CÁC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TS NGUYỄN TIẾN DŨNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TPC (Total Plate Count)/ APC (Aerobic Plate Count) • Đònh nghóa – VSV hiếu khí vi sinh vật phát triển tạo khuẩn lạc nhìn thấy điều kiện có O2 – Tổng số vi sinh vật hiếu khí số khuẩn lạc hình thành nhìn thấy khối lượng mẫu – Số đơn vò hành thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) số khuẩn lạc nhìn thấy môi trường nuôi cấy Ý NGHĨA • TPC phản ánh mức độ nhiễm vi sinh vật mẫu • TPC không phản ảnh tổng số vi sinh vật mẫu • TPC không phản ánh mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm/ nước uống, sinh hoạt • Số TPC thấp nhiều so với mật độ vi sinh vật mẫu NGUYÊN TẮC • Đònh lượng TPC phương pháp đếm khuẩn lạc theo nguyên tắc sau: - Mẫu đồng nhất, pha loãng theo bậc 10 - TPC đònh lượng theo phương pháp đổ đóa: - 1ml mẫu (dd mẫu pha loãng) cấy vào đóa petri trống vô trùng - Môi trường agar không chọn lọc đun chảy làm nguội đến 45±1oC đổ vào đóa, lắc - Ủ đóa 25-30oC 72 ±6giờ - Đếm tất khuẩn lạc nhìn thấy đóa MÔI TRƯỜNG • Dung dòch pha loãng • - Pepton • - NaCl 1g 8.5g • Môi trường không chọn lọc • - Plate count agar • - Nutrient agar • - Standard count agar QUI TRÌNH ĐỊNH LƯNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 10g mẫu + 90g Salin Pepton Water, đồng stomacher 30 giây  dd 10-1 Pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 … Cấy 1ml dd mẫu pha loãng vào đóa petri trống vô trùng Cấy độ pha loãng liên tiếp, độ pha loãng cấy đóa Đỗ vào đóa cấy mẫu 15-20ml môi trường PCA đun chảy làm nguội đến 45oC Lắc cho mẫu khuếch tán vào môi trường QUI TRÌNH ĐỊNH LƯNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (tt) Để đóa mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc Lật ngược đóa ủ tủ ấm 30±1oC 72± Đếm tất khuẩn lạc xuất đóa Chọn đóa có khoảng 15 –300 khuẩn lạc / đóa để tính kết Tổng số vi sinh vật hiếu khí / g (TPC) N TPC = n1V1F1 + …+ niViFi N: Tổng số khuẩn lạc đếm đóa n: số đóa nồng độ V: thể tích cấy vào đóa (=1) F: độ pha loãng TÍNH KẾT QUẢ • Chọn đóa có số khuẩn lạc khoảng 25-250KL hay 30-300 KL để tính kết N • Số CFU/g(nl) = n1V1f1+…+niVifi • Nếu độ pha loãng thấp hay cao mà có số đếm giới hạn kết đánh dấu KẾT QUẢ (tt) 10-2 10-3 TPC/g 12 [...]... ĐỊNH LƯNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT KỴ KHÍ SINH H2S (tt) Ủ 37 ± 1oC trong 24 giờ Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống Tổng bào tử vi sinh vật kỵ khí sinh H2S/ (cfu)g (A) N A = nVf N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các ống n: số ống tại mỗi nồng độ (=2) V: thể tích cấy vào ống (=1) F: độ pha loãng (10-1) 15 ĐỊNH LƯNG COLIFORM, F COLIFORM • Đòng nghóa – Coliform là vi khuẩn hình que, gram... 18 Ý NGHĨA CHỈ TIÊU COLIFORM • Là vi sinh chỉ thò an toàn vệ sinh thực phẩm vì: - Có quan hệ họ hàng gần với các VSV gây bệnh đường ruột - Luôn đồng hành với các vi sinh vật gây bệnh đường ruột và VSV gây ngộ độc thực phẩm - Số lượng cao VSV này trong thực phẩm thì khả năng có mặt của vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao • Số lượng Coliform giảm dần theo thời gian trong các sản phẩm đông lạnh 19 NGUYÊN... coliform (MPN/100ml) 30 ĐỊNH LƯNG TỔNG NẤM MEN, MỐC • Đònh nghóa – Nấm mốc: là vi sinh vật có nhân, dạng rợi, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty – Nấm men là vi sinh vật có nhân, đơn bào, sinh sản bằng bào tử đơn nhân hay nẩy chồi – Nấm men và mốc là những vi sinh vật hiếu khí bắt buộc 31 ĐẶC ĐIỂM - Nấm men hay mốc đều kháng kháng sinh - Khuẩn lạc nấm mốc có dạng sợi, có màu của bào tử Bào tử, khuẩn ty hay...