BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC -VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ðẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC SỬ DỤNG GEN PMI NHƯ LÀ GEN CHỌN LỌC TRONG CHUYỂN GEN Ở LÚA TAIPEI 309 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: Ths Trần Thị Xuân Mai Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Trường ðại Học Cần Thơ SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Công Khang Lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 31 Cần Thơ, Năm 2009 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ biết ơn sâu sắc ñến cô Trần Thị Xuân Mai ñã tận tình hướng dẫn, truyền thụ tri thức khoa học bổ ích, tạo ñiều kiện thuận lợi giúp làm tốt luận văn tốt nghiệp Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên cô Nguyễn Thị Pha phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Thực Vật- Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học ñã nhiệt tình giúp ñở suốt thời gian thực ñề tài Xin cảm ơn tất Thầy, Cô ñã tận tình dạy cung cấp kiến thức quý báu cho em năm học trường Xin cảm ơn thầy cố vấn học tập Trần Thanh Mến bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K31 ñã ñộng viên giúp ñỡ em suốt trình học tập thực ñề tài Nguyễn Công Khang Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 MỤC LỤC Nội Dung Trang PHẦN I: ðẶT VẤN ðỀ PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .4 I Lịch sử tình hình chuyển gen .4 Trên giới .4 Trong nước II Lược khảo phương pháp chuyển gen Khái niệm chuyển gen Mục ñích chuyển gen 10 Ưu ñiểm vấn ñề tồn .11 Các phương pháp chuyển gen 13 a) Chuyển gen trực tiếp .13 * DEAE-dextran 13 * Kỹ thuật calcium phosphate 14 * Chuyển gen qua liposome……………… ………… 15 * Phương pháp vi tiêm 17 * Chuyển gen trực tiếp vào protoplast 18 * Chuyển gen kỹ thuật xung ñiện………… 18 * Chuyển gen sung bắng gen………… 19 b) Chuyển gen gián tiếp Agrobacterium .21 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 * Ti-plasmid A tumefaciens 24 * Sự gây khối u A tumefaciens 24 * Cơ chế chuyển T-DNA 35 III Phương pháp nuôi cấy mô 27 IV Phương pháp chọn lọc mô sau chuyển gen gen pmi .29 Giới thiệu PMI .29 2.Ứng dụng phương pháp chọn lọc mannose 30 a) Trên lúa 30 b) Lúa Miến 31 c) Cam 32 d) Táo 32 Sự chuyển hóa mannose thể 33 V Giống lúa Taipei 309 37 VI Thử Nghiệm Chlorophenol-red (CPR) 37 PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 I.Phương Tiện 38 Giống lúa 38 Dòng Vi Khuấn 38 Plasmid .38 Môi trường 38 Thiết bị dụng cụ 40 II Phương pháp nghiên cứu 41 1.Quy trình chuyển gen 41 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 a) Phương pháp xử lý mô sẹo .42 b) Các bước chuyển gen .42 c) Chọn lọc mô ñã chuyển gen 43 d) Tạo chồi 43 Bố trí thí nghiệm 44 a) Chuyển gen pmi A tumefaciens 44 b) Ảnh hưởng Mannose lên trình tạo chồi 44 d) Thử nghiệm Chlorophenol ñỏ (CPR) 45 PHẦN IV KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 46 I Phương pháp chọn lọc Mannose 46 II Ảnh hưởng Mannose lên trình tạo chồi 49 Ảnh hưởng Mannose môi trường tiền tạo chồi 49 Ảnh hưởng Mannose môi trường tạo chồi 51 IV Phân Tích Chlorophenol-red (CPR) 54 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 I Kết Luận .56 Hiệu chuyển gen Agrobacterium tumefaciens 56 Ảnh hưởng ñường mannose lên trình tạo chồi 56 Phân tích Chlorophenol-Red (CPR) 56 II Kiến nghị .