BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO VIỆN ðẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ðỊNH, GÂY ðỘC TẾ BÀO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA NỘI SINH TRÊN CÂY HỌ THÔNG PINACEAE Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO VIỆN ðẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ðỊNH, GÂY ðỘC TẾ BÀO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA NỘI SINH TRÊN CÂY HỌ THÔNG PINACEAE Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Mai Hương Sinh viên thực hiện: Dương Thị Thanh Thủy Lớp: 0605 Hà Nội – 2010 LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Mai Hương – Trưởng phòng Sinh học thực nghiệm Th.S Trần Thị Như Hằng, phòng Sinh học thực nghiệm, Viện hóa học hợp chất thiên nhiên ñã giúp ñỡ bảo tận tình cho suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn cán công tác phòng Sinh học thực nghiệm anh, chị: Mai Ngọc Toàn, Trần Hồng Hà, Nguyễn Hoàng Kim Chi, Vũ ðình Giáp, Nguyễn ðình Luyện ñã tạo ñiều kiện cho hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới giảng viên, cộng tác viên khoa Công nghệ Sinh học - Viện ðại học Mở Hà Nội ñã dạy dỗ năm qua Cuối cùng, xin cảm ơn gia ñình, bạn bè ñã ñộng viên tạo ñiều kiện cho học tập hoàn thành khóa luận Hà Nội, 23 tháng năm 2010 Sinh viên Dương Thị Thanh Thủy NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN CMC : Cacboxyl metyl xenluloza EtOAc : Etyl axetat EtOH : Etanol NNS : Nấm nội sinh MT : Môi trường VSV : Vi sinh vật VSVKð : Vi sinh vật kiểm ñịnh MỤC LỤC MỞ ðẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu nấm nội sinh thực vật 1.1.1 Nấm nội sinh thực vật gì? 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh thực vật 1.1.2.1 Tình nghiên cứu giới 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .4 1.1.3 Quan hệ NNS chủ 1.1.4 Các sản phẩm tự nhiên từ NNS 1.1.4.1 Chất kháng sinh 1.1.4.2 Chất chống ung thư .11 1.1.4.3 Chất chống oxy hóa 14 1.2 Họ thông (Pinaceae) 15 1.2.1 ðặc ñiểm chung 15 1.2.2 Phân bố .16 1.2.3 Phân loại .17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Mẫu 19 2.1.2 Chủng VSV kiểm ñịnh 19 2.1.3 Các dòng tế bào 19 2.1.4 Dụng cụ hóa chất .19 2.1.5 Môi trường 20 2.1.5.1 Môi trường phân lập .20 2.1.5.2 Môi trường nuôi cấy giữ chủng NNS 20 2.1.5.3 Môi trường thử hoạt tính enzym 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phân lập chủng NNS .21 2.2.2 Sàng lọc hoạt tính kháng VSVKð chủng NNS phân lập ñược 22 2.2.3 Xác ñịnh trọng lượng sinh khối khô 22 2.2.4 Hoạt tính enzym ngoại bào 22 2.2.4.1 Xác ñịnh xenlulaza .22 2.2.4.2 Xác ñịnh amilaza 23 2.2.4.3 Xác ñịnh proteaza 24 2.2.5 Ảnh hưởng ñiều kiện nuôi cấy ñến hoạt tính sinh học chủng nấm 24 2.2.5.1 Lựa chọn môi trường thích hợp 24 2.2.5.2 Ảnh hưởng pH ban ñầu 24 2.2.5.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 24 2.2.5.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ 24 2.2.6 Lên men, chiết rút thành phần có hoạt tính sinh học chủng NNS 25 2.2.7 Xác ñịnh hoạt tính sinh học cặn chiết 25 2.2.7.1 Hoạt tính kháng VSVKð 25 2.2.7.2 Hoạt tính gây ñộc tế bào 26 2.2.7.3 Hoạt tính chống oxy hóa .27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng NNS 28 3.2 Sàng lọc sơ chủng có hoạt tính sinh học 29 3.3 Các ñiều kiện nuôi thích hợp cho hoạt tính kháng VSVKð sinh khối khô chủng nấm HT18ð NV8T 31 3.3.1 Môi trường thích hợp 31 3.3.2 ðiều kiện pH thích hợp .34 3.3.3 Lựa chọn thời gian lên men thích hợp ñể thu nhận sản phẩm 36 3.3.4 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp 39 3.3.5 Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp .41 3.4 Tách chiết ñánh giá hoạt tính sinh học cặn chiết EtOAc thu ñược từ dịch nuôi cấy chủng HT18ð NV8T 43 3.4.1 Hoạt tính kháng VSVKð 43 3.4.2 Hoạt tính gây ñộc tế bào 44 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa .44 3.4.4 Hoạt tính enzym ngoại bào 45 KẾT LUẬN 46 PHỤ LỤC 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ðẦU Nấm nội sinh nhóm vi sinh vật sống mô thực vật ñược tìm thấy hầu hết loài thực vật Trái ñất, loài thực vật ñều vật chủ hay nhiều loại nấm nội kí sinh Tuy nhiên nấm nội sinh bắt ñầu ñược nghiên cứu khoảng hai thập kỷ trở lại ñây người ta nhận thấy mối liên hệ chặt chẽ chúng thực vật chủ Hàng loạt nghiên cứu ñã ñược tiến hành sâu ñể ñưa kết chứng minh tầm quan trọng nấm ñối với qui luật trao ñổi chất bên cây, bảo vệ kháng lại số sâu hại, dịch bệnh, chí ñiều kiện khắc nghiệt môi trường Trong khoảng 500.000 loài thực vật bậc cao tồn Trái ñất, số loài ñã ñược nghiên cứu sinh vật nội sinh ðiều ñó có nghĩa, hội ñể nghiên cứu tìm kiếm hợp chất từ nấm nội sinh rộng mở Nằm khu vực nhiệt ñới gió mùa nên nước ta có thảm thực vật rừng vô phong phú Tuy nhiên năm gần ñây áp lực tăng dân số phát triển kinh tế nhanh, thảm thực vật rừng nước ta bị suy giảm phân cắt mạnh làm cho cấu trúc hữu hiệu ñược thiết lập trình hình thành loài quần thể bị phá vỡ ðể bảo tồn nguồn gen loài thực vật quý hiếm, ñang có nguy tuyệt chủng cao, xác ñịnh tính ña dạng di truyền mức ñộ loài quần thể, với nghiên cứu mức ñộ tiến hoá, mối quan hệ di truyền loài tự nhiên, ñặc biệt loài nấm nội sinh thực vật có vai trò quan trọng góp phần ñưa chiến lược bảo tồn phục hồi loài hữu hiệu ðiều ñược ghi nhận chìa khoá cho thành công lĩnh vực quản lý, bảo tồn phục hồi loài quý (Rao, 2004) Các loài Thông rừng quan trọng ñóng vai trò lớn kinh tế, sinh thái văn hoá nước ta Tuy 2/3 số loài Thông nước ta ñang bị ñe dọa nghiêm trọng, bị khai thác mức chúng ñều có Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp giá trị thương mại cao Nếu loài Thông bị ñe dọa kéo theo biến loài nấm nội sinh Thông, nguồn tài nguyên không phần giá trị nghiên cứu khai thác chất chống ung thư taxol, paclitaxel ñược tìm thấy loài nấm Có thể coi loài Thông quí “ngôi nhà” vi sinh vật nội sinh quí giá cần nghiên cứu Bảo tồn loài Thông quí ñồng thời nghiên cứu phân lập, sàng lọc hoạt tính sinh học nấm nội sinh việc làm có ý nghĩa khoa học thực tiễn nhằm tiết kiệm thời gian, công sức có kết hợp ña ngành nghiên cứu bảo tồn phục hồi tài nguyên thiên nhiên quí hiếm.Với mục ñích trên, thực ñề tài: “Phân lập, lựa chọn chủng nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh, gây ñộc tế bào hoạt tính chống oxy hóa nội sinh họ thông Pinaceae” Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu nấm nội sinh thực vật (Endophytic fungi) 1.1.1 Nấm nội sinh thực vật gì? Nấm nội sinh thực vật ñược ñịnh nghĩa loài nấm sống mô thực vật khỏe mạnh mà không biểu cụ thể tồn chúng mô không gây thương tích cho chủ (Bills, 1996) Hoặc theo ñịnh nghĩa từ ñiển Webster nấm nội sinh thực vật “nấm sống cây” Loại nấm ñược ý lần ñầu tiên vào năm 1940 phải ñến ñầu kỉ XXI, tồn chúng ñược công nhận ñầy ñủ 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh thực vật 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Hướng nghiên cứu, tìm hiểu chất có hoạt tính sinh học từ NNS bắt ñầu từ thập kỷ cuối kỷ XX dựa mối quan hệ khăng khít chủ NNS ðiều dễ nhận tất thực vật bậc cao ñều vật chủ hay vài loài VSV nội sinh số khoảng 300.000 loài thực vật có hành tinh có số VSV nội sinh chúng ñược phát nghiên cứu Do vậy, vài thập niên từ cuối năm 80 kỷ XX, người ta cho VSV nội sinh nói chung NNS nói riêng hội hấp dẫn cho việc tìm kiếm, khai thác chất hữu lạ sử dụng y học, công nghiệp, nông nghiệp Các chất từ chủ NNS sinh chủ sản xuất ñể chống lại có mặt nấm ñó Trong nông nghiệp, nghiên cứu NNS ngày tăng vài thập kỉ qua, ñược tiến hành hầu hết quốc gia giới ñặc biệt nước có khí hậu nhiệt ñới, có diện tích ñất nông nghiệp rộng lớn ðây ñiều kiện ñể sinh vật gây hại dịch bệnh phát triển Sự phát triển NNS ñóng vai trò quan trọng qui luật bên cây, chúng có khả bảo vệ chủ nơi chúng cư trú chống lại sâu hại, dịch bệnh ñiều kiện khắc nghiệt môi trường Theo ñiều tra nghiên cứu nhà khoa học Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp bột, CMC Sau tuần xác ñịnh hoạt tính kháng VSVKð phương pháp ñục lỗ thạch trọng lượng sinh khối khô Kết ñược thể bảng 10, 11 hình 10, 11 Bảng 10 Kết thu sinh khối nguồn cacbon khác Sinh khối khô (g/l) Chủng Glucoza Lactoza Saccaroza Tinh bột CMC HT18ð 10,72 6,403 3,8 4,64 3,141 NV8T 7,06 3,765 11,08 7,125 1,928 Bảng 11 Hoạt tính kháng VSVKð hai chủng HT18ð NV8T nguồn cacbon khác Chủng HT18ð NV8T Hoạt tính kháng VSVKð (D-d, mm) Môi B E S A C F subtilis coli aureus niger albicans oxysporum Glucoza 11 11 16 12 Lactoza 10 14 12 Saccaroza 22 Tinh bột 9 0 12 CMC 18 15 0 16 Glucoza 12 10 10 Lactoza 10 0 Saccaroza 19 11 20 10 Tinh bột 9 12 CMC 11 trường Ghi chú: D = ñường kính vòng vô khuẩn, d = ñường kính lỗ ñục thạch ñĩa Dương Thị Thanh Thủy 38 Lớp 06-05 25 Glucoza 20 Lactoza 15 Saccaroza 10 Tinh bột CMC or um ox ys p ic an s er ig F C al b A n re us S au E co B su b li til is Hoạt tính kháng VSVKKð (D-d,mm) Khóa luận tốt nghiệp VSV kiểm ñịnh Hình 10 Hoạt tính kháng VSVKð chủng HT18ð nguồn cacbon 25 20 Glucoza 15 Lactoza Saccaroza 10 Tinh bột CMC or um F ox ys p ic an s er C al b ig A n re us S au E co B su b li til is Hoạt tính kháng VSV Kð (D-d,mm) khác VSV kiểm ñịnh Hình 11 Hoạt tính kháng VSVKð chủng NV8T nguồn cacbon khác Kết bảng 10 hình 10 cho thấy chủng HT18ð cho sinh khối hoạt tính kháng VSVKð tốt MT Czapek có bổ sung glucoza Còn chủng NV8T cho sinh khối hoạt tính kháng VSVKð tốt MT Czapek có bổ sung saccaroza (bảng 10 & hình 11) Vì lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng thể hoạt tính kháng VSVKð chủng HT18ð NV8T glucoza sacaroza Dương Thị Thanh Thủy 39 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp 3.3.5 Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp Hai chủng nấm ñược nuôi cấy MT sở MT Czapek dịch thể ñược bổ sung pepton; cao nấm men; (NH4)2SO4; NH4NO3; NaNO3 Sau tuần xác ñịnh hoạt tính kháng VSVKð phương pháp ñục lỗ thạch trọng lượng sinh khối khô Kết ñược thể bảng 12, 13 hình 12, 13 Bảng 12 Sinh khối khô hai chủng HT18ð NV8T nguồn nitơ khác Chủng Sinh khối khô (g/l) Pepton Cao nấm men (NH4)2SO4 NH4NO3 NaNO3 HT18ð 8,863 8,319 4,228 5,827 3,928 NV8T 8,473 7,195 5,359 9,593 6,771 Bảng 13 Hoạt tính VSVKð chủng HT18ð NV8T nguồn nitơ khác Hoạt tính kháng VSVKð (D-d,mm) Chủng HT18ð NV8T Môi B E S A C F trường subtilis coli aureus niger albicans oxysporum Pepton 11 16 Cao NM 11 16 15 11 (NH4)2SO4 20 10 11 NH4NO3 18 15 NaNO3 16 0 Pepton Cao NM 19 (NH4)2SO4 7 6 NH4NO3 18 5 18 NaNO3 10 4 Ghi chú: D = ñường kính vòng vô khuẩn, d = ñường kính lỗ ñục thạch ñĩa Dương Thị Thanh Thủy 40 Lớp 06-05 25 20 Pepton Cao NM 15 (NH4)2SO4 10 NH4NO3 NaNO3 or um ox ys p ic an s F C al b A n ig er re us S au