ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein expansin liên quan đến kéo dài rễ vào giống đậu tương DT84 ĐẶNG VÂN HÀ Người hướng dẫn: GS TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu tồn cầu diễn biến phức tạp ảnh hưởng nghiêm trọng đến nước giới có Việt Nam Tình trạng nóng lên trái đất dự đoán gây tác động lớn đến nước phát triển Những nước có hệ thống nơng nghiệp chịu chi phối lớn từ điều kiện thời tiết, nơi nhiệt độ tăng chút làm giảm đáng kể sản lượng nơng nghiệp Tình trạng khan nước, làm giảm khoảng 70% sản lượng nơng nghiệp, có đậu tương Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng thuộc họ đậu, trồng ngắn ngày có giá trị cao mặt kinh tế, dinh dưỡng cải tạo đất Tuy nhiên đậu tương tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc nhóm chịu hạn Chính tuyển chọn giống đậu tương có khả chịu hạn thích ứng với điều kiện hạn hán thiếu nước nhiệm vụ chiến lược ngành chọn giống đậu tương Hai chế liên quan đến khả chịu hạn thực vật điều chỉnh áp suất thẩm thấu phát triển mạnh rễ Bộ rễ quan quan trọng thực nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho hoạt động sống phát triển thể thực vật Cơ thể thực vật thích ứng với hạn cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vươn tới lớp đất sâu để hút nước dễ dàng hơn, đồng thời hệ thống rễ phát triển mở rộng theo bề ngang thích ứng tốt với việc tìm kiếm dinh dưỡng khống nước lịng đất Expansin họ protein tác động việc kéo giãn thành tế bào thực vật coi protein chủ yếu ảnh hưởng đến mở rộng Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tế bào thực vật Các kết nghiên cứu cho thấy gen expansin đậu tương đóng vai trị quan trọng việc rễ đậu tương, làm tăng phát triển rễ chính, rễ bên Do tiếp cận nghiên cứu theo hướng tăng cường mức độ biểu gen GmEXP1 đậu tương kỹ thuật chuyển gen giải pháp công nghệ nghiên cứu tạo giống đậu tương chịu hạn Xuất phát từ lý xây dựng nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein expansin liên quan đến kéo dài rễ vào giống đậu tương DT84” Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng chuyển gen chứa gen mã hóa protein expansin từ giống đậu tương DT84 Nội dung nghiên cứu expansin (GmEXP1) thông qua lây nhiễm A tumefaciens vào mô nách mầm hạt chín giống đậu tương DT84; sinh in vitro, chọn lọc dòng đậu tương chuyển gen; 3.3 Phân tích có mặt gen chuyển GmEXP1 dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Chƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu tƣơng Đậu tương có NST 2n = 40, tên khoa học Glycine max (L) Merrill, thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm ột số trồng (papilionideae) Phaseoleae có lịch sử lâu đời loài người Dựa vào đa dạng hình thái hạt, Fukuda (1933) nhiều nhà khoa học thống đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc) xuất phát từ loại đậu tương dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học Glycile Soja Sieb Zucc Từ Trung Quốc đậu tương lan truyền sang nước Đôn ầ ắp giới, nông dân nước châu Á coi trồng [12] Cây đậu tương thuộc loại thân thảo, loại trồng cạn thu hạt bao gồm phận rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương gồm rễ nhiều rễ con, rễ ăn sâu 20-30 cm độ sâu 7-8cm rễ to rễ Rễ tập trung nhiều độ sâu 620cm phát triển dồi Rễ phát triển mạnh chiều ngang độ sâu, rễ mọc sau phát triển chiều ngang Ở độ sâu 2-3cm gặp phải rễ bên cạnh chuyển hướng ăn sâu xuống đất Rễ đậu tương khác với rễ hồ thảo có rễ rễ phụ, rễ ăn sâu 30-50 cm 1m Trên rễ mọc nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp tập trung nhiều tầng đất 7- 8cm, rộng 30- 40cm2 Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ sần Trên rễ đậu tương có nhiều nốt sần, u bướu nhỏ bám vào rễ Nốt sần kết cộng sinh số loại vi sinh vật có tên khoa học Rhizobium Japonicum với rễ đậu tương Trong nốt sần có khoảng 3- tỉ vi sinh vật mà ta nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại từ 600- 100 lần nên đậu tương có vai trò cải