B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC DC H NI DNG MINH TN THIT LP CHT CHUN TETRODOTOXIN T C NểC (TETRAODONTIDAE) LUN VN THC S DC HC H NI, 2015 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC DC H NI DNG MINH TN THIT LP CHT CHUN TETRODOTOXIN T C NểC (TETRAODONTIDAE) LUN VN THC S DC HC CHUYấN NGNH : KIM NGHIM THUC V C CHT M S : 60720410 Ngi hng dn: PGS TS Trn Vit Hựng H NI, 2015 LI CM N Vi lũng kớnh trng v bit n sõu sc, tụi xin c by t li cm n chõn thnh ti PGS TS Trn Vit Hựng, ngi thy, ngi anh ó tn tu trc tip hng dn, ch bo tụi sut quỏ trỡnh thc hin v hon thnh lun vn; Ban Giỏm c Vin Kim nghim thuc Trung ng, Ban Giỏm hiu, Phũng Qun lý sau i hc v cỏc thy cụ giỏo trng i hc Dc H Ni ó to mi iu kin thun li, giỳp , hng dn tụi sut quỏ trỡnh hc cng nh thc hin ti; Cỏc bn ng nghip Khoa Nghiờn cu phỏt trin, Vin Kim nghim thuc Trung ng ó giỳp , san s cụng vic, úng gúp ý kin giỳp tụi hon thnh lun ny; Cui cựng, tụi xin cỏm n gia ỡnh, bn bố ó luụn bờn tụi, ng viờn, khớch l tụi giỳp tụi hc tp, lm vic v hon thnh lun ny Xin chõn thnh cm n! H Ni, ngy 31 thỏng nm 2015 Dng Minh Tõn MC LC LI CM N MC LC DANH MC CC CH VIT TT V Kí HIU DANH MC CC BNG DANH MC CC HèNH T VN CHNG 1.1 TNG QUAN TETRODOTOXIN 1.1.1 Tớnh cht hoỏ lý 1.1.2 c tớnh ca TTX 1.1.3 Liờn quan cu trỳc, tỏc dng 1.2 C NểC 1.3 MT S NGHIấN CU IU CH TETRODOTOXIN 10 1.3.1 Th gii 10 1.3.2 Vit Nam 15 1.4 MT S PHNG PHP NH TNH NH LNG TTX 16 1.4.1 Th gii 16 1.4.2 Vit Nam 19 1.5 CHT CHUN V THIT LP CHT CHUN 19 1.5.1 Cht chun i chiu húa hc 19 1.5.2 Phng phỏp thit lp cht chun 19 1.5.3 ỏnh giỏ liờn phũng thớ nghim 22 1.5.4 Cht chun tetrodotoxin 23 CHNG I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 25 2.1 I TNG NGHIấN CU 25 2.2 NGUYấN VT LIU, HO CHT, DUNG MễI 25 2.3 THIT B, DNG C TH NGHIM 25 2.4 PHNG PHP NGHIấN CU 27 2.4.1 Thu thp mu nghiờn cu 27 2.4.2 Chit xut, tinh ch 30 2.4.3 nh tớnh, nh lng TTX bng phng phỏp sc ký lng ph 32 2.4.4 Xõy dng b d liu nhn dng cht 35 2.4.5 Thit lp cht chun 35 2.4.6 Phng phỏp x lý s liu 38 CHNG KT QU NGHIấN CU 40 3.1 XC NH NHANH C T CA PH TNG MT S LOI C NểC 40 3.2 QUY TRèNH CHIT XUT TTX THễ 41 3.3 TINH CH TTX BNG SC Kí LNG IU CH 43 3.4 PHN TCH TTX SAU KHI TINH CH THEO QUY TRèNH 45 3.5 XY DNG QUY TRèNH NH TNH, NH LNG TTX BNG SC Kí LNG KHI PH 49 3.5.1 Kho sỏt quy trỡnh nh tớnh, nh lng TTX bng sc ký lng ph 49 3.5.2 Thm nh quy trỡnh nh tớnh, nh lng TTX bng sc ký lng ph 51 3.6 XY DNG TIấU CHUN C S CA NGUYấN LIU TETRODOTOXIN 55 3.7 NGHIấN CU THIT LP CHT CHUN TETRODOTOXIN 56 3.7.1 Nghiờn cu n nh ca tetrodotoxin mt s dung mụi 56 3.7.2 Nghiờn cu quy trỡnh úng ng chun, 100 àg cht/l ml, s dng dung mụi thớch hp 57 3.7.3 Kim tra ỏnh giỏ cht lng ng chun 58 CHNG 4.1 BN LUN 62 QUY