ISO/TS 11133-2 HƯỚNG DẪN THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Lĩnh vực áp dụng • Các nhà sản suất môi trường thương mại • Đơn vị sản suất môi trường cung cấp cho bên thứ • Các PTN tự tổng hợp môi trường Các tiêu cần kiểm soát • • • • • • • Thể tích, độ dày môi trường Màu sắc đồng Độ bền gel agar/gelatin Độ ẩm pH Khả đệm Độ vô trùng Các số chất lượng phát triển vi sinh vật • Độ vô trùng • Chỉ số phát triển vi sinh vật • Sự biểu ổn định tính chất sinh lý/sinh hóa VSV • Khả kháng khuẩn Kiểm soát độ vô trùng • Số lượng mẫu: • ống/đĩa hay 1% đầu lô pha chế • ống/đĩa hay 1% cuối lô pha chế • Ủ • 18h/37oC • Hoặc điều kiện sử dụng môi trường Chỉ số phát triển VSV • Chỉ số phát VSV môi trường • Chỉ số tăng trưởng (productivity - Pr) • Chỉ số chọn lọc (Selectivity) • Phương pháp xác định thông qua kỹ thuật • Định tính • Định lượng • Bán định lượng Chỉ số tăng trưởng Pr • Công thức tính Ns Pr = No – No: Tổng số khuẩn lạc đếm MT tham chiếu • No ≥ 100 CFU – Ns: Tổng số khuẩn lạc đếm MT thử nghiệm – Pr MT không chọn lọc ≥0,7; Pr MT chọn lọc ≥0,1 • Tham khảo ISO/TS 11133-2, Annex B Chỉ số chọn lọc SF • Công thức tính Sf = Do - Ds – Do: Số khuẩn lạc phát triển môi trường tham chiếu độ pha loãng cao – Ds: Số khuẩn lạc phát triển môi trường thử nghiệm độ pha loãng cao Ds Do biểu diễn dang log10 • Tham khảo ISO/TS 11133-2, Annex B Phương pháp đánh giá số phát triển môi trường VSV • Khi cần đánh giá số phát triển? • Một lô môi trường • Thay loại MT cũ MT có chức tương đương • Thay đổi nhà cung cấp • Chủng VSV dùng cho thử nghiệm • Chủng phù hợp với môi trường (dùng cho xác định số Pr) • Chủng không phù hợp với MT cần thử nghiệm (xác định Sf) – Sử dung chủng Mật đô vi sinh vật cho thử nghiệm Productivity • Thử nghiệm số tăng trưởng - Pr – Thử nghiệm định lượng: 102cfu/đĩa – Thử nghiệm định tính hay bán định lượng: • 103 – 104 CFU/đơn vị cấy – Thử nghiệm định tính cho MT lỏng: • 10 – 100 CFU/đơn vị cấy • Thử nghiệm số chọn lọc Sf • 104 – 106 CFU/đơn vị cấy Phương định lượng đĩa • Thích hợp cho tất loại môi trường agar Chọn VSV Chọn số lượng Cấy vào môi trường đối chứng / kiểm tra Ủ điều kiện Đếm số khuẩn lạc xuất MT thử nghiêm / đối chứng Tính số Phương pháp bán định lượng • Chọn chủng VSV với mật độ 104-106 CFU/ml • Que cấy vòng 1ul • Góc que cấy mặt thạch: 20 – 30 O Cách cấy bán định lượng Sinh khối xuất kín đường cây: 1 A Xuất khoảng nửa đường: 0,5 Xuất < 1/2 đường: 16 B 15 14 D 13 Chỉ số phát triển 12 11 10 C - Chủng VSV mục tiêu: Gl ≥ - Không phải VSV mục tiêu: bị ức chế hoàn toàn - Khuẩn lạc phải đặc trưng cho chủng Cách cấy định tính • Sử dụng để kiểm tra môi trường rắn Các chủng VSV thử nghiệm khác -Điểm 0: VSV không mọc - Điểm 1: VSV mọc yếu - Điểm 2: VSV phát triển tốt -Chỉ số chấp nhận: -VSV đích: phải đạt điểm -VSV khác: - điểm Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng • Bước thực – Cấy • • • • Trích 10ml MT thử nghiệm đối chứng Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu Với VSV mục tiêu: cấy >1000cfu Cấy hỗn hợp: cấy 10-100cfu VSV mục tiêu >1000cfu VSV mục tiêu (không sử dụng môi trường đối chứng) – Ủ điều kiện sử dụng MT – Trích mẫu cấy trãi môi trường agar không chọn lọc – Đếm khuẩn lạc xuất • Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng • Diễn giải kết – Môi cấy riêng lẻ so với môi trường đối chứng • VSV mục tiêu: Pr ≥ 0,1 • VSV không mục tiêuSf ≥ – Nuôi cấy hỗn hợp: đa số phải VSV mục tiêu – Yêu cầu MT • VSV mục tiêu: mật độ đạt > 106 cfu/ml • VSV không mục tiêu: không 104 cfu/ml Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – bán định lượng • Qui trình – Cấy • Trích 10ml MT thử nghiệm đối chứng • Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu • Với VSV mục tiêu: cấy >1000cfu – Ủ điều kiện thích hợp • VSV mục tiêu: trãi 10 µl lên MT rắng chọn lọc đặc trưng • VSV không mục tiêu: trãi 10 µl lên MT TSA Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – bán định lượng • Diễn giải kết – Với VSV mục tiêu: xuất 10 khuẩn lạc đặc trưng MT rắn chọn lọc – Với VSV không mục tiêu: không nhiều 10 khuẩn lạc TSA Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng –định tính • Cấy trực tiếp VSV vào môi trường thử nghiệm • Diễn giải kết • Không đục: • Đục nhẹ: • Đục: Môi trường đạt yêu cầu đạt độ đục là: [...]... điểm Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng • Bước thực hiện – Cấy • • • • Trích 10ml MT thử nghiệm và đối chứng Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu Với VSV không phải mục tiêu: cấy >1000cfu Cấy hỗn hợp: cấy 10-100cfu VSV mục tiêu và >1000cfu VSV không phải mục tiêu (không sử dụng môi trường đối chứng) – Ủ ở điều kiện sử dụng của MT – Trích mẫu cấy trãi trên môi trường agar không chọn... khuẩn lạc xuất hiện • Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng • Diễn giải kết quả – Môi cấy riêng lẻ và so với môi trường đối chứng • VSV mục tiêu: Pr ≥ 0,1 • VSV không mục tiêuSf ≥ 2 – Nuôi cấy hỗn hợp: đa số phải là VSV mục tiêu – Yêu cầu trên mỗi MT • VSV mục tiêu: mật độ đạt > 106 cfu/ml • VSV không mục tiêu: không quá 104 cfu/ml Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng –... các loại môi trường agar Chọn VSV Chọn số lượng Cấy vào môi trường đối chứng / kiểm tra Ủ ở trong cùng điều kiện Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên MT thử nghiêm / đối chứng Tính các chỉ số Phương pháp bán định lượng • Chọn chủng VSV với mật độ 104-106 CFU/ml • Que cấy vòng 1ul • Góc giữa que cấy và mặt thạch: 20 – 30 O Cách cấy bán định lượng Sinh khối xuất hiện kín đường cây: 1 1 2 3 A Xuất hiện khoảng... 10 khuẩn lạc đặc trưng trên MT rắn chọn lọc – Với VSV không mục tiêu: không nhiều hơn 10 khuẩn lạc trên TSA Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng –định tính • Cấy trực tiếp VSV vào môi trường thử nghiệm • Diễn giải kết quả • Không đục: 0 • Đục nhẹ: 1 • Đục: 2 Môi trường đạt yêu cầu khi đạt độ đục là: 2 ... định lượng • Qui trình – Cấy • Trích 10ml MT thử nghiệm và đối chứng • Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu • Với VSV không phải mục tiêu: cấy >1000cfu – Ủ ở điều kiện thích hợp • VSV mục tiêu: trãi 10 µl lên MT rắng chọn lọc đặc trưng • VSV không mục tiêu: trãi 10 µl lên MT TSA Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – bán định lượng • Diễn giải kết quả – Với VSV mục tiêu: xuất hiện ít nhất 10 khuẩn... hiện kín đường cây: 1 1 2 3 A Xuất hiện khoảng nửa đường: 0,5 Xuất hiện < 1/2 đường: 0 4 16 B 15 14 8 7 6 5 D 13 Chỉ số phát triển 12 11 10 C 9 - Chủng VSV mục tiêu: Gl ≥ 6 - Không phải VSV mục tiêu: có thể bị ức chế hoàn toàn - Khuẩn lạc phải đặc trưng cho chủng Cách cấy định tính • Sử dụng để kiểm tra môi trường rắn Các chủng VSV thử nghiệm khác nhau -Điểm 0: VSV không mọc - Điểm 1: VSV mọc yếu - Điểm ... hợp với MT cần thử nghiệm (xác định Sf) – Sử dung chủng Mật đô vi sinh vật cho thử nghiệm Productivity • Thử nghiệm số tăng trưởng - Pr – Thử nghiệm định lượng: 102cfu/đĩa – Thử nghiệm định tính... kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng – định lượng • Bước thực – Cấy • • • • Trích 10ml MT thử nghiệm đối chứng Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu Với VSV mục tiêu: cấy >1000cfu Cấy hỗn hợp: cấy 10-100cfu... lạc TSA Phương pháp kiểm soát môi trường nuôi cấy lỏng –định tính • Cấy trực tiếp VSV vào môi trường thử nghiệm • Diễn giải kết • Không đục: • Đục nhẹ: • Đục: Môi trường đạt yêu cầu đạt độ đục