tạo đất tốt, trồng đậu tương sinh trưởng phát triển tốt để lại đất từ 30-60 kg N Quá trình hình thành nốt sần: Trong đất ln có nhiều loại vi sinh vật thường tập trung xung quanh rễ, mặt khác xung quanh rễ canh tác tạo điều kiện đất đai thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Cây họ đậu điều tiết chất gluxit, đường galacto… hấp dẫn loại vi sinh vật có vi sinh vật nốt sần vào rễ họ đậu Nốt sần phát triển đến giai đoạn định cố định đạm Bản thân nốt sần hút N vi sinh vật chất xúc tác, già vi sinh vật Nốt sần rễ đậu tương thường tập trung tầng đất từ 0-20cm, nốt sần dần sâu có khơng có Nốt sần đóng vai trị q trình cố định đạm Nốt sần dài 1cm, đường kính 5-6mm, hình thành có màu trắng sữa, tốt có màu hồng (màu globulin có cấu tạo gần giống hemoglobin máu có Fe) Bộ rễ phân bố sâu, rộng hay hẹp, số lượng nốt sần hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu kỹ thuật trồng Quá trình phát triển rễ phân làm thời kỳ Thời kỳ thứ nh t: Phát triển rễ đầu tiên, thời kỳ rễ rễ phụ phát triển mạnh, kéo dài sinh nhiều rễ con, thời kỳ thường kéo dài từ 30-40 ngày sau mọc Thời kỳ thứ hai: Lớp rễ phát triển chậm dần, rễ khơng nhú nữa, chí có số rễ cịn bị khơ Lúc gốc thân gần cổ rễ có rễ phụ nhỏ kéo dài phát triển gần thu hoạch Số lượng 30Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 40 rễ phụ ăn gần mặt đất Lớp rễ có nhiệm vụ cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho phát triển thân, làm Thân đậu tương thuộc thân thảo có hình trịn, thân có nhiều lơng nhỏ Thân cịn non có màu xanh tím, già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc thân cịn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc non có màu xanh hoa màu trắng cịn non thân có màu tím hoa màu tím đỏ Thân trung bình có 14-15 lóng, lóng phía thường ngắn, lóng phía thường dài(vì lóng phía phát triển từ ngày 35- 40 trở vào lúc sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tùy theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ 3-10cm Cây đậu tương vụ hè có lóng dài vụ xuân vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,3-1,0m Giống đậu tương dại cao từ 2- 3m Thực tế có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khỏe giống khơng có lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều hay ít, dài hay ngắn, dày hay thưa đặc điểm phân biệt giống với Căn vào sinh trưởng đặc điểm thân người ta chia làm loại: (1) Loại mọc thẳng: thân cứng, đường kính thân lớn, thân khơng cao lắm, đốt ngắn, nhiều tập trung thường giống hoa hữu hạn (2) Loại bị: thân phân cành nhỏ, mềm, phủ bề mặt đất thành đám dây, thân dài, đốt dài, nhỏ phân tán (3) Loại nửa bò: loại trung gian hai loại mọc thẳng mọc bò (4) Loại mọc leo: thân nhỏ dài, mọc bò đất hay leo lên giá thể khác Cây đậu tương có loại lá: Lá mầm (lá tứ diệp), mầm mọc có màu vàng hay xanh lục tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng ni mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo Lá nguyên (lá đơn), đơn xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau, đơn to xanh bóng biểu sinh trưởng tốt, đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét, đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Lá kép, kép có chét, có 4-5 chét Lá kép mọc so le, có màu xanh tươi, già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tùy theo giống Những giống nhỏ dài chịu hạn khỏe thường cho suất thấp, giống to chịu hạn thường cho suất cao Nếu hai kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tích to hay nhỏ chi phối nhiều đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các mằm chùm hoa giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính hoa có nhị nhụy, hoa gồm đài, cánh hoa có 10 nhị nhụy Màu sắc hoa thay đổi tuỳ theo giống thường có màu tím, tím nhạt trắng Đa phần giống có hoa màu tím tím nhạt Hoa phát sinh nách lá, đầu cành đầu thân Hoa nhiều tỷ lệ rụng cao khoảng 30% có lên tới 80% [1] Số biến động từ đến 20 chùm hoa đạt tới 400 