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 PHỤ LỤC Thành phần môi trường sử dụng trình tạo mô sẹo môi trường chọn lọc Thành phần môi trường sử dụng trình tái sinh Thành phần môi trường phương pháp thử nghiệm Chlorophenol ñỏ (CPR) Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 DANH SÁCH HÌNH Hình: Trang 2.1 Sự kết hợp DEAE-dextran DNA…………………………….13 2.2 Phức hợp DNA-calcium phosphate………………………………….14 2.3 Sơ ñồ hoạt ñộng vector liposome……………………………… 16 2.4 Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân trứng thụ tinh………………17 2.5 Sơ ñồ plasmid chứa DNA ngoại lai………………………………… 19 ñi qua lỗ tạm thời màng bào chất 2.6 Sơ ñồ nguyên lý hoạt ñộng súng bắn gen……………………… 20 2.7 Tạo thực vật chuyển gen bằng……………………………………… 23 phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 2.8 Sơ ñồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………….24 2.9 Khối u A.tumefaciens gây ra……………………………… 25 2.10 Sự tương tác Agrobacterium………………………………… 27 với tế bào thực vật chế chuyển T-DNA 2.11 Cấu tạo hóa học ñường Mannose Mannose-6-phosphate……….34 2.12 Chu trình chuyển hóa ñường mannose…………………………… 36 3.1 Bảng ñồ plasmid pCAMBIA 1380………………………………… 39 3.2 Quy trình chuyển gen lúa bằng………………………………….41 vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.1 Mô chuyển gen thành công không thành công……………………46 môi trường chọn lọc (RO5) 4.2 Mô không chuyển gen bị ức chế môi trường RO5………………48 4.3 Mô chuyển gen tăng sinh ñược môi trường RO5……………… 48 4.4 Sự phát triển mô chuyển gen…………………………………….50 môi trường tiền tạo chồi Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 4.5 Mô sẹo hình thành chồi sau môi trường RO7………………… 52 4.6 Mô sẹo hình thành chồi môi trường RO7-mannose………… 52 4.7 Kết thử nghiệm Chlorophenol-red (CPR)……………………….54 DANH SÁCH BẢNG Bảng: Trang Hiệu chuyển gen giống lúa Taipei 309…………………… 47 sử dụng protocol Khả tạo chồi hai môi trường RO6…………………………49 RO6-mannose sau tuần Khả tạo chồi hai môi trường RO8…………………………51 RO8-mannose sau tuần Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 CHÚ THÍCH NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT A rhizogenes : Agrobacterium rhizogenes A tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens AS : Acetosyringone ABA : abscisic acid Bar : gen kháng thuốc diệt cỏ Bt : Bacillus thuringiensis CPR : Chlorophenol Red Cry : Gen kiểm soát sâu ñục thân, sâu DEAE-dextran : Diethylaminoethyl-dextran DOPE : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine EU : European Union GM : Genetically modified GMA : Genetically modified animal GMO : Genetically modified organism GMP : Genetically modified plant LB : Left border NAA : α-napthalen acetic acid PEG : polyethylene glycol PGE : polyethylene glycol PGI : phosphogluco isomerase PMI : phosphomannose isomerase RB : Right border Sgfp : Gen phát huỳnh quang T-DNA : ðoạn DNA Ti-plasmid Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Ti : Tumor inducing 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid TÓM LƯỢC Một phương pháp ứng dụng gen chọn lọc phosphomannoseisomerase (pmi) gen chọn lọc thay cho việc sử dụng gen kháng kháng sinh chọn lọc lúa chuyển gen ñã ñược sử dụng chuyển gen lúa Japonica dòng Taipei 309 Hiệu chuyển gen pmi vào mô lúa ngày tuổi 0,75% Mặc dù hiệu thấp việc sử dụng mô ngày tuổi nguồn vật liệu chuyển