiên cứu trứng muỗi vừa đẻ trở nên cứng nhanh làm cho việc vi tiêm gen vào khó Chỉ sau khám phá dung dịch p-nitrophenol p-guanidinobenzoate (pNpGB), hợp chất làm chậm tốc độ cứng không ảnh hưởng đến phát triển phôi muỗi tiến hành đưa gen ngoại lai cách tự nhiên Muỗi cho đẻ trứng dung dịch pNpGB, chất ngăn cản enzyme phenoloxidase, bước trình melanin hoá Vào năm 2002, nhà nghiên cứu thuộc trường Đại học Case VVestern Reserve (CVVRU) Cleveland, Ohio, Mỹ phát triển truyền trực tiếp từ người sang người Khi muỗi hút máu người bệnh, ký sinh trùng Plasmodium xâm nhập vào thể sinh sản ruột muỗi tạo thành dạng trung gian, dạng xuyên qua vách ruột đến khoang bụng biến thành nang Sau khoảng thời gian từ 10-15 ngày, nang vỡ bung ra, hàng ngàn bào tử giải phóng Các bào tử qua vách tuyến nước bọt tồn tuyến muỗi tiến hành chích người Với mục đích tìm gen phá hoại trình này, nhóm nghiên cứu nuôi muỗi A Stephensi hạt phủ sợi axit amin khác sau kiểm tra xem loại hạt dính với màng ruột muỗi Bằng cách chọn lọc phối hợp nhà khoa học tạo hợp chất có khả dính cao gọi SM1 Chất có tác dụng làm giảm cách có ý nghĩa số lượng ký sinh trùng xuyên qua vách ruột để biến thành nang Để việc sản xuất SM1 lúc, người ta tìm gen mã hoá cho loại enzyme tiêu hoá mà ruột muỗi tiết hút máu nối với gen thiết kế để tổng hợp SM1 Sau cấu trúc được vi tiêm vào phôi muỗi A Stephensi tự tích hợp vào genome trở thành phận DNA muỗi Protein SM1 sau tổng hợp bám vào bề mặt biểu mô ruột, cạnh tranh với ấu trùng muỗi Âúu trùng muỗi khả bám vào ruột chết Bằng cách SM1 ức chế khoảng 80% phát triển ấu trùng Tính trạng di truyền từ hệ sang hệ khác Mặt khác, muỗi chuyển gen SM1 không bị ảnh hưởng đến sức sống kể tuổi thọ sản xuất trứng Tuy nhiên nhà khoa học cảnh báo cần thiết phải tiến hành thử nghiệm nhiều để chứng minh phương pháp an toàn người Trong việc tìm kiếm gen kháng ký sinh trùng sốt rét, người ta thành công chuyển gen phospholipase A2 (PLA2) nọc độc ong vào muỗi A Stephensi Gen gắn với promoter carboxypeptidase A gambiae (AgCP) Kết phân tích phương pháp Northern blot cho thấy mRNA gen PLA2 biểu cách đặc hiệu ruột muỗi chuyển gen Sự biểu số lượng nang, trung bình 87% làm giảm cách đáng kể truyền ký sinh trùng sốt rét sang chuột Kết cho thấy gen PLA2 sử dụng để ngăn cản phát triển ký sinh trùng sốt rét muỗi Một hướng nghiên cứu khác tiến hành ngăn cản xâm nhập ký sinh trùng vào tuyến nước bọt muỗi Sự ngăn cản ký sinh trùng xâm nhập vào thời điểm khác trình phát triển quan trọng phương pháp đạt hiệu 100% Các nhà nghiên cứu khác trước sử dụng loại virus sửa đổi tiêm vào muỗi để làm ngưng lan truyền ký sinh trùng Nhưng phương pháp có số hạn chế thực tế virus nhiễm vào người virus di truyền từ hệ sang hệ sau muỗi Một muỗi chết chấm dứt khả virus chống lại sốt rét Một thách thức mà nhà nghiên cứu phải đối mặt phát triển ký sinh trùng có khả kháng Bởi áp lực trình chọn lọc cao, gen đưa vào quần thể ký sinh trùng sốt rét phát triển dòng kháng có khả để xuất Nó tương tự xử lý nhiễm khuẩn với kháng sinh, sau thời gian vi khuẩn trở nên kháng thuốc Một vấn đề đặt sử dụng gen phức (multiple genes), gen ngăn cản phát triển ký sinh trùng cách khác phương pháp hiệu Sau tạo muỗi chuyển gen, chiến lược để khắc phục sốt rét đưa dòng muỗi chuyển gen kháng ký sinh trùng sốt rét vào tự nhiên Phương pháp phải nghiên cứu phòng thí nghiệm cách cần thận để kiểm tra xem muỗi chuyển gen sống trộn chung với quần thể muỗi không chuyển gen Kết nghiên cứu quần thể muỗi chuyển gen phòng thí nghiệm nhà khoa học thuộc Học viện Hoàng gia London công bố bố vào năm 2003 Các nhà nghiên cứu chuyển gen marker huỳnh quang đỏ marker biến hoàn toàn khoảng từ hệ thứ đến hệ thứ 16 Giáo sư Charles Godfray-Giám đốc Trung tâm Hội đồng nghiên cứu môi trường tự nhiên Sinh học Quần thể (NERC) Hoàng gia thực mô hình toán học động lực học quần thể muỗi Nghiên cứu cho phép khảo sát tỉ mỉ trình khác mà giải thích hoạt động muỗi chuyển gen quần thể hỗn hợp Tác giả cho rằng, thông qua nhân giống muỗi chuyển gen, gen chuyển có khả bị nhiều đột biến có hại Các đột biến có hại không giết chết muỗi làm cho chúng thua thiệt cạnh tranh với muỗi bình thường, vấn đề hạn chế cách sử dụng chế độ lai làm giảm đến mức tối thiểu ảnh hưởng giống Như hoạt động muỗi chuyển gen không ảnh hưởng lớn đến khả tồn chúng Sự nghiên cứu quần thể định hoàn toàn trình điều chỉnh đánh giá an toàn hậu môi trường phương pháp Nó giúp đánh giá cách toàn tính khả thi việc sử dụng muỗi chuyển gen để chống lại bệnh tật sốt rét, sốt vàng da, sốt xuất huyết đóng vai trò phận quan trọng chiến lược phát triển tương lai để góp phần trục xuất tai họa gây khổ sở cho Hình 2.6: Vi tiêm DNA vào Hình 2.7: Áu trùng muỗi phôi giai đoạn sớm nhìn kính hiển vi muỗi gây sốt vàng da Cá chuyển gen Hiện nghiên cứu tạo cá chuyển gen ngày nhiều phòng thí nghiệm giới quan tâm Khoảng 10 năm trở lại hàng loạt cá chuyển gen tạo ra: cá hồi cầu vồng, cá hồi, cá rô phi, cá vàng, cá mú vằn, cá medaka, cá chép, cá nheo Mỹ, cá trê châu Phi, cá vền biển (seabream), cá hồi chấm hồng Bắc cực (Arctic charr) Những gen ngoại lai sử dụng để biến nạp vào cá gen hormone sinh trưởng (GH) người, gen GH bò, gen GH cá, gen ồcrystalline gà, gen R>-galactosidase vi khuẩn, gen kháng hygromycin, gen a-globin, gen protein chống lạnh cá, gen neomycin phosphotransíerase (neo) Ví dụ Mc Envoy cộng chuyển gen íỉ-galactosidae vào cá hồi Đại tây dương (Atlantic salmon), Ozato cộng (1986) chuyển gen ồ-crystalline gà vào cá medaka, Zhang cộng (1989) chuyển gen GH cá hồi cầu vồng vào cá chép cá trê Trong ba trường hợp gen ngoại lai biểu số cá biến nạp Trong số trường hợp, sản phẩm sinh từ gen ngoại lai động vật chuyển gen làm biến đổi kiểu hình chúng, cá chép chuyển gen GH cá hồi cầu vồng, polypeptid GH cá hồi cầu vồng tìm thấy cá chép chúng lớn lên nhanh so với cá đối chứng Những kết cho thấy tiềm to lớn việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen đề đưa gen quy định tính trạng mong muốn vào số loài cá quan trọng Có nhiều phương pháp khác để chuyển gen cho động vật nói chung cá nói riêng Phương pháp có hiệu vi tiêm trực tiếp DNA vào phôi Gần người ta thử nghiệm thành công chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng trước cho thụ tinh Muller F cộng (1992) lần công bố thành công việc sử dụng tế bào tinh trùng xung điện để tạo cá chuyển gen Phương pháp tiến hành cách ủ tế bào tinh trùng cá dung dịch citrate loãng với DNA plasmid Tiếp theo sử dụng xung điện có cường độ điện trường cao để tăng lượng DNA xâm nhập vào tinh trùng Tách chiết dịch mô DNA genome cá bột phát triển từ trứng thụ tinh với tinh trùng xử lý để kiểm tra hiệu gen chuyển Bằng phương