Một chứa từ tới hạt, hầu hết giống thường từ đến hạt Hạt đậu tương có nhiều hình dạng khác nhau: Hình trịn, hình bầu dục, trịn dẹt,… Giống có màu vàng giá trị thương phẩm cao Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, tử điệp chiếm 90% vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt Hạt to nhỏ khác tuỳ theo giống, khối lượng nghìn Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hạt thay đổi từ 20-400g trung bình từ l00-200g Chu kì sống đậu tương chia giai đọan phát triển giai đoạn nảy mầm – con; giai đoạn sinh trưởng thân, lá; giai đoạn hoa; giai đoạn hình thành quả, hạt giai đoạn chín [1] Giai đoạn nảy mầm: Cây tính từ gieo hạt giống xuống đất, hạt hút ẩm trương lên, rễ mọc ra, thân vươn lên đội hai mầm lên khỏi mặt đất, mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân Trong giai đoạn chủ yếu sống dựa vào nguồn chất dinh dưỡng dự trữ hai mầm, đến hết chất dinh dưỡng mầm chuyển dần sang màu vàng rụng đồng thời lúc mà rễ phát triển đủ khả hút nước chất dinh dưỡng để nuôi Giai đoạn dài hay ngắn tùy thuộc điều kiện ngoại cảnh Nếu gieo vào vụ hè giai đoạn ngắn giai đoạn vụ đông Thông thường thời gian khoảng 15- 20 ngày sau gieo Thời kì thời kì định mật độ sức sinh trưởng đậu tương sau Kể từ 1- kép bắt đầu giai đoạn sinh trưởng thân kéo dài tới bắt đầu hoa Thời kỳ đầu giai đoạn sinh trưởng chậm, rễ lại phát triển nhanh chiều sâu lẫn chiều ngang, nốt sần hình thành phát triển, mở đầu cho hoạt động cố định đạm khí trời để cung cấp cho Đến thời kì chuẩn bị nụ, hoa tốc độ sinh trưởng tăng lên nhanh Chính lúc mấu chốt để tạo thân to, mập, đốt ngắn Giai đoạn dài hay ngắn tùy thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện ngoại cảnh, nói chung vào khoảng 20- 40 ngày Khác với số khác đậu tương hoa phận khác rễ, thân, tiếp tục sinh trưởng phát triển Giai đoạn Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ sinh trưởng dài hay ngắn tùy thuộc vào đặc tính giống chín sớm hay muộn Thời kì đậu tương mẫn cảm với điều kiện khí hậu thời tiết bất thuận mưa to, gió lớn, khơ, nóng, lúc số hoa có nhiều kết cuối số hoa thụ phấn kết ít, thơng thường 75% số hoa thường bị thui rụng Quả đậu tương hình thành vịng 7–8 ngày kể từ lúc hoa nở Trong điều kiện bình thường sau khoảng tuần lễ phát triển đầy đủ Lúc chùm non xuất chất dinh dưỡng vận chuyển nuôi hạt làm cho hạt nảy mầm Vào thời kì sinh trưởng chậm lại dần Các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm giai đoạn có tác động lớn đến tốc độ phát triển hạt Khi hạt phát triển đạt đến kích thước tối đa, khoang hạt kín, đủ mẩy ngừng sinh trưởng Khi hạt rắn dần đạt đến độ chín sinh lý vỏ hạt có màu sắc đặc trưng giống, cịn vỏ chuyển dần sang màu vàng, vàng tro, xám, chuyển dần sang úa vàng rụng dần Hàm lượng dầu hạt ổn định sớm vào thời kì hạt phát triển hàm lượng protein cịn chịu ảnh hưởng điều kiện dinh dưỡng cuối thời kì q trình chín 1.1.2 Giá trị kinh tế đậu tƣơng Đậu tương thực phẩm giàu giá trị dinh dưỡng Hạt đậu tương chứa: 8% nước, 5% chất vô cơ, 15-25% glucose, 15-20% chất béo, 35-45% chất đạm với đủ loại amino acid cần thiết (isoleucin, lysin, metionin, pheny lalanin, tryptophan, valin) nhiều nguyên tố, khoáng chất, Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, vitamin A, B1, B2, D, E, F, enzyme, sáp, nhựa, cellulose Giá trị kinh tế đậu tương nông nghiệp: Đậu tương nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ chăn nuôi Tồn đậu tương (thân, lá, hạt) có hàm lượng đạm cao sản phẩm phụ thân, tươi làm thức ăn gia súc tốt có thành phần dinh dưỡng cao N: 6,2%, P2O5: 0,7%, K2O: 2,4% Giá trị kinh tế đậu tương công nghiệp: Đậu tương nguyên liệu ngành công nghiệp khác chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt nóng, dầu bơi trơn ngành hàng không chủ yếu dùng để ép dầu Hiện giới đậu tương đứng đầu cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Đặc điểm dầu đậu tương khô chậm, số iod cao, ngưng tụ từ -150C đến 180C Từ dầu