gen làm rút ngắn thời gian sản xuất lúa chuyển gen lên nhiều so với việc sử dụng mô lúa tuần tuổi nhiều nghiên cứu trước ñây thường sử dụng Sự hòa nhập biểu gen pmi vào gen lúa ñã chuyển gen ñược nhận diện qua phương pháp phân tích sinh hóa Chlorophenol-red Hệ thống chọn lọc mannose ñã mở hướng ñi việc phát triển chuyển gen ñáp ứng ñược yêu cầu cho người tiêu dùng ñồng thời góp phần giữ gìn môi trường phát triển bền vững Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Ảnh hưởng Mannose môi trường tạo chồi (RO7) Ảnh hưởng Mannose lên tạo chồi thể rõ mô ñược nuôi cấy môi trường RO7 Trên môi trường RO7 sau tuần ñã có dấu hiệu việc phát triển chồi rõ rệt (hình 4.5 hình 4.6) Kết bảng cho thấy khả tạo chồi mô sẹo môi trường RO7 không chứa Mannose RO7-Mannose có khác biệt ñáng kể Ở môi trường RO7 tỉ lệ tạo chồi ñạt 60%, cao gần lần so với môi trương RO7-Mannose (15,4%) Còn số mô bị chết hoàn toàn môi trường RO7-Mannose 23,1%, môi trường RO7 mô chết Bảng 3: Khả tạo chồi hai môi trường RO7 RO7-mannose sau tuần Môi Trường RO7 RO7Mannose Số mô Phần trăm Phần chết hoàn mô tạo trăm mô toàn chồi (%) chết (%) 60 15,4 23,1 Tổng số Số mô tạo mô chồi 15 13 51 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Hình 4.5: Mô sẹo hình thành chồi môi trường RO7 Hình 4.6: Mô sẹo hình thành chồi môi trường RO7-Mannose 52 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Quá trình hình thành chồi mô lúa không qua lọc ñường mannose phát triển tốt Bổ sung thêm 1.5-2% Mannose môi trường tạo chồi dẫn ñến ức chế phát triển biệt hóa mô mô chết vài tuần sau ñó Kết cho thấy trình tạo chồi nhạy cảm với ñường Mannose trình hình thành mô sẹo (mô sẹo phát triển môi trường có nồng ñộ mannose lên ñến 4%) Quá trình ức chế tạo chồi mô chuyển gen môi trường có chứa Mannose nguồn lượng tác ñộng gián tiếp hexokinase Pego ctv (1999) ñã chứng minh hexokinase có liên quan ñến ức chế trình nẩy chồi hạt Arabidopsis Quá trình phosphoryl hóa ñường Mannose hexokinase tính hiệu cho ức chế gen hao hụt lượng suốt trình nảy chồi hạt Một số nghiên cứu trình tạo chồi chuyển gen với hệ thống chọn lọc ñường Mannose cho kết tương tự Theo kết nghiên cứu Zhengquan ctv (2003) giống lúa Japonica Ishikari-shiroge(I-S) cho thấy khả tạo chồi giống lúa môi trường có chứa Mannose 0%, khả tạo chồi môi trường Mannose lại ñạt hiệu ñến 95% Byung ctv (2006) nghiên cứu ảnh hưởng Mannose lên trình tạo chồi cải bắp chuyển gen, cho thấy môi trường có 20 g l-1 sucrose 0-3 g l-1 mannose trình tạo chồi phát triển bình thường Tuy nhiên, nồng ñộ g l-1 trình tạo chồi hoàn toàn không xảy Ngoài việc không sử dụng mannose nhân tố chọn lọc trình tạo chồi bắt gặp chuyển gen Arabidopsis thaliana (Rebecca Brian, 2001), táo (Juliana ctv, 2006), ñu ñủ (Yun ctv, 2005) 53 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 IV Phân tích Chlorophenol-Red (CPR) Mặc dù mô sẹo ñã qua lọc chuyển sang môi trường tạo chồi ñã ñược khuyến cáo không nên sử dụng mannose môi trường tạo chồi ñể chọn lọc Tuy nhiên tái sinh ñược tiếp tục nhận diện ñã chuyển gen hay không dựa vào phương pháp phân tích Chlorophenol-Red (CPR), phương pháp ñược ñánh giá có hiệu cao việc nhận biết chuyển gen (Lucca ctv, 2001; Wright ctv, 2001) Sau ñược tái sinh môi trường RO8 trước ñược ñem trồng nhà kính, rễ tái sinh ñược phân tích phương pháp khảo sát (CPR) Trong