TRèNH CHIT XUT, TINH CH TTX 62 4.1.1 Quy trỡnh chit xut 62 4.1.2 Quy trỡnh tinh ch 63 4.2 PHNG PHP NH TNH, NH LNG TTX 63 4.2.1 Phỏt hin nhanh c tớnh bng phng phỏp sinh húa chut 63 4.2.2 nh tớnh tetrodotoxin bng sc lý lng hiu nng cao (HPLC) 63 4.2.3 nh tớnh nh lng TTX bng phng phỏp ph 64 4.3 B D LIU NHN DNG TTX 65 4.4 THIT LP L CHUN TTX 0,1 MG/L 65 4.5 í NGHA, HIU QU CA TI 66 KT LUN V KIN NGH 68 KT LUN 68 KIN NGH 68 TI LIU THAM KHO PH LC BO CO SA CHA LUN VN THC S DANH MC CC CH VIT TT V Kí HIU ATCC COSY cs DEPT VTN ELISA ESI FLD FT ICR GC-MS HMBC HPLC HSQC LC MS LC MS/MS LD100 LD50 LOD LOQ MLD MU NMR NOSEY PSP ROSEY SPE SRM TLC TTX TTXs UV VGSC VKNTTW VSV : : : : : : Bo tng ging chun vi sinh vt M (American Type Culture Collection) Correlation Spectroscopy Cng s Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer ng vt th nghim Xột nghim hp th dch liờn kt vi enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) : K thut phun sng hoỏ in t (Electric spray ionic) : Detector hunh quang (Fluorescence Detector) : Ph cng hng t gia tc ion chuyn dng Fourier (Fourier transform ion cyclotron resonance) : Sc ký khớ ph (Gas chromatography - Mass spectrum) : Heteronuclear Multiple Bond Correlation : Sc ký lng hiu nng cao (High performance liquid chromatography) : Heteronuclear Single Quantum Coherence : Sc ký lng ph (Liquid Chromatography Mass spectrum) : Sc ký lng ph ghộp ni ph (LIquid Chromatography tandem Mass spectrum) : Liu ti thiu ca cht phi nhim, cựng mt thi im, gõy cỏi cht cho ton b mt nhúm ng vt th nghim (Lethal Dose 100) : Liu ca cht phi nhim, cựng mt thi im, gõy cỏi cht cho 50% (mt na) ca mt nhúm ng vt th nghim (Lethal Dose 50) : Gii hn phỏt hin (Limited of detection) : Gii hn nh lng (Limited of quantification) : Liu nh nht gõy cỏi cht cỏ bit ng vt thớ nghim thớ nghim mt nhúm ng vt (minimum lethal dose) : n v chut (mouse unit) : Ph cng hng t ht nhõn (Nuclear Magnetic Resonance) : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy : Paralytic Shellfish Poisoning (c t gõy lit c ng vt nhuyn th) : Rotating frame Overhauser Effect Spectroscopy : Chit pha rn (solid phase extraction) : Ch kim soỏt chui phn ng (Selected reaction monitoring) : Thin layer chromatography (sc ký bn mng) : Tetrodotoxin : Tetrodotoxin v cỏc dn cht : T ngoi (Ultra violet) : in th mng kờnh Na+ (Voltage-Gated Sodium Channel) : Vin Kim nghim thuc Trung ng : Vi sinh vt DANH MC CC BNG Bng Mt s hóng cung cp chun TTX 23 Bng Bng chia mc c ca cỏ núc theo phng phỏp sinh hoỏ chut 29 Bng Mc c ca ph tng mt s loi cỏ núc 40 Bng Lng TTX thu c v tinh khit t c 43 Bng 3 Kt qu nh lng TTX mu sau tinh ch 45 Bng D liu ph NMR ca TTX tinh khit thu c 45 Bng Kho sỏt mt s iu kin sc ký 49 Bng Cỏch pha dóy