VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction) Khái niệm chung phương pháp PCR Phương pháp phát Salmonella PCR Phương pháp phát V cholerae PCR KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP PCR Khái niệm  PCR phương pháp khuếch đại in vitro (trong ống nghiệm) trình tự DNA dựa trình tự DNA đích ban đầu cặp mồi (primers) enzym DNA polymerase  Khuôn DNA (template)là trình tự DNA đích đặc trưng cho đối tượng cần phát  Mồi (pimers): trình tự DNA hay RNA ngắn bắt cặp với mạch khuôn DNA có mang đầu 3’- OH tự giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch Trong phản ứng cần có mồi KHÁI NIỆM CÁC THUẬT NGỮ  Bắt cặp bổ sung: kết hợp hai mạch DNA đơn hay mạch DNA đơn với RNA trình tự hai mạch tương đồng đối song song (A-T, G-C)  DNA polymerase enzym tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Trong phương pháp PCR thường sử dụng Taq DNA polymerase enzym chòu nhiệt  Biến tính: chuyển từ DNA mạch kép thành hai mạch DNA đơn tác dụng tác nhân biến tính Trong PP PCR tác nhân biến tính nhiệt  Lai: bắt cặp mồi khuôn DNA theo nguyên tắc bổ sung KHÁI NIỆM (tt)  Khuếch đại: nhân đoạn DNA Trong PP này, khuếch đại thông qua chu kỳ nhiệt độ Độ lớn đoạn DNA khuếch đại kích thước nằm hai mồi  Điện di: trình phân tách đoạn DNA có kích thước khác gel agarose tác dụng dòng điện chiều  Thang DNA (DNA marker) phương tiện để đo kích thước đoạn DNA Đây hỗn hợp đoạn DNA có kích thước khác biết  Cặp base ( base pair - bp): cặp base bổ sung DNA mạch đôi CÁC BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH KHUẾCH ĐẠI  Phản ứng PCR thực thông qua nhiều chu kỳ nhiệt liên tiếp gồm bước sau:  Bước 1: Biến tính: làm cho hai mạch DNA tách rời tác dụng nhiệt Nhiệt độ biến tính cao nhiệt nóng chảy (Tm) khuôn DNA Thường thực nhiệt độ 92-95oC  Bước 2: Lai: nhiệt độ hạ thấp Tm mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn DNA Nhiệt độ lai dao động khoảng 40-70oC  Bước 3: Kéo dài: nhiệt độ tăng lên đến nhiệt độ tối ưu cho taq DNA polymerase hoạt động (72oC) tổng hợp hợp kéo dài mạch từ đầu 3’OH mồi  Chu kỳ quay lại bước sau kết thúc bước chu kỳ trước CÁC BƯỚC CỦA PHẢN ỨNG PCR Chu kỳ Nhiệt độ (Co) Biến tính mẫu Mồi bắt cặp Thời gian (phút) Chu kỳ Tổng hợp DNA SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG PCR THÀNH PHẦN THAM GIA TRONG PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI PCR  Khuôn DNA  Mồi (primers): gồm mồi xuôi mồi ngược có nồng độ  dNTP hỗn hợp gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP Các thành phần có nồng độ  Taq DNA polymerase  MgCl2 thành phần thiếu, có tác dụng làm tăng lực kết hợp mồi – khuôn dNTP – Taq polymerase Nồng độ phụ thuộc qui trình khuếch đại  Đệm phản ứng: gồm Tris – HCl, Tween 20(NH4)SO4, KCl chất tăng cường khuếch đại THU NHẬN KHUÔN DNA  DNA nằm nhân tế bào, bên màng tế bào vi khuẩn hay vỏ bọc virus  Giải phóng DNA cách phá huỷ màng tế bào, màng nhân, vỏ virus …  Tác nhân phá màng để giải phóng DNA nhiệt, lysozym hay chất tẩy mạnh Trong phân tích vi sinh thường sử dụng tác nhân