E co B su b li til is Hoạt tính kháng VSVKð (D-d,mm) Khóa luận tốt nghiệp VSV kiểm ñịnh Hình 12 Hoạt tính kháng VSVKð chủng HT18ð nguồn nitơ Pepton 20 18 16 14 12 10 Cao NM (NH4)2SO4 NH4NO3 C a lb ic an s F ox ys po ru m n ig er A us E co li NaNO3 S au re B s ub ti l is Hoạt tính kháng VSVKð (D-d,mm) khác VSV kiểm ñịnh Hình 13 Hoạt tính kháng VSVKð chủng NV8T nguồn nitơ khác Từ kết bảng 12, nhận thấy chủng HT18ð cho sinh khối cao MT Czapek có pepton; chủng NV8T MT có NH4NO3 Hình 12 cho thấy chủng HT18ð thể hoạt tính kháng VSVKð tốt MT có cao nấm men, chủng NV8T MT có NH4NO3 (hình 13) Vì chọn nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng thể hoạt tính kháng VSVKð chủng HT18ð cao nấm men; chủng NV8T NH4NO3 Dương Thị Thanh Thủy 41 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp 3.4 Tách chiết ñánh giá hoạt tính sinh học cặn chiết EtOAc thu ñược từ dịch nuôi cấy chủng HT18ð NV8T Hai chủng NNS ñược lên men MT khoai tây dịch thể Sau tuần, dịch nuôi ñược ñem chiết EtOAc (theo sơ ñồ 1) Cặn chiết EtOAc ñược ñem thử hoạt tính kháng VSVKð ñể tính giá trị MIC hoạt tính kháng sinh dòng tế bào ung thư người 3.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Kết thử hoạt tính VSVKð cặn chiết thô EtOAc chủng lựa chọn ñược trình bày bảng 14 Bảng 14 Hoạt tính kháng VSVKð cặn chiết EtOAc Hoạt tính VSVKð, MIC (µg/ml) KH B E subtilis coli HT18ð 100 100 100 400 100 - - - NV8T - 400 - - 400 100 - - mẫu S P A aureus aeruginosa niger C F S albicans oxysporum cerevisiae Kết bảng 17 cho thấy cặn chiết EtOAc chủng HT18ð có hoạt tính kháng vi khuẩn B.subtilis, E.coli, S aureus nấm mốc A.niger với giá trị MIC tương ứng 100 µg/ml Chủng biểu khả ức chế yếu vi khuẩn P.aeruginosa với giá trị MIC 400 µg/ml Còn cặn chiết EtOAc chủng NV8T có hoạt tính kháng nấm men C.albicans với giá trị MIC 100 µg/ml Chủng biểu khả ức chế yếu chủng vi khuẩn E.coli nấm mốc A.niger với giá trị MIC 400 µg/ml 3.4.2 Hoạt tính gây ñộc tế bào Cặn chiết EtOAc chủng NNS ñược ñánh giá hoạt tính gây ñộc hai dòng tế bào ung thư ung thư gan Hep-G2 dòng tế bào ung thư phổi - LU Kết ñược trình bày bảng 15 Dương Thị Thanh Thủy 42 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 15 Kết hoạt tính gây ñộc tế bào cặn chiết thô EtOAc chủng lựa chọn Dòng tế bào Kí hiệu Kết luận (Cell survival %) mẫu Hep- G2 LU Chứng (+) 0,32 0,35 HT18ð 38,5 ± 0,6 50,1 ± 0,07 Dương tính NV8T 60,2 ± 0,4 96,9 ± 0,9 Âm tính Kết bảng 15 cho thấy chủng HT18ð dương tính với dòng tế bào thử nghiệm, tỷ lệ tế bào sống sót tương ñối thấp 38,5% ñối với dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 50,1 % ñối với dòng tế bào ung thư phổi – LU Còn chủng NV8T âm tính với hai dòng tế bào thử nghiệm 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết EtOAc chủng ñược thể bảng 16 Bảng 16 Kết hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết Kí hiệu mẫu SC % Kết Chứng (+) 64,05 ± 0,7 Dương tính Chứng (-) 0,00 ± 0,0 HT18ð 78,95 ± 0,1 Dương tính NV8T 59,06 ± 0,2 Dương tính Cả cặn chiết EtOAc hai chủng NNS ñều có hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH, ñặc biệt chủng HT18ð có hoạt tính chống oxy hóa cao với SC% 78,95 Dương Thị Thanh Thủy 43 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp 3.4.4 Hoạt tính enzym ngoại bào Kết thử hoạt tính enzym ngoại bào ñược thể bảng 17 Bảng 17 Hoạt tính enzym ngoại bào dịch nuôi cấy Hoạt tính enzym ngoại bào (D-d, mm) Chủng Xenlulaza Amylaza Proteaza HT18ð NV8T 17 Ghi chú: D = ñường kính vòng phân giải, d = ñường kính lỗ ñục thạch