cỏc dung dch chun 52 Bng Kt qu kho sỏt thớch hp h thng 53 Bng Kt qu kho sỏt tuyn tớnh ca phng phỏp 53 Bng Kt qu kho sỏt lp li 54 Bng 10 Kt qu kho sỏt thu hi 55 Bng 11 Túm tt ch tiờu cht lng TCCS nguyờn liu TTX 56 Bng 12 Hm lng TTX mt s dung mụi theo thi gian 57 Bng 13 Kt quỏ ỏnh giỏ ng nht lụ 59 Bng 14 Cỏc thụng s ca h sc ký 59 Bng 15 Kt qu ỏnh giỏ liờn phũng 60 Bng 16 Kt qu ỏnh giỏ theo ANOVA 60 Bng 17 Tp hp kt qu ca hai PTN 61 DANH MC CC HèNH Hỡnh 1 C ch gõy c thn kinh ca TTX Hỡnh Tetrodotoxin chn kờnh chuyn Natri lm tờ lit thn kinh Hỡnh C ch epimer hoỏ OH-C4 ca TTX Hỡnh Túm tt tng hp theo Kishi 10 Hỡnh S khỏc s ngt mch nhõn Cychlorhexane gia cỏc quy trỡnh ca Kishi, Isobe v DuBois 11 Hỡnh Túm tt quy trỡnh sinh tng hp TTX 12 Hỡnh Bỏn tng hp TTX t D-Glucose 13 Hỡnh Nguyờn lý phng phỏp ELISA 17 Hỡnh 10 Bung úng chun (Glove-Box) v t bo qun cht chun ti VKNTTW 22 Hỡnh 11 TTX tinh khit cung cp bi mt s hóng: (a) Enzo M; (b) Asent Scientific UK; (c) Sigma-Aldrich M; (d) Tocric Biosciences M 24 Hỡnh Mt s thit b s dng nghiờn cu 26 Hỡnh 2 Thit bi xay ngõm chit, Vin Kim nghim thuc Trung ng 27 Hỡnh Hai loi (1) Cỏ núc vng (Lagocephalus lunaris) v 28 Hỡnh Ph tng cỏ núc c m ly em i x lý 28 Hỡnh Quy trỡnh chit xut TTX 41 Hỡnh Quy trỡnh s tinh ch 42 Hỡnh 3 Quy trỡnh tinh ch TTX thụ bng sc ký lng iu ch 44 Hỡnh Ph NMR ca hp cht TTX: (a) 1H-NMR, (b) 13C-NMR, (c) COSY v (d) HMBC 46 Hỡnh Gii cu trỳc ca TTX bng ph NMR 47 Hỡnh 7.Ph phõn gii cao (ESI Orbitrap MS) ca hp cht TTX tinh ch, 48 Hỡnh SK phõn tớch TTX theo cỏc chng trỡnh sc ký A, B, C v D 50 Hỡnh SK phõn tớch TTX theo chng trỡnh sc ký E 51 Hỡnh 10 Sc ký dung dch chun TTX nng 2,5àg/mL (a), dung dch th (b), dung dch trng (c) v mnh ph SRM m/z=320 -> 162 c trng ca TTX nh lng (d) 52 Hỡnh 11 th biu mi tng quan nng TTX v din tớch pic 53 Hỡnh 12 L chun tetrodotoxin 0,1 mg ml dung dch m citrate 58 T VN Vit Nam l mt nc nm khu vc nhit i giú mựa, cú vựng ti nguyờn bin di v tim nng khai thỏc bin rt ln Trong nhng nm gn õy, vic nghiờn cu tim nng bin ang tr thnh xu hng trờn th gii v Vit Nam Da trờn li th v ti nguyờn bin, nhng nm qua, ng v Nh nc ta ó ch trng, bin phỏp quan trng nhm qun lý, bo v, khai thỏc bn vng bin, hi o, ú yờu cu cỏc cp, cỏc ngnh phi phỏt trin mnh m khoa hc cụng ngh, lm cho khoa hc cụng ngh thc s l ng lc quan trng nht phỏt trin lc lng sn xut hin i, kinh t tri thc, nõng cao nng sut cht lng hiu qu v sc cnh tranh ca nn kinh t, Cỏ núc c bit n l sinh vt cha c t thn kinh cc c, gõy ng c cp tớnh cho ngi v gia sỳc c t cỏ Núc cú thnh phn ch yu l tetrodotoxin (TTX), thuc nhúm c t thn kinh, l mt nhng cht c mnh nht tng bit n Chỳng ang c cỏc nh khoa hc trờn th gii, c bit l Nhn Bn, Hn Quc v Trung Quc, quan tõm nghiờn cu ng dng