dung dịch chứa chất thị CPR, pH dung dịch 6.0 lớn dung dịch có màu ñỏ ñậm Nhưng dung dịch thử nghiệm bị acid hóa hoạt ñộng chuyển hóa mannose tế bào sống, làm cho môi trường có màu vàng Kết khảo sát (Hình 4.9) cho thấy rễ tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo ñã phát triển tốt môi trường chọn lọc RO5 ñều ñổi sang màu vàng, giống biến ñổi màu mẫu ñối chứng dương (rễ chuyển gen PMI mẫu) Ngược lại, rễ không ñược chuyển gen không xảy tượng acid hóa, màu dung dịch không ñổi Hình 4.7: Kết thử nghiệm Chlorophenol-red (CPR) chuyển gen (A1-B12), ñối chứng dương (C1-C2) ñối chứng âm (C3-C4) 54 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Thử nghiệm CPR ñược xem phương pháp ñơn giản nhanh chóng ñể kiểm tra biểu gen pmi chuyển gen Ở nghiên cứu khác chuyển gen sử dụng gen chọn lọc pmi, phương pháp thử nghiệm CPR thường ñược sử dụng phổ biến Paola ctv (2000)cũng áp dụng phương pháp kiểm tra nghiên cứu chuyển gen lúa Taipei 309 sử dụng mannose nhân tố chọn lọc, sử dụng vật liệu rễ, kết luận rễ sau tiền xử lý với mannose trước ủ ngày với dung dịch thử nghiệm, ñã cho thấy ñây phận hiệu việc dùng làm vật liệu cho phân tích CPR lúa Lá ñược sử dụng ñể làm vật liệu kiểm tra chuyển gen chọn lọc pmi khác lúa mì bắp (Wright ctv, 2001) Ngoài ra, vật liệu dùng ñể thử nghiệm rễ mà sử dụng phận non Zhensheng ctv (2005) ứng dụng phương pháp chuyển gen lúa miến, vật liệu lúa non ñược cắt thành mảnh có ñộ dài khoảng 0,5cm, ủ môi trường thử nghiệm ñiều kiện tối từ ñến ngày, ñược lấy từ chuyển gen ñược tái sinh môi trường vô trùng Boscariol ctv (2003) chuyển gen cam sử dụng có trọng lượng khoảng 300mg ñể thử nghiệm, thời gian ủ từ ñến ngày, cho thấy phương pháp ñạt hiệu cao Nghiên cứu chuyển gen mía ñường Mukesk ctv (2006) sử dụng vật liệu mẫu non lại ñọt mía tái sinh, trọng lượng khoảng 500mg ñể kiểm tra Ngoài dùng ñể kiểm tra ñược ứng dụng nghiên cứu khác táo (Juliana ctv, 2006) 55 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ *****+☺ ☺+***** I Kết Luận Từ kết thí nghiệm, rút ñược kết luận sau: Hiệu chuyển gen Agrobacterium tumefaciens Một qui trình chuyển gen lúa Taipei 309 qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñã ñược xây dựng Qui trình giúp rút ngắn ñược thời gian, tối thiểu tuần, ngắn so với quy trình chuyển gen lúa thường ñược sử dụng trước ñây (Hiei ctv, 1994) Ảnh hưởng ñường mannose lên trình tạo chồi Sự diện ñường mannose môi trường tạo chồi nồng 1.52% ñã ức chế khả biệt hóa hình thành chồi mô Phân tích Chlorophenol-Red (CPR) ðây phương pháp thử nghiệm sinh hóa nhanh chóng cho ñô xác cao việc kiểm tra diện gen PMI chuyển gen 56 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 II Kiến Nghị Mặc dù thành công việc rút ngắn thời gian chuyển gen, qui trình chuyển gen cho hiệu chuyển gen không cao Cần tiến qui trình chuyển gen số ñiểm sau: - Nghiên cứu ñộ tuổi mô thích hợp dùng làm nguyên liệu chuyển gen - Tìm hiểu thêm số nhân tố ảnh hưởng ñến hiệu chuyển gen như: Xử lý mô sẹo, nồng ñộ vi khuẩn chủng vào mô, thời gian chủng nhiễm, ñiều kiện ñồng nuôi cấy… Do thời gian ngắn nên thực phương pháp sinh học phân tử việc kiểm tra việc biểu gen chuyển lúa chuyển gen Vì cần thực thêm bước phân tích chuyển gen phương pháp PCR, lai Southern ñể xác ñịnh cách chắn 57 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Cán Bộ Hướng Dẫn Sinh Viên Thực Hiện ThS TRẦN THỊ XUÂN MAI NGUYỄN CÔNG KHANG 58 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 TÀI LIỆU THAM KHẢO • Ayres N.M and Park W.D, 1994 Genetic transformation of rice Crit Rev Plant Sci 13, pp 219-239 • Bùi Chí Bửu, 1995 Nhân giống trồng nuôi cấy mô Sở khoa học công nghệ môi trường An Giang • Byung-Whan Min, Yi Nam Cho, Min-Jung Song, Tae-Kyung Noh, Bong-Kyu Kim, Won-Ki Chae, Young-Soo Park, Yang-Do Choi, Chee-Hark Harn, 2006 Successful genetic transformation of Chinese cabbage using phosphomannose isomerase as a selection marker Plant Cell Rep (2007) 26, pp 337–344 • Chenna Reddy Aswath, Sung Youn Mo, Doo Hwan Kim, S Won Park, 2005 Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase Plant Cell Rep (2006) 25, pp 92– 99 • Christou P, 1997 Rice transformation: bombardment Plant Mol Biol 35, pp 1315 • Dale P.J, 1992 Spread of engineered genes to wild relatives Plant Physiol 100, pp 13-15 • Daniell H, 1999 Environment friendly approaches to genetic engineering In Vitro Cell Dev Biol Plant 35, pp 361-368 • Ding Zai Song, Zhao Ming, Jing Yu Xiang, Li Liang Bi, Kuang Ting-Yun, 2006 Efficient Agrobacterium-mediated transformation of rice by phosphomannose isomerase/mannose selection Plant molecular biology 24, pp 295-303 • Ferguson J.D., Street B.E and David S.B., 1958 The inhibition of excised root growth by galactose and mannose and its reversal by dextrose and xylose Ann Bot 22, pp 523-538 • Hiei Y, Ohta S, Komari T Kumashiro T, 1994 Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA Plant J 6: 271-282 59 Luận Văn Tốt Nghiệp • Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., 1998 Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet Mol breed 4, pp 111-117 • Joersbo M., Okkels F.T., Brunstedt J., 1999 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet Physiol Plant 105, pp 109-115 • Juliana Degenhardt , Annika Poppe, Jurith Montag, Iris Szankowski, 2006 The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selection system to recover transgenic apple plants Plant Cell Rep (2006) 25, pp 1149–1156 • Komari T., Hiei T., Saito Y., Kumashiro T., 1996 Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers Plant J 10, pp 165-174 • Lê Lý Thùy Trâm, 2005 Giáo trình nuôi cấy mô, Phòng thí nghiệm sinh học phân tử ðại Học Huế • M.M O’Kennedy, J T Burger, F C Botha, 2003 Pearl millet transformation system using the positive selectable marker gene phosphomannose isomerase Plant Cell Rep (2004) 22, pp 684–690 • Malca I., Endo R.M and Long M.R., 1967 Mechanism of glucose counteraction of inhibition of root elongation by galactose, mannose, glucosamine Phytopathology 57, pp 272-278 • Malik V.S and Saroha M.K, 1999 Marker gene controversy in transgenic plants J Plant Biochem Biotechnol 8, pp 1-13 • Miles J.S and Guest J.R, 1984 Nucleotide sequence and transcriptional star point of the phosphomannose isomerase gene (mana) of Escherichia coli Gene 32, pp 41-48 • Mukesh Jain, Kudithipudi Chengalrayan, Ahmed Abouzid, Maria Gallo, 2006 Propecting the utility of a PMI/mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane (Saccharum spp hybrid) plants Plan Cell Rep (2007) 26, pp 581-590 60 Luận Văn Tốt Nghiệp • Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Nap J.P, Bijvoet J and Stiekema W.J, 1992 Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants Transgenic Res 1, pp 239-249 • Negrotto D., Jolley M., Beer S., Hansen G., 2000 The use of phosphomannoseisomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation Plant Cell Rep 19, pp 798-803 • Nguyễn Bảo Toàn, 2005 Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa Nông Nghiệp, ðại Học Cần Thơ • Nguyễn ðức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002 Công nghệ tế bào NXB ðại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh • Nguyễn ðức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Anh, Cao Cường, 2002 Công nghệ gen NXB ðại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh • Nguyễn Văn Uyển, 1996 Những phương pháp Công Nghệ Sinh Học thực vật NXB Nông Nghiệp • Nguyễn Xuân Thắng, ðào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn ðồng, 2004 Hóa Sinh Học NXB Y Học • Paola Lucca*, Xudong Ye1, Ingo Potrykus, 2000 Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent Molecular breeding 7, pp 43-49 • Pego V P , Weisbeek P J.,Smeekens S C M , 1999 Mannose inhibits Arabidopsis germination via a hexokinase-mediated step Plant physiol 199, pp 1017-1023 • Philippe Hervé Toshiaki Kayano, 2006 Japonica Rice Variaties (Oryza sativa, Nipponbare, and Others) Methods in Molecular Biology 343, pp 213-222 • Potrykus I Spangenberg G, 1995 Gene transfer to plants Springer-Verlag, Berlin • R L Boscariol, W A B Almeida, M T V C Derbyshire, F A A Mour¼o Filho, B M J Mendes, 2003 The use of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants (Citrus sinensis L Osbeck) Plant Cell Rep (2003) 22, pp 122–128 61 Luận Văn Tốt Nghiệp • Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 Rebecca Todd, Brian W Tague*, 2001 Phosphomannose Isomerase: A versatile selectable marker for Arabidopsis thaliana Germ-line transformation Plant Molecular Biology 19, pp 307-319 • Robert H Herman, M.D., 1971 Mannose metabolism l The American Journal of Clinical Nutrition 24, pp 488-498 • Tran Thi Cuc Hoa and Bui Ba Bong, 2002 Agrobacterium-mediated transformation of rice embryogenic suspension cells using phosphomannose isomerease gene, pmi, as a selectable marker Omonrice 10, pp 1-5 • Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, 2006 Công nghệ chuyển gen ñộng vật thực vật NXB ðại Học Huế • Trịnh ðình ðạt, 2006 Công nghệ di truyền NXB Giáo Dục • WHO, 1993 Health aspects of marker genes in genetically modified plants Report of a WHO workshop of the Food Safety Unit • Yoder J.I and Goldsbrough A.P, 1994 Transformation systems for generating marker-free transgenic plants Bio/technology 12, 263-267 • Yun J Zhu, Ricelle Agbayani, Heather McCafferty, Henrik H Albert, Paul H Moore, 2005 Effective selection of transgenic papaya plants with the PMI/Man selection system Plant Cell Rep (2005) 24, pp 426-432 • Zhengquan He, Yaping Fu, Huamin Si, Guocheng Hu, Shihong Zhang, Yonghong Yu , Zongxiu Sun, 2003 Phosphomannose–Isomerase (pmi) gene as a seletable marker for ricetransforma tion via Agrobacterium.Plant Science 166(2004),pp.17–22 • Zhengquan He, Zhen Zhen Duan, Wei Liang, Faju Chen, Wei Yao, Hongwei Liang, Chaoyin Yue, Zongxiu Sun, Fan Chen, Jianwu Dai, 2006 Mannose selection system used for cucumber transformation Plant Cell Pep (2006) 25, pp 953-958 • Zhensheng Gao, Xueju Xie, Yan