Kết bảng 17 cho thấy hai chủng HT18ð NV8T ñều có hoạt tính với enzym ngoại bào Riêng chủng NV8T có hoạt tính enzym ngoại bào tốt với khả phân giải ñược Amylaza với ñường kính vòng phân giải tương ñối cao Dương Thị Thanh Thủy 44 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Từ kết thu ñược, ñưa số kết luận sau: Từ phận mẫu thông, ñã phân lập ñược 20 chủng NNS lựa chọn ñược chủng kí hiệu HT18ð NV8T có hoạt tính kháng VSVKð cao ðã lựa chọn ñược ñiều kiện lên men thích hợp cho hoạt tính kháng VSVKð thu nhận sinh khối khô cao chủng là: Môi trường khoai tây với nguồn cacbon glucoza cho chủng HT18ð sacaroza cho chủng NV8T; nguồn nitơ cao nấm men cho chủng HT18ð NH4NO3 cho chủng NV8T; pH = 6; thời gian thu nhận sản phẩm thích hợp sau tuần lên men ðã tiến hành tách chiết hóa học xác ñịnh hoạt tính sinh học chủng: • Cặn chiết EtOAc chủng HT18ð có hoạt tính kháng vi khuẩn B.subtilis, E.coli, S aureus nấm mốc A.niger với giá trị MIC tương ứng 100µg/ml; có biểu hoạt tính gây ñộc tế bào hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 dòng tế bào ung thư phổi – LU; có hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH với giá trị SC% 78,95; có khả sinh enzym ngoại bào amylaza proteaza • Cặn chiết EtOAc chủng NV8T có hoạt tính kháng nấm men C.albicans với giá trị MIC 100 µg/ml; không biểu hoạt tính gây ñộc hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 dòng tế bào ung thư phổi – LU; có hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH với giá trị SC% 59,06; có khả sinh enzym ngoại bào amylaza, proteaza xenlulaza Dương Thị Thanh Thủy 45 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp PHỤ LỤC Hình phụ lục Một số chủng NNS a) b) Hình phụ lục Hoạt tính kháng VSVKð chủng HT18ð (2) NV8T (1) a) Kháng với chủng vi khuẩn Bacillus subtillis ATCC 27212 b) Kháng với vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 Hình phụ lục Chủng HT18 ð kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 12222 Dương Thị Thanh Thủy 46 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp a) Hoạt tính enzym xenlulaza b) Hoạt tính enzym proteaza c) Hoạt tính enzym amylaza Hình phụ lục Hoạt tính enzym ngoại bào chủng HT18ð (2) NV8T (1) Dương Thị Thanh Thủy 47 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng (2002), “Công nghệ nuôi trồng nấm”, tập 2, nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Hồng Hà & cộng tác viên, 2000 ðiều tra ñánh giá tượng hệ nấm cộng sinh nhóm vi sinh vật ñối kháng dược liệu quý ñịnh hướng ứng dụng Kết thực ñề tài cấp nhà nước ñiều tra tài nguyên môi trường Nguyễn Sỹ Giao & cộng tác viên, 1971 Nghiên cứu ñịnh hướng ứng dụng số chủng nấm cộng sinh môi trường non phục vụ nghề rừng Phạm Văn Ty, ðào Huyền Lương, Nguyễn Thanh Hiền, 1993 “Tìm hiểu khả diệt nấm gây bệnh thối cổ rễ số chủng Trichoderma phân lập Việt Nam” Tr.111, tập 15- số tạp chí Sinh học Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương, 1997 “Phân lập nghiên cứu chất chiết từ nấm nội kí sinh Taxus chinensis” Kỷ yếu – Annual report Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Mai Ngọc Toàn (2005), “Chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng nấm Aspergillus awamori Nakazawa kí sinh sảng Stecularia lameolata cavan (họ Steculaceae)”, Tạp chí Khoa học công nghệ, 4A (6A), tr 132-136 Lê Mai Hương, Trần Thị Như Hằng cộng (2010), “ðiều tra, ñánh giá chất hoạt tính sinh học có giá trị thực tiễn cao từ khu hệ nấm cộng sinh kí sinh số thuốc mô hình nghiên cứu tiên tiến, ñề xuất giải pháp khai thác