y dc cha mt s bnh him nghốo nh bnh tim mch, gim au ung th, h tr iu tr cai nghin, Vit Nam, mt s t chc v cỏ nhõn ó s dng TTX v c t t cỏ núc cỏc bi thuc cha cai nghin (nh Bahudo l sn phm kt hp TTX v mt s dc liu Lờ Quang Hun v cng s nghiờn cu lm thuc h tr gim au, cai nghin, ), nhiờn, hin cha cú thụng tin y v c tớnh cng nh hiu qu ú B Y t cha ng ý cp phộp kho sỏt c cỏc loi cỏ núc cú cha c t thn kinh v TTX phc v nghiờn cu nh hng ng dng y hc, ỏnh giỏ c cht lng v an ton cỏc sn phm cú cha c t t cỏ núc thỡ cn thit phi cú cht i chiu húa hc TTX tinh khit lm cht chun Vỡ vy, vic chit xut, phõn lp v tinh ch TTX t cỏ Núc lm cht chun phc v kim nghim tr nờn ht sc cn thit, c bit, vic mua chun TTX t nc ngoi l rt khú khn v chi phớ rt cao (khong 200$/1mg TTX) c Ph NMR COSY d Ph NMR HMBC Hỡnh 1: Ph NMR ca Tetrodotoxin PL34 Gii ph NMR H Hb,c, dng pic (J = Hz) Cb,d HMBC (H C) 154,18 5,50 d (8,9) 5,39 d (9,5) 72,63 2,35 d (9,6) 2,25 d (9,5) 38,19 6, 8a 4,25 br s 4,15 br s 71,35 7, 8a, 10 68,94 4,09 t (2,1) 3,98 br s 77,17 8a, 10 4,30 d (2,1) 4,19 br s 70,28 57,21 3,96 s 3,85 s 68,37 4a, 8a, 10 108,31 4,01 d (12,4)/4,06 d 3,92e/3,94e 63,02 5, (12,4) a H ca TTX o 3% CD3COOD/D2O [1], bo D2O+CF3COOD, c500 MHz, d125 MHz, etớn hiu b chng lp C 4a 8a 10 11 a C11H17N3O8 M = 319 1.1.2 Ph phõn gii cao FT-ICR Ph phõn gii cao FT-ICR ca dung dch ch phm 10ppm methanol phi cho mnh ph chớnh xỏc v tng ng vi cụng thc phõn t ca Tetrodotoxin C11H17N3O8 Tờn KNV : Dng Minh Tõn Ngy phõn tớch : Thit b : Mỏy ph phõn gii cao HR FT ICR MS (Varian 900 MS) PL35 Kt qu: Ph FT-ICR-MS ca dung dch ch phm cho mnh ph chớnh xỏc v tng ng vi cụng thc phõn t ca Tetrodotoxin C11H17N3O8 Hỡnh 2: Ph FT-ICR-MS ca Tetrodotoxin 1.1.3 LC/MS: Thi gian lu ca pic chớnh v ph MS thu c t dung dch th phi ging vi thi gian lu ca pic chớnh v ph MS thu c t dung dch chun Tờn KNV : Dng Minh Tõn Ngy phõn tớch : Thit b : Mỏy sc ký lng ph tandem MS (Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra) Kt qu: Thi gian lu ca pic chớnh v ph MS thu c t dung dch th ging vi thi gian lu ca pic chớnh v ph MS thu c t dung dch chun tR th = tR chun = 6,81 phỳt PL36 Sk mu trng Sk mu chun TTX 2,5ppm sk mu th Hỡnh 3: Sc ký ca chun v th PL37 1.2 Mt lng lm khụ (TGA): Tin hnh theo ph lc 389, USP 36 Tờn KNV Ngy phõn tớch Thit b iu kin tin hnh: Nhit 25 200 oC : Dng Minh Tõn : 9/2014 : Mỏy TGA-DSC 1, Mettler Toledo Tc gia nhit oC/phỳt Tc dũng khớ ni t 40 ml/phỳt Kt qu: Lng cõn mu ban u (mg) Lng cõn mu sau lm khụ (mg) (%) Mt lng Trung bỡnh (%) Th 2,0970 2,0944 0,1239 Th 2,0569 2,0545 0,1167 0,1178 % Th 2,0399 2,0376 0,1128 Hỡnh 4: Ph TGA ca TTX 1.3 nh lng (LC/MS/MS): Yờu cu: Hm lng ca nguyờn liu phi khụng nh hn 95,0 % C11H17N3O8, tớnh theo cht ó lm khụ * Dung mụi, húa cht - Methanol HPLC - Acid acetic - Amoni acetat PL38 * iu kin sc ký - Thit b: mỏy sc ký lng ph Thermo Scientific TSQ quantum Ultra - Ct: Alltech Apollo C8; 5àm; 250 x 4,6mm - Pha ng: Hn hp dung dch m acetat v methanol (30 : 70) (dung dch m acetat: Dung dch cha 15 mM amoni acetat v 15mM acid acetic) - Tc dũng: 500 àl/phỳt - Th tớch tiờm: 10 àl - iu kin ph + Ngun: ESI+ + Khớ: SG: 20, AG: 10 + Th ion húa: 3200V + Nhit húa hi: 200oC + Nhit mao qun: 360oC + SRM: 320 162 vi mc nng lng CE = 32V * Chun b dung dch: - Dung dch chun: Pha dung dch tetrodotoxin chun cú nng chớnh xỏc khong 2,5 àg/ml pha ng - Dung dch th: Cõn chớnh xỏc khong 2,50 mg ch phm vo bỡnh nh mc 10 ml, thờm khong ml pha ng, lc k 10 phỳt, thờm pha ng va n vch, lc u Hỳt 1,0 ml dung dch thu c cho vo bỡnh nh mc 100 ml, pha loóng va vi pha ng, lc u Lc qua mng lc 0,45 àm - Dung dch trng: dung mụi pha mu * Tin hnh Tin hnh tiờm ln lt cỏc dung dch trng, dung dch chun v dung dch th vo h thng sc ký lng ph (LC/MS/MS), ghi li din tớch pớc * Tớnh kt qu Hm lng tetrodotoxin ch phm c tớnh theo cụng thc: PL39 X(%) = St 10 ì 100 ì CC ì ì 100 Sc mt ì 1000 Trong ú: St: Din tớch pic thu c trờn sc ký ca dung dch th Sc: Din tớch pic thu c trờn sc ký ca dung dch chun Cc: Nng C12H17N3O8 dung dch chun (àg/ml) mt: Lng mu th ó cõn pha dung dch th (mg) Kt qu: Tờn KNV Ngy phõn tớch Thit b Ct s dng Pha ng Dung dch m acetat: iu kin ph Tc dũng Th tớch tiờm Cht chun gc: Tetrodotoxin Chun b dung dch chun Chun b dung dch th Thi gian lu ca pic chớnh (tR) Mụ t Lng cõn mu (mg) S ln tiờm mu Trung bỡnh (%) RSD HL (%) tớnh theo cht ó lm khụ Trung bỡnh (%) RSD : Dng Minh Tõn : 2014 : Mỏy sc ký lng ph tandem MS (Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra) : Alltech Apollo C8 (250 x 4,6 mm; 5àm) : m acetat methanol (30:70) Dung dch amoni acetat 15 mM v acid acetic15mM - Ngun ESI vi ch ion dng, - Khớ Sheath Gas (SG): 20 - Khớ b tr Auxiliary Gas (AG): 10 - Th ion húa: 3200V - Nhit húa hi: 200oC - Nhit mao qun: 360oC - SRM: m/z = 320 162 vi mc nng lng va chm Collision Energy = 32V: : 500 ml/phỳt : 10 àl Ngun gc: Sigma Aldrich S lụ: 038K1804 Hm lng: 1mg tetrodotoxin v mg m citrate pH 4,8/l, hm lng: 99,0 % : 2,5 àg/ml pha ng : 2,5 àg/ml pha ng : tR th = tR chun = 6,81 phỳt Chun 482991 482647 483106 482295 483667 482010 482786 0.14 Th Th 2,48 2,49 Din tớch pic 466937 473893 97,51 PL40 98,57 98,29 0,70 Th 2,51 478755 98,79 Mụ t Lng cõn mu (mg) S ln tiờm mu Trung bỡnh (%) RSD HL (%) tớnh theo cht ó lm khụ Trung bỡnh (%) RSD Chun 483670 482019 482752 482814 0,17 Th Th 2,51 2,47 Din tớch pic 475231 469925 98,05 98,53 98,25 0,25 Th 2,48 470168 98,18 Hm lng trung bỡnh tớnh trờn mu th: 98,27 % (ó lm khụ), RSD = 0,47% II