người ta chế hàng trăm sản phẩm cơng nghiệp khác làm nến, xà phịng ải tạo đất Đậu tương luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương sinh trưởng tốt để lại đất từ 30-60kg N Nếu bố trí đậu tương vào cấu trồng hợp lý có tác dụng tốt trồng sau, góp phần tăng suất hệ thống trồng giảm chi phí cho việc bón N Thân đậu tương dùng bón ruộng hay phân hữu tốt hàm lượng N thân chiếm 0,05 %, chiếm 0,19% [1], [12] 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới nƣớc Đậu tương trồng lấy hạt, có dầu quan trọng bậc giới, đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước ngơ Do khả thích ứng rộng nên trồng khắp năm châu lục, tập trung nhiều châu Mỹ 70%, tiếp đến châu Á Theo số liệu thống kê thức, Argentina niên vụ 2013- 2014 diện tích gieo trồng đạt 20,3 triệu ha, cao từ trước tới nay, giảm so với mức 20,8 triệu mà phủ dự báo trước đó, hạn hán ảnh hưởng tới Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 phút Biến tính 94 phút Gắn mồi 56 phút Kéo dài chuỗi 72 phút Hoàn tất kéo dài 72 10 phút Kết thúc phản ứng ∞ Sản phẩm PCR điệ 30 0,8% chụp ảnh 2.2.4 Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen : ới PCR = (%) Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 33 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 CẤU TRÚC pCB301-GmEXP1 VÀ TÁI SINH IN VITRO Chúng tiến hành pCB301-GmEXP1 vào DT84 qua nách mầm hạt chín phương pháp chuyển gen gián tiếp qua A tumefaciens, dựa phương pháp Olhoft cs (2001) (2011) [4], [23] Hạt đậu tương chín (hình 3.1A) loại bỏ hạt chất lượng đem khử trùng khí clo nồi thủy tinh đậy nắp kín đặt tủ hút Thời gian tiến hành khử trùng 14 A (hình 3.1B) B Hình 3.1 Giai đoạn chuẩn bị để cấy hạt môi trƣờng GM (A: Lựa chọn hạt; B: Khử trùng hạt khí clo) Hạt sau khử trùng cấy môi trường GM (hình 3.2A) phịng ni với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 sáng 8giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux Sau từ 5- Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 34 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ngày, kích thước mầm đạt khoảng 5cm mầm xanh (hình 3.2B) A B mơi trƣờng GM Hình 3.2 (A: Hạt đậu tương cấy mơi trường GM; B: Hạt đậu tương ngày tuổi) Toàn trình biến nạp thao tác box khử trùng Chúng tiến hành cắt lấy mầm, tách hai mầm, loại bỏ chồi chính, dùng mũi dao nhọn gây tổn thương vào nách mầm từ 5- lần Lá mầm gây tổn thương ngâm ngâm dịch huyền phù chứa vi khuẩn mang cấu trúc pCB301-GmEXP1 có OD600 đạt 0,6-1 thời gian 30 phút (hình 3.3B) Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc Q trình đồng ni cấy diễn tối, 250C thời gian ngày Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 35 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ch m A Hình 3.3 Mảnh mầm B biến nạp A- Mảnh mầm, B- Mảnh mầm ngâm dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn mang cấu trúc pCB301-GmEXP1 Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp lắc mơi trườ (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian 10 phút, sau thấm khô giấy thấm khử trùng Cắt bỏ chồi mảnh mầ mẫu lên mơi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxim Sau thời gian tuần, mẫu chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ , cụm chồi sống môi trường chọn lọc chuyển sang mơi trường phát triển chồi (SEM) có bổ s 3.4) Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 36 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ A B C D Hình 3.4 Hình ảnh đa chồi kéo dài chồi đậu tƣơng DT84 A, B: Cảm ứng tạo đa chồi SIM bổ sung BAP 2mg/l ; (bổ sung GA3 C, D: Ch 0,5 mg/l + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l); Khi chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5cm chuyển sang mơi trường rễ (RM) có bổ sung 250 mg/l cefotaxim để tạo hoàn chỉnh nh 3.5) A B C Hình 3.5 Kết tái sinh biến nạp đậu tƣơng DT84 A, B: (bổ sung IBA 0,1 mg/l) tron Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 37 ; C: Ra