sử dụng hợp lý” B TÀI LIỆU TIẾNG ANH Battle – Vierra and L.pezer-Viicente A study of endophytics fungal special associate with root necrosis of banana in banana and plantain plantation in Cuba Dương Thị Thanh Thủy 48 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp Brady, S.F., and J Clardy 2000 CR 377, a new pentaketide antifungal agent isolated from endophytic fungus J Nat Prod 63:1447-1448 10 Clay, K, Hardy, T.N and Hammond Jr., A.M (1985a) Fungal of Cyperus and their effect on the isact herbivore American juarnal of Botany 72”1284-1289 11 Demain, A L 1981 industrial microbiology Science 214: 987-994 12 Gary Strobel, A Stierl and G.M Van kijk 1993 PlanScience, Vol-84, 1992, pps 65-74 13 Gary A Strobel and Jia- Yao Li, 1996 Proceeding of UNESCO Regional Symposium on Drug Development fro, Medicial Plants, Otc 25-27, 1996 Hary zhow, China, ppa.41-42 14 Glienke – Blanco, C.199 Guiganrdia citricarpa, Sao Paulo, Brazin 15 Guo, B., J Dai, S Ng, Y Huang, C Leong, W Ong, and B K Carte 2000 Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of HCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species J Nat Prod 63:602-604 16 Johnson & ctv, 1992 Mango stem and rot pathogens: fruit infection by endophytic colonization of the infloresence and pedic el 120:225-234 17 Kinder, D., Breen, J.P and Springer, T (1990) Russian wheat aphid resistance in coll-season grasse Journal of ecolomic entomoplogy 83:685692 18 Loyo, A.C (1995) Transformation variability detectada for RAPD and isolation of endophytic Collectricum musae University of Sao Paulo, Brazil 19 Lee, J., E lobkovsky, N B Pliam, G A Strobel, and J C Clardy 1996 Torreyanic acid: a selectively cytotoxic quinone dimer from endophytic fungus Pestalotiopsis microspora, J Org Chem 61: 3232-3233 20 Li, C., R P Johnson, and J.A Porco 2003 Total synthesis of the quinine epoxide dimer (+)- torreyanic acid: application of a biomimetic Dương Thị Thanh Thủy 49 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp oxidation/electrocyclization/Diels- Alder dimeization cascade J Am Chem Soc 125: 5059-5106 21 Li, J.Y., G.A Strobel, R Sidhu, W.M Hess, and E Ford 1996 Endophytic taxol producing fungi from Bald Cypress Taxodium distichum Microbiology 142: 2223-2226 22 Medeiros, S.A.F (1998) Micoflora da Folhagenm cajuerio, Anacardium occidentale L.e controle biological agente da antracnose, Collectotrichum gloeosporioides (Penz) Sacc Invitro Ms Thesis Universidade Federal Rural de Pernambuco, Pecife, pernambuco, Brazil 106p 23 Miller, R.V., C.M Miller, D.Garton – Kinney, B Redgrave, J Sears, M Condron, D Teplow, and G A Strobel 1998 Ecomycins, unique antimycotics from Pseudomonas viridiflava J Appl Microbiol 84:937944 24 Pereira, J.O, Carneiro- Vieira, M.L and Azavedo, J.L (1999) Endophytic fungi from Musa Acuminata and their rentroduction in to axenic plants World Journal of Microbiology and Biotechnology 15:37-40 25 Pereira, J.O, Azavedo, J.L Petrini, 1993 Endophytic fungi of Stylosanthe: A first report Micologia 85:362-387 26 Polishook, 1993 27 Schiff, P.B., and S.B Horowitz 1980 Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells, Proc Natl Acad Sci USA 77:1561-1565 28 Shrestha, K., G A Strobel, S Prakash, and M Gewali 2001 Evidence for paclitaxelfrom three new endophytic fungi of Himalayan yew of Nepal Planta Med 67: 374-376 29 Seo, Yeong-Su, Hyuk-woo Shin, Sung-Hwan Yun, Jin- Choel Kim and Yin-Won Lee, 1994 Isolation and Characterization of an Anbiotic Substance, FST-01, produced