Ý NGHĨA • Vi sinh vật chỉ thò mức độ vệ sinh của thực phẩm, chỉ thò ô nhiễm ngầm, lâu ngày • Vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm • Trong giống có nhiều loài tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm như: C botulinum, C perfrigens… 11 ĐỊNH LƯNG CLOSTRIDIA Nguyên tắc • Mẫu được xử lý nhiệt để loại bỏ tế bào sinh dưỡng, chọn lọc bào tử • Nuôi cấy kỵ khí trong môi trường... axít Trong trường hợp vi khuẩn bò yếu hay tổn thương, phải phục hồi bằng môi trường không chọn lọc, không chứa nguồn carbonhydrate khác (vd TSA) • Khẳng đònh khuẩn lạc đã đếm bằng môi trường lỏng chọn lọc cho Coliform 20 CÁC TRƯỜNG HP CẦN PHẢI KHẲNG ĐỊNH • Mẫu có hệ VSV gây nhiễu trong môi trường dành cho Coliform: ví dụ: nước biển, cá và các sản phẩm của cá, rau quả Các vi sinh vật gây nhiễu: Aeromomas,... … 21 FEACAL COLIFORM • Hiện diện thường xuyên trong ruột người và động vật • Sự hiện diện của F coliform được đánh giá là ô nhiễm phân tươi • Gồm các giống: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter 22 MÔI TRƯỜNG • Violet red bile agar (VRB) Cao nấm men 3g NaCl 5g Muối mật số 3 1.5g Lactose 10g Neutral red 0.03g Crystal violet 0.002g Agar 15g nước cất 1000g pH 7.4 ±0.2 23 MÔI TRƯỜNG (tt) •... đơn: 5 ống Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sang EC Ủ ở 44.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ Chọn các ống sinh hơi trên EC để cấy sang Endo agar Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24giờ 29 ĐỊNH LƯNG F COLIFORMS (PP MPN) (tt) Chọn các khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, cấy sang môi trường canh trypton Ủ 37.0 ± 0.5oC trong 24 giờ Đếm số lượng ống có vi khuẩn cho phản ứng indol (+) tương ứng trên mỗi dãy... Nuôi cấy trong ống nghiệm hay trong đóa với điều kiện kỵ khí • Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống/ đóa 12 MÔI TRƯỜNG • Iron sulphite agar • - Tryptose • - Soyton • - Cao nấm men • - Na2S2O5 15g 5g 5g 1g • - Ferric ammonium citrate 1g 20g • - Agar 1lít • - Nước cất 13 ĐỊNH LƯNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT KỴ KHÍ SINH H2S Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào ống nghiệm 18 x 180 mm Xử lý nhiệt... ĐẾM KHUẨN LẠC) • Qui trình đònh lượng F Coliform tương tự qui trình đònh Coliform, chỉ khác nhau mấy điểm sau – Ủ đóa môi trường VRB ở 44.0 ± 0.5oC trong 24 -48 giờ – Cấy khẳng đònh vào EC và ủ 44.0 ± 0.5oC trong 24 -48 giờ – Các khuẩn lạc sinh hơi trên EC được cấy qua môi trường canh Trypton để thử nghiệm indol – Khuẩn lạc dương tính khi sinh hơi trên EC và có phản ứng indol dương tính 27 ĐỊNH LƯNG... Chọn các ống sinh hơi cấy sang BGBL Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ Đếm số lượng ống sinh hơi trong từng dãy Tra bảng MPN tương ứng với 5 ống 10ml, 5 ống 1ml, 5 ống 0.1ml Kết quả: MPN/100ml 28 ĐỊNH LƯNG F COLIFORMS (PP MPN) Cấy 10ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đôi: 5 ống Cấy 1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ống Cấy0.1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ống Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờ Chọn các ... (cfu/ g) (C) N C = xR nVf 26 ĐỊNH LƯNG FEACAL COLIFORMS (PP ĐẾM KHUẨN LẠC) • Qui trình đònh lượng F Coliform tương tự qui trình đònh Coliform, khác điểm sau – Ủ đóa môi trường VRB 44.0 ± 0.5oC... cấy mẫu 15-20ml môi trường PCA đun chảy làm nguội đến 45oC Lắc cho mẫu khuếch tán vào môi trường QUI TRÌNH ĐỊNH LƯNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (tt) Để đóa mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc... 8.5g • Môi trường không chọn lọc • - Plate count agar • - Nutrient agar • - Standard count agar QUI TRÌNH ĐỊNH LƯNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 10g mẫu + 90g Salin Pepton Water, đồng stomacher 30