Ling, Subbarat Muthukrishnan, George H Liang, 2005 Agrobacterium tumefaciens-mediated sorghum transformation using a mannose selection system Plant Biotechnology Journal (2005) 3, pp 591-599 62 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 305283 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường sử dụng trình tạo mô sẹo môi trường chọn lọc Môi trường Hóa Chất Hóa Chất RO0 RO1 RO2 Recover R03 R04 RO5 Muối N6 Sigma (g/L) 4 4 4 Vitamin B5 (mg/L) 112 112 112 112 112 112 112 L-prolin (mg/L) 2878 - - 2878 2878 2878 2878 CEH (mg/L) 300 300 300 300 300 300 300 Sucrose (g/L) 30 68.5 30 30 30 15 - D-mannose (g/L) - - - - 30 30 40 D-glucose (g/L) - 36 10 - - - - 2,4-D (mg/L) - 3 3 Phytagel (g/L) 2,5 - 4 - - - Agarose Type I (g/L) - - - - 7 Carbenicilline ( mg/L) - - - 400 400 400 400 Acetosyringone (µM) - 100 100 - - - - ðộ pH 5.8 5.2 5.2 5.8 5.8 5.8 5.8 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 305283 Phụ lục 2: Thành phần môi trường sử dụng trình tái sinh Môi trường Hóa chất Hóa Chất RO6a RO6b RO7a RO7b RO8 4 - - - - - 4,4 4,4 4,4 Vitamin B5 (mg/L) 112 112 - - - L-prolin (mg/L) 500 500 - - - CEH (mg/L) 300 300 2000 2000 - Sucrose (g/L) 30 30 30 30 30 Sorbitol (g/L) - - 30 30 D-mannose (g/L) - 20 - 15 - Phytagel (g/L) 6 6 Carbenicilline ( mg/L) 200 200 200 200 - NAA (mg/L) 1 1 - ABA (mg/L) 5 - - - Kinetin (mg/L) 2 2 - ðộ pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 Muối N6 Sigma (g/L) Muối MS có Vitamin Duchefa(g/L) Ghi chú: phụ lục dấu (-) không sử dụng hóa chất môi trường Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 305283 Phụ lục 3: Thành phần môi trường phương pháp thử nghiệm Chlorophenol ñỏ (CPR) Môi trường thử nghiệm MS1: Muối MS có chứa Vitamin (Murashige Skoog, 1962); 2% Mannose; pH 5.8 Môi trường thử nghiệm MS2: Muối MS có chứa Vitamin; 2% Mannose; 0,5% Sucrose; 2mg/ml Chlorophenol ñỏ; pH 6.0 [...]... dụng gen PMI như là gen chọn lọc trong chuyển gen ở lúa Từ ñó phát triển rộng rãi phương pháp tạo ra các thực vật chuyển gen “sạch” không chứa gen kháng kháng sinh nhằm ñáp ứng ñúng mối quan tâm của xã hội − Sử dụng một qui trình mới trong chuyển gen ở giống lúa Japonica nhằm rút ngắn thời gian chuyển gen − Khảo sát ảnh hưởng của ñường mannose lên quá trình tái sinh chồi của mô lúa chuyển gen 3 Luận... acetyltransferase, và gen này ñược sử dụng một cách rộng rãi ở chuyển gen lúa (Ayres và Park, 1994) Hoạt ñộng của gen bar có tác dụng kháng lại L-phosphinotricin, glyphosinate, biolaphos và ñã thành công trong chọn lọc các mô thực vật ñã ñược chuyển gen (Hiei và ctv, 1997) Mặc dù chuyển gen trên lúa thông qua việc chọn lọc bằng gen kháng kháng sinh và gen kháng thuốc diệt cỏ ñã ñạt nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn... ra cây chuyển gen ñòi hỏi cần phải có các gen marker chọn lọc nhằm cho phép nhận diện sự tái sinh của các tế bào chuyển gen và tránh sự biểu hiện của các mô không ñược chuyển gen nhưng vẫn có thể phát triển ñược trong quá trình chọn lọc Quá trình chọn lọc các mô chuyển gen trước ñây thường ñược thực hiện bằng việc ñưa vào các gen kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc diệt cỏ, cho phép các mô chuyển gen có... ñược chuyển gen sẽ sống ñược và sau ñó có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy có hygromycin, trong khi mô không ñược chuyển