pháp lai phân tử Dot blot thử nghiệm biểu gen chứng minh có mặt biểu gen ngoại lai 2,6 - 4,2% số cá bột cá chép thường cá bột thu từ thí nghiệm tương tự không xung điện tinh trùng Inoue (1992) chuyển gen vào phôi cá bột thành công phương pháp xung điện Zuoyan Zhu (1993) thành công việc chuyển gen ngoại lai vào cá phương pháp biến nạp xung điện: tồ hợp gen MThGH chuyển vào trứng cá thụ tinh loại bỏ màng chorion Thông số biến nạp tối ưu 250V / 22 pF / 200 / 1ms Kết đạt khoảng 10% số trứng nở phát triển cá thành cá chạch chuyển gen Muller cộng (1993) dùng gen luciterase đom đóm lacZ E coli, hai gen gắn với promoter CMV-IE1, để chuyển vào trứng thụ tinh loại bỏ màng chorion cá trê Châu Phi cá mú vằn phương pháp xung điện Kết đạt khoảng 25 - 50% phôi phát triển thành cá chuyển gen Anderson cộng (1996) thành công việc chuyển gen trực tiếp vào vân cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss) Gen ngoại lai sử dụng gen luciíerase đom đóm gắn với promoter CMV-IEP (cytomegalovirus immediate early promoter) Sự biểu gen phát tế bào dọc theo đường tiêm tế bào phân tán trước vị trí tiêm Tan cộng (1997) chuyển gen chloramphenicol acetyltransterase (CAT) trực tiếp vào vân cá mú vằn (zeabrafish) sử dụng plasmid pCMVCAT1 Sự hoạt động biểu gen CAT đạt cực đại tương quan với lượng plasmid tiêm vào ụg pCMV-CAT1 Sự hoạt động gen CAT tăng lên cách đặn qua ngày đầu sau tiêm, với mức biểu cao liên tục đến năm Gen CAT gắn với promoter virus cho kết biểu cao Sự định vị hóa học mô sử dụng CMV R>-gal cho thấy sợi vị trí tiêm biểu enzyme R>-gal Sự biểu mạnh mẽ liên tục gen tiêm vào cho phép đưa giả thuyết cá mú vằn hệ thống đơn giản dễ bị ảnh hưởng nghiên cứu trực tiếp chuyển gen vào Zohrah Haji Sulaiman (1999) thành công việc chuyển gen trực tiếp vào vân cá mú (Seabass, Lates calcariter) tôm sú (Black Tiger Prawn, Penaeus monodon) Sự biểu gen sau tiêm plasmid pCMV &-gal theo dõi đến 14 ngày biểu gen R>-gal phát cá dương tính biểu gen íi-gal cá 33,3% tôm 20% Cho đến nay, cá người ta tập trung nghiên cứu theo hướng sau: Chuyển aen hormone sinh trưởng (GH = arowth hormone) vào cá Hormone sinh trưởng protein có trọng lượng phân tử thay đổi tùy theo loài, người 21.500 Da GH tiết từ thùy trước tuyến yên động vật có xương sống, động vật có vú GH cần thiết cho sinh trưởng phát triển GH có 191 axit amin, cấu trúc phân tử có cầu nối disuntua Sự tiết GH hormone hypothalamus hormone giải phóng hormone sinh trưởng (GRH = grovvth hormone releasing hormone), hormone ức chế hormone sinh trưởng (GIH = grovvth hormone inhibiting hormone) theo chế điều hòa ngược Cá xử lý thí nghiệm với hormone sinh trưởng tuyến yên chiết từ nguồn khác bò, lợn, cá Tất thí nghiệm làm tăng tốc độ sinh trưởng cá Sự sinh tổng hợp hormone sinh trưởng tái tổ hợp gà, bò cá hồi cầu vồng cho thấy chức sinh học gen hormone sinh trưởng tăng cường tốc độ sinh trưởng cá Thật có lý mong đợi cá chuyển gen hormone sinh trưởng người có chức giống hormone sinh trưởng loài khác Qui trình công nghệ tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người tóm tắt sơ đồ hình 4.13 Sự tăng cường tốc độ sinh trưởng quan sát cá chép chuyển gen MThGH Cơ chế tăng cường sinh trưởng cá chuyển gen khám phá dựa vào chức hormone sinh trưởng người sở tăng trưởng xương kích thích tổng hợp protein Một số cá chép chuyển gen tăng