by Fusarium BYA-1 Isolate Dương Thị Thanh Thủy 50 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp 30 Stinson, M., D Ezra, and G Strobel.2003 An endophytic Gliocladium sp of Eucryphia cordifolia producing selective volatile antimicrobial compounds Plant Sci 165:913-922 31 Strobel, G.A 2002 Microbial gifts from rain forest Can J Plant Pathol 24:14-20 32 Strobel, G.A., A Syierle, D Stierle, and W.M Hess 1993 Taxomyces andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew Mycotaxon 47:71-78 33 Strobel, G.A., E Dirksie, J Sears and C Markworth 2001 Volatile antimicrobials from a novel endophytic fungus Microbiology 147:29432950 34 Strobel, G.A., E Ford, J Worapong, J K Harper, A M Arif D M Grant, P C W Fung and K Chan 2002 Ispoestacin, an izobenzofuranone from Pestslotiopsis microspora, possessting antifungal and antioxidant activities Phytochemistry 60:179-183 35 Strobel, G., X Yang, J Sears, R Kramer, R S Sidhu and W M Hess 1996 Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus williichiana Microbiology 142:435-440 36 Viret and Petrini, 1994 Colonization of beech leaves (Fagus sylvatica) by the endophytes 37 Webber, J (1981) A natural control of dutch elm disease, London 292:449-451 38 Walsh, T.A 1992 Inhibitors of o-glucan synthesis, p 349-373 In J.A Sutcliffeband N.H Georgopapadakou (ed.), Emerging targets in antibacterial and antifungal chemotherapy Chapman & hall, London, United Kingdom 39 Worapong, J., G.A Strobel, B Daisy, u Castillo, G Baird and W.M Hess (2002) Muscodor albus gen et sp nov., an endophyte from Grevillea pteridifolia, Mycotaxon 81:463-475 Dương Thị Thanh Thủy 51 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp 40 Worapong, J., G.A Strobel, E.J Ford , J.Y Li, G Baird and W M.Hess (2001) Muscodor albus gen et sp nov., an endophyte from Cinnamomum zeylanicum Mycotaxon 79:67-79 41 Williamson, B, 1994 Latencyand quiesences insurvival and sucess of fungal plant pathogens Oxford 42 Zou, W X., J C Meng, H Lu, G X Chen, G.X Shi, T.Y Zhang and R.X Tan 2000 Metab olites of Collectrichum gloeosprioides, an endophytic fungus in Artemisia mongolica J nat Prod 63:1529-1530 Dương Thị Thanh Thủy 52 Lớp 06-05 [...]... hại và mầm bệnh Vì vậy chúng tôi xác ñịnh sàng lọc, tuyển chọn từ các chủng nấm phân lập ñược theo hướng hoạt tính sinh học Từ 20 chủng NNS ñã phân lập ñược, chúng tôi tiến hành sàng lọc, tuyển chọn những chủng có hoạt tính sinh học tốt nhất Quá trình sàng lọc hoạt tính kháng VSVKð ñược tiến hành theo hai bước: Bước một, 20 chủng NNS ñược sàng lọc hoạt tính kháng VSVKð theo phương pháp thỏi thạch ñể tuyển. .. petri có môi trường phân lập, sau ñó chuyển ñĩa vào tủ ấm 30ºC Lựa chọn và lưu giữ chủng giống Khi nấm bắt ñầu có sợi khuẩn ty mọc ra từ mô cây, chọn ra các chủng nấm và ria cấy trên môi trường Martin ñể tinh sạch chủng Lựa chọn các chủng sạch và cấy trên môi trường thạch nghiêng khoai tây ñể lưu giữ giống và kiểm tra hoạt tính Trước khi mang ra sử dụng cấy truyền lại sang ống nghiệm mới ñể làm mới chủng. .. Thử hoạt tính Sơ ñồ 1: Phương pháp chiết rút các chế phẩm có hoạt tính sinh học 2.2.7 Xác ñịnh hoạt tính sinh học của các cặn chiết 2.2.7.