nhiệt  Khuôn DNA tinh hoạt không MỒI  Là thành phần đònh tính chuyên biệt cho đối tượng cần phân tích  Mồi thiết lập dựa trình tự DNA biết trước Được thiết lập gen đặc trưng cho đối tượng cần phân tích  Độ lớn sản phẩm khuếch đại khoảng cách hai mồi  Nên chọn mồi cho sản phẩm khuiếch đại 2001000bp  Tm hai mồi tương đương  Nên chọn mồi có tỉ lệ G + C > 50% 10 QUI TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT BẰNG PCR  Gồm bước sau – Tăng sinh: để làm tăng số lượng VSV  tăng độ nhạy phương pháp – Xử lý khuôn DNA – Khuếch đại: làm giàu số lượng DNA mục tiêu – Điện di: phân tích sản phẩm khuếch đại gel agarose – Nhuộm DNA với ethidium bromide gel, đọc kết đèn UV – Kết dương tính: có sản phẩm khuếch đại phù hợp kích thước thiết kế – Kết âm tính: DNA khuếch đại hay kích thước tạo không phù hợp kích thước thiết kế 11 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÊN GEL AGAROSE T: thang DNA, 1,3,4,5,6,8,9,10,11: Mẫu cho kết dương tính với sản phẩm khuếch đại 380bp, 2,7: Mẫu âm tính 12 Ưu, nhược điểm phương pháp PCR  Ưu điểm – – – – Thời gian cho kết nhanh: 24-28 Có thể phát VSV khó nuôi cấy Hoá chất dễ bảo quản, dễ tìm Ít tốn công lao động  Nhược điểm – Taq DNA polymerase bò ức chế thành phần mẫu – Cần có bước làm giàu mật độ VSV mẫu thấp – Không phân biệt tế bào sống tế bào chết 13 CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ĐÃ ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR Vi sinh vật E coli E coli (ETEC) E coli O157:H7 Loại thực phẩm Thòt heo, sữa, rau, cá Thòt heo, sữa tươi, rau cải, Thòt heo, sữa tươi, rau cải Salmonella spp Thòt thủy sản Staphylococcus aureus V cholerae Sữa tươi, rau cải, thòt thủy sản Thòt thủy sản V para Thòt thuỷ sản Thời gian (giờ) Độ nhạy (CFU/phản ứng) Độ nhạy (CFU/25g mẫu) 12 90 10 14 700 16 32 10 12 90 24 200 10 14 30 10 16 370 10 Các ứng dụng nghiên cứu triển khai ĐH KHTN14 TPHCM PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM BẰNG PCR 15 THIẾT BỊ, VẬT DỤNG  Tủ ấm 37oC: tăng sinh Salmonella  Máy luân nhiệt (thermocycler): khuếch đại  Máy ly tâm eppendorf 1.5ml: xử lý khuôn DNA  Máy lắc ống nghiệm  Thiết bò điện di ngang nguồn có điện 80-150V  Hộp đèn soi UV có kính lọc 302nm  Pipetteman 1-10µl, 10-100 µl, 0.1 – ml  Eppendorf 1.5ml, ống PCR 0.2 hay 0.5ml 16 HOÁ CHẤT – VẬT TƯ  Môi trường BPW  Mồi: gồm invA1 invA2 cách 520bp thiết lập gen invA có trình tự là: invA1: 5’-TTGTTACGGCTATTTTGACCA-3’ invA2: 5’-CTGACTGCTACCTTGGCTGATG-3’ Mỗi mồi pha loãng 6pM/µl đệm TE (10mMTris-HCl (pH8), 1mMEDTA)  Taq DNA polymerase 1.25U/ µl  Đệm phản ứng: Tris-HCl (pH 8.8): NH4)2SO4 Tween 20 dNTP MgCl2 7.5mM 20mM 0.01% 20 µM loại 1.5mM 17 HOÁ CHẤT – VẬT TƯ  Thang DNA đo đoạn 520bp  Agarose sử dụng cho sản phẩm [...]