cường độ dày lưng tăng trưởng bề ngang thể chúng có hình thái làm ngạc nhiên nhà nghiên cứu Mỹ Châu Âu công bố nhóm nghiên cứu ông chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá Theo Zhu hệ Fi cá chuyển gen lớn gấp hai lần so với cá đối chứng Mặc dù Zhu cộng không trình bày chứng việc hợp biểu gen GH ngoại lai người ta thấy gen GH cá chuyển vào trứng số loài cá hợp với DNA genome loài cá Hình 2.8: Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng Hình 2.9: Cá trê Châu Phi (Channel catỉish) chuyển gen hormone Hình 2.10: Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng (phải) cá hồi đối chứng (trái) Những nghiên cứu sử dụng số gen GH động vật có vú, gen GH cá cDNA GH Chẳng hạn Zhang cộng (1988, 1990) sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa đoạn lặp lại đầu tận (LTR = Long Terminal Repeat) virus Rous sarcoma (RSV) chim cDNA GH cá hồi để vi tiêm vào phôi cá chép phát triển Tách chiết DNA genome từ vây ngực cá vi tiêm đem phân tích dot blot Southern blot, sử dụng LTR RSV cDNA GH cá hồi làm mẫu dò, người ta tìm thấy đoạn hợp p RSV - LTR - GH - cDNA cá hồi ổn định biểu polypetid GH cá hồi Cá chuyển gen có kích thước trung bình lớn 22% so với cá đối chứng Mặt khác, số cá thể chọn cách ngẫu nhiên từ hệ lai cá đực chuyển gen với cá không chuyển gen di truyền gen ngoại lai Chúng lớn nhanh cá không chuyển gen lứa mà lớn nhanh nhiều lần so với bố mẹ Gần đây, Du cộng (1992) công bố kết chuyển gen GH cá vào cá hồi Đại tây dưomg Du sử dụng promoter gen protein chống lạnh cá lon chạch lớn (ocean pout, Macrozoarces americanus) nối cới cDNA GH cá hồi trắng (chinook salmon, Oncorhynchus tschawytscha) kết kích thước cá hồi Đại tây dương chuyển gen năm tuổi tăng lên từ - lần so với cá đối chứng Phần Lan, Trường Đại học Kuopio, nhà khoa học nghiên cứu sản xuất cá hồi cầu vồng chuyển gen có tốc độ sinh trưởng cao, có khả chuyển hóa tốt thành phần thức ăn, đặc biệt carbohydrate rẻ tiền Molsa, Krasnov Pitkanen (1992) sử dụng gen hormone sinh trưởng cá hồi Đại tây dương (ASGHG = Atlantic Salmon Grovvth Hormone Gene) để chuyển vào cá hồi cầu vồng kỹ thuật PCR chứng minh hợp gen vào genome cá hồi cầu vồng Tuy nhiên, gen ASGHG chuyển vào loài khác cách rộng rãi giới không thật làm tăng đột ngột tốc độ sinh trưởng loài nhận Các nhà nghiên cứu Kuopio tin tưởng gen ảnh hưởng đến tượng chuyển hóa, chúng cải tiến tượng chuyển hóa carbohydrate nên sử dụng carbohydrate rẻ tiền để làm thức ăn cho cá tăng cường khả kháng bệnh Các gen có ý nghĩa nhiều gen tăng cường sinh trưởng kỹ nghệ nuôi trồng thủy sản Hiện tại, nhà nghiên cứu thấy kỹ nghệ nuôi trồng thủy sản Phần Lan phải đợi -10 năm trước đánh giá cá chuyển gen thương mại Để chứng minh hợp gen chuyển vào nhiễm sắc thẻ động vật nhận hoạt động gen nhà nghiên cứu Kuopio sử dụng cá zebra danios Cá zebra danios nhỏ, loại cá nuôi nhiệt đới, thành thục 3-4 tháng nhân giống nhanh bể nuôi Trứng cá chọn vi tiêm gen dễ dàng Có thể thu cá vi tiêm kiểm tra hoạt động gen cách nhanh chóng Với kết thu được, người ta thừa nhận lợi ích gen chuyển với thời gian ngắn so sánh với thời gian cần thiết để thừa nhận phát triển chậm chạp cá hồi sống môi trường nước lạnh Pitkanen cộng (1999) chuyển gen hormone sinh trưởng cá hồi vào cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvilinus alpinus L.) Các tổ hợp