ểNG GểI: 2.1 Dng úng gúi: - úng 0,1 mg /ng dng dung dch hũa tan m citrat pH 4,8 - Cỏch tin hnh: Hũa tan nguyờn liu tetrodotoxin m citrate pH 4,8 t nng 0,1 mg/ml bng cỏch: Cõn chớnh xỏc mg TTX vo bỡnh nh mc 100 ml, thờm dung mụi hũa tan v pha loóng va ti vch x c tớnh theo cụng thc sau: = 0.100/P ú: P l hm lng (%) ca C11H17N3O8 nguyờn liu tetrodotoxin - Dựng burret chia vch úng dung dch vo l thy tinh mu nõu dung tớch 4ml, lng úng chớnh xỏc 1,0 ml/ng 2.2 iu kin úng gúi: - ỏnh s th t tng ng - iu kin mụi trng: nhit 20 oC, m tng i 48 % 2.3 Ngy úng gúi: - 01 ngy: 25/12/2014 2.4 S lng úng gúi: - S lng nguyờn liu: 10,17 mg - S lng úng c: 100 ng - ỏnh giỏ ng nht lụ: 10 ng - ỏnh giỏ liờn phũng th nghim: 12 ng PL41 2.5 ỏnh giỏ ng nht lụ quỏ trỡnh úng gúi Yờu cu: Lụ sn xut c coi l ng nht giỏ tr RSD ca kt qu hm lng gia cỏc ng c kim tra 0,5 % iu kin úng gúi n nh Tin hnh: - Ly ngu nhiờn ớt nht 10 ng kim tra ng nht quỏ trỡnh úng gúi ch tiờu hm lng - p dng phng phỏp nh lng Tiờu chun ng chun TTX tin hnh xỏc nh hm lng Kt qu: S th 01 t ng HL (%) so vi 99,67 nhón Trung bỡnh (%) RSD (%) 15 26 34 47 55 68 77 88 99 99,73 99,86 100,12 99,91 99,68 100,09 99,97 99,66 100,03 99,87 0,18 Kt lun: RSD = 0,18% < 0,5 % Lụ bỏn TP ng nht v hm lng III KIM TRA THNH PHM CHT CHUN: 3.1 ỏnh giỏ liờn phũng thớ nghim: - p dng phng phỏp nh lng Tiờu chun cht lng ng chun TTX - Mi PTN nhn c cht chun gc v 06 ng chun bỏn thnh phm Bng: Cỏc thụng s ca h sc ký Yờu cu Cỏc thụng s Thit b Ct sc ký Thi gian lu ca pic chớnh Tandem MS (Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra) Alltech Apollo C8 (250 x 4,6 mm; 5àm) PTN (Trung tõm ỏnh giỏ Tng ng sinh hc) Tandem MS (Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra) Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; 5àm) 6,8 phỳt 6,5 phỳt PTN (Khoa Vt lý o lng) PL42 Bng Kt qu xỏc nh hm lng Yờu cu PTN (HL %) PTN (HL %) 99,67 99,73 99,86 100,12 99,91 99,68 100,09 99,97 99,66 100,03 99,87 0,18 % 99,72 100,08 100,01 99,89 100,04 99,76 Hm lng mu th phi t 99,5 % n 100,5% so lng ghi trờn nhón 10 TB RSD 99,92 0,15 % Bng Kt qu ỏnh giỏ theo ANOVA Nhúm PTN PTN S KQ 10 Ngun sai s Gia cỏc nhúm Trong tng nhúm Tng cng Tng s bỡnh phng 0.0075 0.4025 0.4100 TểM TT Tng 998.72 599.5 ANOVA Bc t 14 15 Trung bỡnh 99.87 99.92 Bỡnh phng trung bỡnh 0.0075 0.0287 Phng sai 0.0320 0.0229 Ftn F tc 0.260 4.600 Nhn xột: Ftn < Ftc Kt qu trung bỡnh ca phũng th nghim ging nhau, phng phỏp phõn tớch cú tỏi lp v lp li tt 3.2 Xỏc nh giỏ tr cụng b trờn nhón v chng ch phõn tớch: 3.2.1 Tp hp kt qu ca PTN: Bng: Tp hp kt qu ca hai PTN TT Xi (%) 99,66 99,67 99,68 99,72 99,73 99,76 99,86 99,89 Trung bỡnh RSD TT 10 11 12 13 14 15 16 99,89 0,17 % Xi (%) 99,91 99,97 100,01 100,03 