gen sẽ bị chết bởi ñộc chất trong môi trường Phương pháp chọn lọc này cho phép ta có thể phân biệt một cách rõ ràng giữa mô ñược chuyển gen và mô không ñược chuyển gen (Ayres và Park, 1994) Còn ở sự chọn lọc dựa vào thuốc diệt cỏ, người ta thường sử dụng gen bar, ñây là gen. .. Spangenberg, 1995) Các thế hệ lúa chuyển gen thường ñược tạo ra bằng phương pháp súng bắn gen và gần ñây nhất là phương pháp chuyển gen liên quan ñến vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Hiei và ctv, 1994) Ở cả hai trường hợp, sau khi gen ñã ñược chuyển, mô sẹo của lúa ñã ñược chuyển gen sẽ ñược chọn lọc bằng một loại kháng sinh là hygromycin, và sự kháng lại kháng sinh này sẽ ñược ñiều hòa bởi gen. .. chọn lọc (Joersbo và ctv, 1999; Hoa và Bong, 2002) ðây là phương pháp nhằm tạo ra cây lúa chuyển gen sạch mà không cần sử dụng các loại kháng sinh hay thuốc diệt cỏ Trong nghiên cứu này, chúng tôi 2 Luận Văn Tốt Nghiệp Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831 áp dụng phương pháp chuyển gen pmi vào lúa japonica dòng Taipei 309 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục ñích của việc nghiên cứu − Ứng dụng gen. .. ñược sử dụng như một gen chọn lọc và ñường mannose là một nhân tố chọn lọc vì tế bào thực vật không thể chuyển hóa ñược ñường Mannose Nhân tố chọn lọc mới này gần ñây ñã ñược báo cáo cho việc chọn lọc thành công trên cây mía ñường (Joersbo và ctv, 1998) và trên bắp (Negrotto và ctv, 2000) sau khi chuyển gen gián tiếp bằng Agrobacterium Quá trình chọn lọc dựa trên sự quan sát rằng mannose ñược chuyển. .. sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học ñã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào ñó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir Gen chuyển ñược xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ ñược chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen. .. các thế hệ cây chuyển gen sau cho phép sự phát sinh của các cây chuyển gen mà không cần marker (Komari và ctv, 1996) Một hệ thống chọn lọc mới ñược phát triển cho phép quá trình chọn lọc các mô ñã ñược chuyển gen bằng sự trợ giúp của ñường, ñó là loại ñường nào mà không thể ñược chuyển hóa và sử dụng bởi những tế bào thực vật không ñược chuyển gen Gen phosphomannose isomerase (PMI) có nguồn gốc từ Escherichia... mặt trong các tế bào con Một số genome virus có ñặc tính này, ví dụ như virus herpes Một vài ñoạn nhiễm sắc thể thường ñược tìm thấy ở các tế bào khối u, là các nhiễm sắc thể tồn tại trong một thời gian ngắn, mang các yếu tố tái bản và truyền cho các tế bào con 2 Mục ñích của chuyển gen Mục ñích của chuyển gen là thêm một thông tin di truyền ngoại lai vào genome, cũng như ñể ức chế một gen nội sinh Trong ... ứng dụng gen chọn lọc phosphomannoseisomerase (pmi) gen chọn lọc thay cho việc sử dụng gen kháng kháng sinh chọn lọc lúa chuyển gen ñã ñược sử dụng chuyển gen lúa Japonica dòng Taipei 309 Hiệu chuyển. .. 3052831 áp dụng phương pháp chuyển gen pmi vào lúa japonica dòng Taipei 309 vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục ñích việc nghiên cứu − Ứng dụng gen PMI gen chọn lọc chuyển gen lúa Từ ñó phát... chuyển gen pmi vào mô lúa ngày tuổi 0,75% Mặc dù hiệu thấp việc sử dụng mô ngày tuổi nguồn vật liệu chuyển gen làm rút ngắn thời gian sản xuất lúa chuyển gen lên nhiều so với việc sử dụng mô lúa