gen hormone sinh trưởng sử dụng OnGH1, CMVGH1, OnH3GH1 SsGH2 Cá mang gen OnGHI, CMVGH1, OnH3GH1 có tốc độ sinh trưởng tăng lên đột ngột thay đổi Chuyển ợen chống lanh vào cá Trong tự nhiên, cá sống nước lạnh hai cực đất, biển nhiệt đới ấm áp vùng nước ôn hòa nơi điều kiện nhiệt độ thay đổi theo ngày thay đổi theo mùa Trải qua tiến trình tiến hóa lâu dài, cá có chế sinh lý thích nghi với điều kiện nhiệt độ thay đổi Cũng nhiều sinh vật khác, cá sử dụng gen sốc nhiệt để phản ứng với nhiệt độ tăng cao, điều kiện lạnh quá, vài loài cá tiến hóa theo hướng gen chống lạnh mã hóa protein giữ cho máu chúng khỏi đông De Vries phát protein chống lạnh (AFPs = antifreeze proteins) Theo De Vries (1969, 1971), cá vùng Bắc cực Nam cực gen AFP biểu suốt năm, loài cá sống vùng nước ôn hòa (như cá bơn mùa đông) AFPs biểu mùa đông Các protein cho phép cá sống điều kiện nhiệt độ lạnh De Vries cộng (1971), Lin cộng (1972) phát protein chống lạnh cá Nam cực bao gồm đơn vị lặp lại Ala-Ala-Thr với disaccharide, galactosyl-n-acetylgalactose amine, nhóm gốc đường liên kết với threonine AFPs cá bơn mùa đông protein xoắn giàu alanin, disaccharide Các cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc chúng xác định Cơ chế tối ưu protein chúng liên kết với vi tinh thể nước đá làm hạ thấp điểm đông máu Các gen protein chống lạnh số loài cá làm sáng tỏ Hew cộng (1988) vi tiêm gen AFP cá bơn mùa đông vào cá hồi AFP Mặc dù họ chứng minh hợp gen AFP vào genome cá hồi chứng biểu gen AFP Tuy nhiên, sau họ có chứng cớ sơ biểu gen AFP cá bơn mùa đông (Pseudopleuronectes americanus) cá hồi chuyển gen mức độ biểu gen AFP thấp để bảo vệ thể chống lại lạnh giá Những kết nghiên cứu bước đầu khả quan cho ta giả thiết cách chắn rằng, mức AFP thích hợp biểu chúng mở rộng khả sống cá hồi vào mùa đông bể nuôi cá nước mặn Đây thuận lợi lớn cho việc nuôi trồng nguồn thủy sản quan trọng Với mục đích đó, việc nghiên cứu tiến hành thăm dò promoter riêng thành công chứng minh biểu gen AFP cá vàng Cá vàng chuyển gen có khả chịu lạnh tốt cá đối chứng đưa chúng vào môi trường có nhiệt độ thấp Chuyển gen kháng bênh vào cá Một hướng ứng dụng khác cá chuyển gen khả kháng bệnh Cho đến nay, hai phương pháp khác thử nghiệm Một phương pháp với mục đích tăng sức đề kháng bệnh vi khuẩn phương pháp nhằm vào mầm bệnh virus đặc trưng Một ứng dụng phương pháp liên quan đến việc tăng cường enzyme kháng khuẩn lysozyme cá cách đưa trình tự mã hóa lysozyme cá hồi cầu vồng gắn với promoter AFP lon chạch Mỹ (Macrozoarces americanus) vào cá hồi Đại tây dương (Hew, 1995) Đây cấu trúc mà tất bắt nguồn từ cá với trình tự mã hóa protein có nguồn gốc từ loài thân thuộc Một hiệu tương tự tạo cách lai khác loài chọn lọc (cá hồi Đại tây dương lai với cá hồi nâu (Salmo trutta), cá hồi nâu lai với cá hồi cầu vồng) kỹ thuật chuyển gen làm tăng tốc độ trình cách đơn giản tạo giống cá có kiểu gen xác định tốt nhiều Cấu trúc gen chuyển lysozyme đưa vào cá hồi Đại tây dương chưa có kết suất cá hiệu gen chuyển công bố Một ứng dụng thứ hai việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để tăng khả kháng bệnh bảo vệ cá hồi cầu vồng chống lại nhiễm virus hematopoietic necrosis (IHNV) IHNV nguồn bệnh cá hồi gây tỷ lệ chết cao, đặc biệt cá bột cá hồi nhỏ Các loại vaccine chết-bất hoạt (killed vaccine), vaccin giảm độc lực (attenuated vaccine) vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine) phát triển ba loại có hạn chế định Sự tiêm chủng vaccine DNA sử dụng trình tự mã hóa protein G N IHNV Anderson thực cá hồi cầu vồng vào năm 1996 Các plasmid tái tổ hợp tiêm trực tiếp vào cá bột Một trình tự protein N không đủ gây miễn dịch Ngoài việc chuyển gen GH, gen chống lạnh gen kháng bệnh nói trên, số gen khác chuyển vào cá chép, cá trê, cá hồi, cá vàng, cá medaka, cá chó Bắc cực (Northern pike) số loài cá khác Các gen có nguồn gốc từ tập hợp nguồn sinh vật khắp nơi (gen kháng hygromycin, gen neomycin phosphotransterase (neo), gen chloramphenicol transacetylase, gen crystalline gà, gen a-globin, gen luciíerase, gen íi-galactosidase, gen chống lạnh ) Khi chuyển vào cá, gen vi tiêm gắn với nhiều promoter khác (mouse methallothionein (mMT), Rous sarcoma virus (RSV), fish antifreeze protein promoter (AFP) ) Vào năm 1986, Ozato cộng chứng minh cá medaka (Oryzas latipes) vi tiêm tổ hợp mMT chuột với gen crystalline (Cry) gà gen ngoại lai hợp với DNA genome cá medaka biểu gen Oshiro cộng (1989) công bố gen a-globin cá chép gắn vào DNA genome cá hồi cầu vồng Mc Evoy cộng (1988) cá hồi Đại tây dương chuyển gen biểu gen R>galactosidase kết hợp với mMT Yoon cộng (1990) đưa chứng chuyển gen, hợp phiên mã gen neo cá vàng chứng biểu gen không làm sáng tỏ stuart cộng (1988) sử dụng cá mú vằn (zebrafish) làm mô hình chuyển gen kháng hygromycin, chứng minh hợp vào hệ gen di truyền lại cho hệ sau gen Chen Power (1990) chứng minh hợp nhất, biểu di truyền lại cho hệ sau tổ hợp gen chloramphenicol transacetylase Lu cộng (1997) sử dụng vector retrovirus đa hướng (pantropic retrovirus vector) để chuyển gen vào cá medaka Nhật (Orizias latipes) Các vector chứa LTR virus bạch cầu chuột Moloney (Moloney murine leukemia virus = Mo-MLV) gen chuyển (neo lacZ) điều hòa đoạn LTR RSV Kết nghiên cứu chứng minh xâm nhập, biểu di truyền lại cho hệ lai Fi tổ hợp gen Trong số nghiên cứu cá chuyển gen, hiệu đạt thấp, trung bình từ 5-10% Một số nhà nghiên cứu khác cho nghiên cứu chuyển gen người vào cá chép, hợp gen ngoại lai với genome vật chủ đạt từ 40 - 88% nghiệm tuyệt vời cho nghiên cứu khoa học nghiên cứu ứng dụng Công nghệ Sinh học Ở Việt Nam, Phòng Công nghệ gen Động vật, Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, Việt Nam, Nguyễn Văn Cường cộng nghiên cứu chuyển tồ hợp gen hormone sinh trưởng người (MThGH) vào chuột, cá vàng (Carassius autarus), cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) cá chép (Cyprinus carpio) Với số kết bước đầu đạt được, [...]... phù phát sinh phôi để đó chuyến toàn bộ lục: Các Phụ sinh vật ngô biến trong đổi gen vào tế bàotái sinh các cây hữu thụ mang gen bar biến nạp Sử dụng phương Agrobacterium pháp bắn gen và chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ bialaphos đã cho kết bằng phưong thứcCÁC SINH VẤT BIÉN ĐÔI GEN HIÊN NAY mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gen Các cây biến giao phối bộ baquả là Một ứngthụdụng khác tái củasinh,... Tần số biến nạpLUÂN được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30% Các thể lai IV/ KÉT 1.1.nhất Một giữa số loạidòng cây trồng gen quan trọng hiện ược nay biến thế Bảng hệ thứ A188 chuyển và 5 dòng lai gần khác với sinh tần số (tínhdụng theo rộng số cây biến việc nạp gen