Xác định sinh trưởng vi sinh vật Xác định sinh trưởng vi sinh vật Bởi: Nguyễn Lân Dũng XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT Có nhiều cách thông qua việc xác định biến đổi số lượng chất lượng vi sinh vật để hiểu sinh trưởng vi sinh vật, biết tốc độ sinh trưởng thời gian hệ Dưới giới thiệu phương pháp thường dùng ưu, khuyết điểm phương pháp Không có phương pháp tốt nhất, lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào trường hợp cụ thể Xác định số lượng tế bào Phương pháp đơn giản để xác định số lượng tế bào đếm trực tiếp kính hiển vi Dùng phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại quan sát thấy kích cỡ hình dáng tế bào Thường dùng phòng đếm Petroff-Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh Dùng phòng đếm hồng cầu đếm tế bào nhân nguyên thủy tế bào nhân thật Với tế bào nhân nguyên thủy cần nhuộm màu dùng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát Phòng đếm có cấu trúc để có độ sâu định lại có chia thành ô nhỏ (hình 14.5) Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau tiến hành đếm số lượng kính hiển vi Khuyết điểm phương pháp không xác định với mẫu có số lượng vi khuẩn nhỏ, độ xác không cao không phân biệt tế bào sống tế bào chết 1/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Hình 14.5: Phòng đếm Petroff-Hauser: (a)- Mặt nhìn nghiêng phòng đếm- Phòng đếm chứa dịch huyền phù vi khuẩn khoảng không gian bên kính; (b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với ô nhỏ; (c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiến hành đếm số lượng vi khuẩn ô nhỏ Lấy số lượng bình quân để tính mật độ vi khuẩn mẫu vật Trong phạm vi 1mm có 225 ô nhỏ , số lượng vi khuẩn 1mm (số vi khuẩn/mm) x 25; phòng đếm có chiều dầy 0,02mm nồng độ vi khuẩn phòng đếm là: (số vi khuẩn)/m x 25 (tổng số ô nhỏ) x 50= số vi khuẩn/mm Vì cm =1 mm x 10 giả thử số lượng vi khuẩn bình quân ô nhỏ 28 cm có nồng độ vi khuẩn 28 x 25 x 50 x10 = 3,5 x 10 vi khuẩn Nhân với độ pha loãng ban đầu (nếu có) biết nồng độ vi khuẩn mẫu kiểm tra Với động vật nguyên sinh, vi tảo nấm men dùng máy đếm điện tử loại máy Coulter Counter để xác định số lượng Nguyên lý hai bên lỗ nhỏ có điện 2/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật cực nối điện Khi tế bào dịch huyền phù qua lỗ nhỏ tế bào qua điện trở lại tăng lên (hoặc tính dẫn điện giảm xuống) sinh tín hiệu điện, máy đếm tự động ghi số Kết xác định loại máy xác, ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng hồng cầu bạch cầu, phương pháp không thích hợp xác định số lượng vi khuẩn dễ bị can thiệp bời hạt nhỏ vật chất dạng sợi mẫu vật Cả hai phương pháp nói không phân biệt tế bào sống tế bào chết Để xác định số lượng tế bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch pha loãng lên bề mặt môi trường thạch đĩa Sau nuôi cấy vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc Ví dụ độ pha loãng x 10-6 đếm 150 khuẩn lạc có nghĩa mật độ vi khuẩn mẫu 1,5 x 108 Dùng dụng cụ đếm khuẩn lạc thêm thuận tiện Phương pháp cho biết số lượng tế bào sống vi sinh vật Phương pháp đơn giản, nhạy cảm thích hợp ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng vi sinh vật sống phân tích mẫu thực phẩm, nước, đất Tuy nhiên kết chịu ảnh hưởng số nhân tố Nếu vi khuẩn dính thành khối không tách rời kết thu thấp thực tế., khuẩn lạc không phát triển từ tế bào riêng rẽ Vì kết thu từ phương pháp coi số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU-colony forming unit) CFU không hoàn toàn phù hợp với số tế bào sống mẫu vật Trong trình sử dụng phương pháp nên sử dụng độ pha loãng cho số khuẩn lạc xuất đĩa nằm phạm vi khoảng 30-300 mà Đương nhiên môi trường dinh dưỡng đáp ứng chung cho loại vi sinh vật, kết thu thấp thực tế Khi trộn thạch với dịch pha loãng thạch đủ nguội để không làm chết vi khuẩn hay làm thương tổn với số loại mẫn cảm với nhiệt độ Việc cấy cấy dịch pha loãng bề mặt dàn que gạt thủy tinh thường cho kết cao số lượng vi sinh vật so với phương pháp trộn với môi trường thạch chưa đông 3/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Hình 14.6: Tách khuẩn lạc phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật thông qua đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch đĩa (a) (b)- Cách ria cấy để tách khuẩn lạc riêng rẽ (không dùng để đếm số lượng) (c)(d)Cách pha loảng