http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Thí nghiệm chứng lặp lại lần với lô thí nghiệm lơ đối ển gen cấy mơi trường - tái sinh có bổ ển gen - cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Kết trình bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết biến nạp cấu trúc pCB301-GmEXP1 A.tumefaciens Lô thí Số mẫu Số mẫu tạo Số chồi nghiệm biến nạp đa chồi kéo dài rễ ĐC1 100 45 30 22 12 ĐC0 100 0 0 150 47 21 11 170 52 27 210 75 33 12 530 174 81 32 Tổng (1, 2, 3) bảng 3.1 cho thấy 174 mẫu tạo chồi Số chồi Số biến nạp 530 mẫu, thu 81 chồi kéo dài môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, 32 chồi rễ, ồng lô 100 22 12 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 38 , 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trong thí nghiệm này, chúng tơi chọn phương pháp chuyển gen gián tiếp Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua thiết bị thao tác định mà không cần nhờ sinh vật trung gian Tuy nhiên, tất phương pháp chuyển gen trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, xác tốn mà khả tái sinh sau chuyển gen lại thấp, thí ng A.tumefaciens [2] Trong nghiên cứu chuyển gen gián tiếp thực vật, chủng vi khuẩn sử dụng phổ biến A tumefaciens A rhizogens hai lồi có khả xâm nhiễm qua vết thương hầu hết loài thực vật hai mầm số lồi thực vật mầm Kết gây khối u hay hình thành lơng rễ theo chế tự nhiên Trong vi khuẩn A tumefaciens sử dụng rộng rãi Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens, tốn mang lại hiệu quả, thuận lợi cho việc phân tích chuyển gen không gây tổn thương tế bào [2] 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÂY ĐẬU TƢƠNG Ở THẾ HỆ T0 3.2) 3.2 Số 530 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 39 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Saghai Maroof cs (1984) [25] K gel agarose 0,8% 3.6)  3.6 gen (1, 2- m - - 3) 3.6 2, 1, 3, 5, GmEXP1 SoyExp1F_NcoI/ SoyExp1R_NotI 3.7 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 40 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ M  1,51 kb  0,79 kb 3.7 GmEXP1 t 3.7 EXP1 GmEXP1 (T0 (T03) 3.3 3.3 GmEXP1 84 PCR 530 0,38% 0,38% u tương A tumefaciens Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 41 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tương Wiliam [3] A tumefaciens (2011) 84 0,24% [5] HA1 1,23% [4]; tr (2014) 2,24% 0,27% [10] 0,38% thu [12] in vitro gen A tumefaciens chu qua A.tumefaciens in vitro Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 42 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Cấu trúc pCB301-GmEXP1 biến nạp thành công vào mô nách mầm hạt chín gống đậu tương DT84 phương pháp chuyển gen gián tiếp qua chủng vi khuẩn A tumefaciens sinh in vitro, chọn lọc tạo ba dòng 1.2 đậu tương chuyển gen mẫu biến nạp, tổng số 530 0,57% 1.3 Phân tích có mặt gen chuyển dịng chuyển gen hệ T0 0,38% ĐỀ NGHỊ ếp tục , phân tích biểu (T0 03) hệ Gm EXP1 ế hệ tiế ịu hạn Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen, NXB Đại học Huế Trần Thị Cúc Hoà (2007), "Tạo chọn giống đậu tương biến đổi gen kháng sâu Việt Nam", Tuyển tập Kết nghiên cứu Khoa học Công nghệ 2006 - 2010, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 214 - 220 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2011), “Nghiên cứu khả tái sinh biến nạp gen qua nách mầm hai giống đậu tương (Glycine max L.) ĐT12 DT84 Agrobacterium”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(38): 1305-1310 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập,tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học , Thái Nguyên Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh invitro đậu tương (Glycine max L Merrili) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học cơng nghệ Đại học Thái Nguyên, 52(4): 82-88 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội Trần Thị Phương Liên (2010), Protein tính chịu chống chịu thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên cơng