độc Các nạp kỹ thuật họckhoảng phân tử0,4-5,3% đã được ứng rãi trong lập/phôi) tạo ra các giống sinh vật biến đổi gen Các sinh vật này... chế của hai phương pháp này là phải xây dựng phương thức tái sinh cây từ tế bào đơn Mặc dù các phương thức này đang dùng cho một số giống lúa thuộc loài phụ japonica (ví dụ: Taipei 309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống indica đều khó tái sinh cây từ protoplast Phương pháp bắn gen cho phép thực hiện biến nạp gen hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn... những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Đây thực sự là phương pháp hiện đại... tầy, bơ thực vật, dầu gội đầu và xà bông Do vậy, trên thế giới nhu cầu về dầu dừa luôn luôn cao Ngành công nghiệp chế biến dừa hiện nay đang bị de dọa do sự phát triển của một số loại cây trồng biến đổi gen cho nhiều dầu, như hạt cải dầu Việc nghiên cứu thúc đầy phát triển sản xuất dầu dừa có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với ngành công nghiệp chế biến dừa 1.3 Tình hình cây trồng biến đổi gen được trồng... của phương pháp này là cho phép nghiên cứu các mRNA với hàm lượng rất thấp mà các phương pháp như Northern blot không thể thực hiện được PCR được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như tạo dòng phân tử, kỹ thuật di truyền, phát hiện chần đoán các bệnh (do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng ) cho kết quả rất chính xác, di truyền học để sản xuất các marker phân tử, nghiên cứu sự phát sinh các đột biến. .. lâu dài mà sinh vật chuyển gen Chuyển gen ở cây lúa đang được tập trung vào tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ và sản xuất vitamin A Kết quả tái sinh của cây lúa biến nạp gen bằng xung điện hoặc PEG thông qua nuôi cấy protoplast được thông báo lần đầu tiên cách đây khoảng 10 năm Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật này để biến nạp gen vào protoplast và phục hồi các cây biến nạp gen hữu... bình thường và các DNA có trình tự mang các gen chuyển đã biết DNA của một đối fhuỳnh _A DNA gán IACCTIGI_ , 7/ gây ung thư, ngộ độc do các gen la gây ra, mất cân bằng sinh 1 "V quang oúathái, dôi tượng mất tính đa dạng sinh học, tạo ra các lọai sâu bệnh nguy hiểm Bông Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn hơn, Vì vậy việc phát hiện các sinh Ọ 0vật ^ 0biếno đổiogeno hayo cácơchế ị / ol*gotrùng phẩm từ chúng... kháng kanamycin và chống chịu glyphosate Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản -phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi) với sự tăng gia tốc của... dược phát hiện trên 3him nhạy cảm vdi cho tháy sự hiện diện của ARN quan - Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp Phương ... cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để chuyến toàn lục: Các Phụ sinh vật ngô biến đổi gen vào tế bàotái sinh hữu thụ mang gen bar biến nạp Sử dụng phương Agrobacterium pháp bắn gen chọn lọc thuốc... thấy xu hướng gen biến đổi chiếm tỷ lệ lớn diện tích trồng biến đổi gen phạm vi toàn cầu 2.4 Tiềm đóng góp trồng biến đổi gen Lý thuyết phục công nghệ sinh học mà cụ thể trồng biến đổi gen khả đóng... phưong thứcCÁC SINH VẤT BIÉN ĐÔI GEN HIÊN NAY mô callus phát sinh phôi biến nạp gen Các biến giao phối baquả Một ứngthụdụng khác tái củasinh, chip ổn DNA xác định xem genegen có nạp gen hữu địnhlà