... chế bởi các thành phần của mẫu – Cần có bước làm giàu nếu mật độ VSV trong mẫu quá thấp – Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết 13 CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ĐÃ ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR Vi sinh vật E coli E coli (ETEC) E coli O157:H7 Loại thực phẩm Thòt heo, sữa, rau, cá Thòt heo, sữa tươi, rau cải, Thòt heo, sữa tươi, rau cải Salmonella spp Thòt thủy sản Staphylococcus aureus V cholerae...QUI TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT BẰNG PCR  Gồm các bước cơ bản như sau – Tăng sinh: để làm tăng số lượng VSV  tăng độ nhạy của phương pháp – Xử lý khuôn DNA – Khuếch đại: làm giàu số lượng DNA mục tiêu – Điện di: phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel agarose – Nhuộm DNA với ethidium bromide trên gel, đọc kết quả dưới đèn UV – Kết quả dương tính: có sản phẩm khuếch đại phù hợp kích thước... ĐH KHTN14 TPHCM PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM BẰNG PCR 15 THIẾT BỊ, VẬT DỤNG  Tủ ấm 37oC: tăng sinh Salmonella  Máy luân nhiệt (thermocycler): khuếch đại  Máy ly tâm eppendorf 1.5ml: xử lý khuôn DNA  Máy lắc ống nghiệm  Thiết bò điện di ngang và bộ nguồn có điện thế 80-150V  Hộp đèn soi UV có kính lọc 302nm  Pipetteman 1-10µl, 10-100 µl, 0.1 – 1 ml  Eppendorf 1.5ml, ống PCR 0.2 hay 0.5ml... chất này  Chỉ mở đèn UV khi đã đóng kính bảo vê% 23 QUI TRÌNH PHÁT HIỆN V CHOLERAE BẰNG PCR  Thực hiệntương tự như qui trình phát hiện Salmonella, các điểm khác là – Trình tự mồi: Mồi 1: 5’-TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3’ Mồi 2: 5’-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3’ Nồng độ mồi: 10pM/µl – Chương trình khuếch đại: nhiệt độ lai mồi và khuôn DNA là 55oC – Sản phẩm khuếch đại có kích thước 777bp 24 ... 1,3,4,5,6,8,9,10,11: Mẫu cho kết quả dương tính với sản phẩm khuếch đại 380bp, 2,7: Mẫu âm tính 12 Ưu, nhược điểm của phương pháp PCR  Ưu điểm – – – – Thời gian cho kết quả nhanh: 24-28 giờ Có thể phát hiện VSV khó nuôi cấy Hoá chất dễ bảo quản, dễ tìm Ít tốn công lao động  Nhược điểm – Taq DNA polymerase bò ức chế bởi các thành phần của mẫu – Cần có bước làm giàu nếu mật độ VSV trong mẫu quá thấp – Không phân biệt... đọc kết quả 21 DIỄN GIẢI KẾT QUẢ  Kết quả dương tính: có xuất hiện vạch sản phẩm 520bp  Kết quả âm tính: không có vạch sản phẩm, hay xuất hiện các vạch khác kích thước trên 22 KHUYẾN CÁO  Không sử dụng chung các dụng cụ vào các vi c trước và sau khuếch đại  Chuẩn bò mẫu khuếch đại và xử lý mẫu sau khuếch đại được thực hiện tại các khu vực khác nhau  Ethidium bromide là chất gây ung thư, phải có... – VẬT TƯ  Thang DNA có thể đo được đoạn 520bp  Agarose sử dụng cho sản phẩm ... CÁC BƯỚC CỦA PHẢN ỨNG PCR Chu kỳ Nhiệt độ (Co) Biến tính mẫu Mồi bắt cặp Thời gian (phút) Chu kỳ Tổng hợp DNA SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG PCR THÀNH PHẦN THAM GIA TRONG PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI PCR  Khuôn DNA  Mồi... khuôn Trong phương pháp PCR thường sử dụng Taq DNA polymerase enzym chòu nhiệt  Biến tính: chuyển từ DNA mạch kép thành hai mạch DNA đơn tác dụng tác nhân biến tính Trong PP PCR tác nhân biến tính...KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP PCR Khái niệm  PCR phương pháp khuếch đại in vitro (trong ống nghiệm) trình tự DNA dựa trình tự DNA đích