trộn với môi trường thạch chưa đông (e)(f)- Cách dàn dịch pha loãng que gạt mặt thạch (cho số lượng khuẩn lạc nhiều hơn).Theo sách K.P.Talaro,2005 Để xác định số lượng vi sinh vật nuôi cấy giấy lọc lọc dịch pha loãng mẫu vật Phương pháp gọi phương pháp màng lọc (membrane filter) Dùng thiết bị lọc đặc biệt đặt vừa giấy lọc hình tròn có lỗ nhỏ kích thước vi khuẩn vi sinh vật khác Sau lọc đặt giấy lọc lên môi trường thạch thích hợp thấm ướt màng lọc dịch môi trường thích hợp để nuôi cấy 24 Đếm số khuẩn lạc mọc giấy lọc để tính mật độ vi khuẩn sống có mặt mẫu vật (hình 14.7) 4/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Hình 14.7: Phương pháp lọc màng để xác định số lượng vi sinh vật Phương pháp thích hợp để sử dụng phân tích vi sinh vật nước Có thể dùng môi trường khác thích hợp với nhóm vi sinh vật khác (hình 14.8) Hình 14.8: Các loại khuẩn lạc mọc màng lọc.Theo sách Prescott,Harley Klein (2005) (a)- Tổng số vi khuẩn mọc môi trường tiêu chuẩn, Dùng thị màu để nhuộm đỏ khuẩn lạc cho dễ điếm; (b)- Dùng môi trường thích hợp để kiểm tra nhóm vi khuẩn coliform có nguồn gốc từ phân (khuẩn lạc bắt màu xanh); (c)- Dùng môi trường thạch m-Endo để xác định vi khuẩn E.coli Coliform kháckhuẩn lạc có màu lục; (d)- Nắm sợi nấm men mọc môi trường Thạch - Mạch nha 5/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Phương pháp màng lọc dùng để đếm trực tiếp vi khuẩn Dịch mẫu vật lọc qua màng polycarbonate màu đen Vi khuẩn màng lọc nhuộm màu huỳnh quang thuốc nhuộm acridine da cam DAPI (diamidino-2-phenylindole) Quan sát kính hiển vi huỳnh quang thấy tế bào vi sinh vật lên màu da cam hay màu lục đen Hiện có kit thương mại cho phép phân biệt tế bào sống tế bào chết kiểm tra Xác định khối lượng tế bào Sự sinh trưởng vi sinh vật không biểu số lượng tế bào mà tăng trưởng tổng khối lượng tế bào Phương pháp trực tiếp xác định trọng lượng khô tế bào Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào Sau rửa tế bào làm khô lò sấy cân trọng lượng khô Phương pháp thích hợp để xác định sinh trưởng nấm Phương pháp tốn thời gian không thật mẫn cảm Đối với vi khuẩn trọng lượng cá thể nhỏ, chí phải ly tâm tới vài trăm ml đủ số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml dịch nuôi cấy vẩn đục, nồng độ tăng độ đục tăng theo làm cản trở ánh sáng qua dịch nuôi Có thể đo độ tán xạ ánh sáng quang phổ kế (spectrophotometer) Ở mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, nồng độ tế bào giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính (hình 14.9) Chỉ cần nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng độ đo dùng phương pháp đo độ đục quang phổ kế để xác định sinh trưởng vi sinh vật Nếu hàm lượng số vật chất tế bào giống tổng lượng chất tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật Chẳng hạn, thu tế bào thể tích định dịch nuôi cấy, rửa đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitrogen, thấy tăng quần thể vi sinh vật phù hợp với tăng tổng lượng protein (hay N) Cũng tương tự vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyll dùng đẻ đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP biết sinh khối vi sinh vật sống 6/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Hình 14.9: Đo số lượng vi sinh vật phương pháp đo độ đục Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng xác định sinh khối vi sinh vật Khi số lượng tế bào tăng lên dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều quang phổ kế đo mức độ tăng lên trị số hấp thụ ánh sáng Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía trị số hấp thụ ánh sáng, phía mức độ thấu quang Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên mức độ thấu quang hạ xuống 7/7 ... vậy, vi c xác định tổng lượng chlorophyll dùng đẻ đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP biết sinh khối vi sinh vật sống 6/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Hình 14.9: Đo số lượng vi sinh vật phương... có mặt mẫu vật (hình 14.7) 4/7 Xác định sinh trưởng vi sinh vật Hình 14.7: Phương pháp lọc màng để xác định số lượng vi sinh vật Phương pháp thích hợp để sử dụng phân tích vi sinh vật nước Có... vi huỳnh quang thấy tế bào vi sinh vật lên màu da cam hay màu lục đen Hiện có kit thương mại cho phép phân biệt tế bào sống tế bào chết kiểm tra Xác định khối lượng tế bào Sự sinh trưởng vi sinh