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Vi c ñánh giá hoạt tính kháng VSVKð ñược thực hiện theo phương pháp của Vanden Bergher và Vlietinck (năm 1994) ðó là phương pháp tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng ñể tìm ra nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC của các chất có hoạt. .. là hoạt tính chống oxy hóa Isopestacin ñược cho là có hoạt tính chống oxy hóa cơ bản là do cấu trúc tương tự như các chất Flavonoid Vi c ño vòng quay ñiện tử thông qua quang phổ ñã xác nhận hoạt tính chống oxy hóa của chất này; hợp chất này có thể thu dọn superoxit và gốc hóa học hydroxyl tự do có trong dung dịch [34] Pestacin ñược xác ñịnh muộn hơn cũng từ dịch môi trường, chất này cũng có hoạt tính. .. các thành phần có hoạt tính sinh học của 2 chủng nấm nội sinh Các chủng nấm có hoạt tính ñược nuôi cấy trên MT dịch thể trong 2- 3 tuần Sau ñó sẽ tách chiết theo sơ ñồ 1 Sản phẩm là cặn chiết EtOAc sẽ dùng ñể ñánh giá hoạt tính sinh học Phương pháp chiết rút thành phần có hoạt tính sinh học ñược thể hiện bằng sơ ñồ sau: Dương Thị Thanh Thủy 24 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp Dịch nuôi nấm (2-3 tuần)... nấm cựa gà kí sinh trên hạt ñại mạch, tiểu mạch, yến mạch và hắc mạch, Họ ñã phân Dương Thị Thanh Thủy 5 Lớp 06-05 Khóa luận tốt nghiệp lập, tuyển chọn các chủng nấm cựa gà có hoạt tính cao ñể lên men, tách chiết alkaloid biến ñổi chúng thành nhiều dược liệu quí giá [1] Năm 2005, TS Lê Mai Hương và cộng sự ñã phân lập và nghiên cứu tính kháng khuẩn của chủng NNS Aspergillus awamori Nakazawa trên cây. .. Paclitaxel của chủng Periconia sp [21] và chủng Seimatoantleriumnepalense – một loài NNS mới khác cũng ñược quan tâm Tóm lại, NNS có khả năng tạo ra Paclitaxel phân bố rộng trong nhiều loài cây không chỉ hạn chế ở cây thông ñỏ Hệ sinh thái và sinh lí học giải thích sự phân bố rộng của nấm có khả năng sinh ra Paclitaxel dường như là có mối liên hệ tới vi c Paclitaxel là có chất chống nấm và các VSV gây bệnh... - - 6 8 - Ghi chú: D = ñường kính vòng vô khuẩn, d = ñường kính lỗ ñục trên thạch ñĩa Dựa vào kết quả bảng 2 cho thấy, trong số 20 chủng nấm có 12 chủng không thể hiện hoạt tính kháng VSVKð; có 3 chủng có hoạt tính kháng 2 VSVKð; 5 chủng (HT18ð, NV8T, XT3R, XT3L, EH6R) có hoạt tính kháng từ 3 VSVKð trở lên Vì vậy chúng tôi chọn 5 chủng này tiếp tục ñược sàng lọc trong bước thứ hai Dương Thị Thanh Thủy... enzym xenlulaza và amilaza 2.2.5 Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến hoạt tính sinh học của các chủng nấm 2.2.5.1 Lựa chọn môi trường thích hợp Các chủng nấm ñã lựa chọn ñược nuôi cấy trên các MT dịch thể: Sabouraud, Khoai tây, nước chiết Cám, nước chiết Ngô, nước chiết ðậu tương, Czapek Sau thời gian 2 - 3 tuần tiến hành xác ñịnh hoạt tính sinh học và trọng lượng sinh khối khô ñể lựa chọn ra môi trường... Khóa luận tốt nghiệp 1.2.3 Phân loại Sự phân loại họ Thông thành các phân họ, chi ñã là chủ ñề gây tranh cãi trước ñây Sinh thái học, hình thái và lịch sử ñược sử dụng như là sự căn bản cho phương pháp phân tích họ này Một công bố năm 1891 ñã chia họ Thông làm 2 phân họ, sử dụng số lượng và vị trí của rãnh nhựa thông trong vùng mạch ñầu của những rễ non là cở sở ñầu tiên Công bố năm 1910 chia họ Thông ... - - - - - - - - 05C - - - - - - - - EH6R 10 - - - 14 - EH12C - - - - - - - EH12T - - - - - - - - EH13T - - - - - - - - EH18C - - - - - - - - HT7ð - - - - - - HT18ð 16 10 - 18 - 12 10 KN8L - -. .. - - - - - - 11 KN10T - - - - - - - - 12 KN13L - - - - - - - - 13 KN13T 11 - - - - - - 14 KN14T - - - - - - - - 15 KN15L - - - - - - - 16 NV8C - - - - - - - - 17 NV8T 12 - 15 - - 11 18 NV10T -. .. - - - - 16 NV8C - - - - - - - - 17 NV8T 12 - 15 - - 11 18 NV10T - - - - - - - - 19 XT3L 16 20 - - - - 15 13 20 XT3R 11 - - - - Ghi chú: D = ñường kính vòng vô khuẩn, d = ñường kính lỗ ñục thạch