nghệ, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ phân lập từ số giống đậu tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2013, Quyển 1, Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội, 192 196 (2015), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên 10 quan đến phát triển rễ đậu tương (Glycine max 11 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội 12 Phạm Văn Thiều, (2008), Cây đậu Tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng anh 13 Gelvin S.B., (2010), “Plant proteins involved in Agrobacterium mediated genetic transformation”, Annu Rev Phytopathol 48: 45-68 14 Gelvin S.B., (2003), “Agrobacterium and plant transformation: The biology behind the “gene-jockeying” tool”, Microbiol Mol Biol, 67(1): 1637 15 Guo W., Zhao J., Li X., Qin L., Yan X.,Liao H., (2011), “A soybean ßexpansin gene GmEXPB2 intrinsically involved in root system architecture responses to abiotic stresses” Plant J 66(3): 541-552 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 16 Lee D.K., Ahn J.H., Song S.K., Choi Y.D., Lee J.S (2003), “Expression of an Expansin Gene Is Correlated with Root Elongation in Soybean”, Plant Physiology 131: 985 - 997 17 Hong H P., Zhang H., Olhoft P., Hill S., Wiley H., Toren E., Hillebrand H., Jones T., Cheng M (2007), “Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max (L) Merr)”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 43, pp 558 - 568 18 Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y., (2008), “Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants” Cell Res 18(10): 1047–1060 19 Li Y., Darley C P., Ongaro V., Freming A., Schipper O., Baldauf S L., McQueen,Mason S J.,(2002).“ Plant expansins are a comlex multigene family with an ancient evolutionary origin” J Plant Physiol 128 (3): 854-864 20 Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau (2014), “Cloning and designing vector carrying GmEXP1 gene isolated from local soybean cultivar Sonla, Vietnam”, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB) (3): 191 - 194 21 Margine M.Paz, Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K.B., Wang K., (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica 136: 167-169 22 McQueen-Mason S., Durachko D M., Cosgrove D J (1992), "Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants", Plant Cell Online, 4(11), pp 1425 - 1433 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 23.Olhoft, P.M., D.A Somers, (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonarynode cells”, Plant Cell Rep 20: 706-711 24 Paz M.M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Anjan K., Banerjee and Wang K., (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica 136: 167-179 25 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014-8018 26 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai, La Cao Thang, (2008), “Transformation efficiencies of the soybean variety PC19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omonrice 16: 1-8 27 Wiebke-Strohm B., Pasquali G., Margis-Pinheiro M., Bencke M., BückerNeto M., Becker-Ritt A.B., Martinelli A.H.S., Polacco J.C., Stolf R., Marcelino F.C., (2012), “Ubiquitous urease affects soybean susceptibility to fungi”, Plant Mol Biol 79: 75-87 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... dựng nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein expansin liên quan đến kéo dài rễ vào giống đậu tương DT84? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo dịng chuyển gen chứa gen mã hóa protein expansin. .. chồi kéo dài rễ ĐC1 10 0 45 30 22 12 ĐC0 10 0 0 0 15 0 47 21 11 170 52 27 210 75 33 12 530 17 4 81 32 Tổng (1, 2, 3) bảng 3 .1 cho thấy 17 4 mẫu tạo chồi Số chồi Số biến nạp 530 mẫu, thu 81 chồi kéo dài. .. kéo dài Khi lai chỗ với mặt cắt ngang rễ để xác định biểu gen GmEXP1 tế bào Gen GmEXP1 đóng vai trị quan trọng kéo dài rễ đậu tương đặc biệt q trình kéo dài rễ rễ thứ cấp Khi có kết nghiên cứu gen