100,04 100,08 100,09 100,12 PL43 Nhn xột: - Hm lng trung bỡnh: 99,9 % so vi hm lng nhón, khụng m bo o m rng U = 0,09 % vi h s ph k= tin cy 95% - Tt c cỏc kt qu thu c ca PTN nm khong 99,5 % n 100,5 % so vi hm lng nhón vy kt qu ghi trờn nhón v chng ch l: Cht chun Tetrodotoxin SKS: TTX.DTDL.2015 1,0 ml dung dch cha 0,1 mg Tetrodotoxin (C11H17N3O8) m citrate pH 4,8 Bo qun: ng chun TTX dng dung dch c bo qun nhit -20oC Húa cht v thuc th: 5.1 Cht i chiu: Cht chun gc Tetrodotoxin 5.2 Ct sc ký: C8; 5àm; 250 x 4,6mm 5.3 Húa cht: - Methanol HPLC - Acid acetic - Amoni acetat Cỏc h s liờn quan: - H s chun TTX - Ph NMR, LCMS, ph TGA - Chng ch phõn tớch PL44 PH LC CễNG TRèNH CễNG B Tp dc hc s 466, thỏng nm 2015 nh lng nguyờn liu tetrodotoxin phõn lp t cỏc loi h cỏ núc (Tetraodontidae) bng sc ký lng ghộp ni ph (LC-MS/MS) PL45 Tp dc hc s 468, thỏng nm 2015 Nghiờn cu chit v tinh ch c t tetrodotoxin t ph tng mt s loi cỏ núc c (Tetraodontidae) ca vựng bin Vit Nam PL46 BO CO SA CHA LUN VN THC S [...]... kiểm tra và giám sát chất lượng thuốc với khoảng gần 900 chất bao gồm chuẩn quốc tế, chuẩn khu vực và chuẩn phòng thí nghiệm trong đó chuẩn do VKNTTW nghiên cứu thiết lập là 310 hoạt chất (157 chất chuẩn quốc gia và 184 chất chuẩn phòng thí nghiệm), chủ yếu là các hóa dược Từ năm 1995, VKNTTW là quan sát viên và chính thức từ 1997, được WHO công nhận là thành viên thiết lập chất chuẩn của khu vực và... trong số các loài cá nóc độc 9 Các bộ phận của cá nóc có độc tính rất khác nhau Độc tính của đa số các loài cá nóc có thể sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: trứng, tinh hoàn, gan, ruột, da, thịt Độc tính của cá nóc thường tăng cao vào các tháng 2, 3 và 7 đến 9 trong năm, đây là mùa sinh sản của cá nóc [17] Hàm lượng, phân bố TTX trong cá nóc: Tùy theo bộ phận của cá mà hàm lượng TTX trong cá nóc rất... độ nhạy khá tốt [3] 1.5 CHẤT CHUẨN VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 1.5.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học [21], [22] Theo DĐVN IV [16], chất đối chiếu được định nghĩa là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hoá học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ... loài cá nóc gai), hay với lớp da dai như da thú (các loài cá đầu và cá bò giấy) Một đặc điểm phòng ngự đáng chú ý khác được thấy ở các loài cá nóc và cá nóc nhím là khả năng phình to cơ thể, để tăng các kích thước so với hình dáng 8 thông thường Nhiều loài của các họ Tetraodontidae (cá nóc bốn răng), Triodontidae (cá nóc ba răng) và Diodontidae (cá nóc nhím) còn có khả năng tự bảo vệ (thêm) chống các... là các nước ngọt, sinh sống trong sông suối hay cửa sông Các hình dạng kỳ dị được thấy trong bộ cá này: có thể gần như là hình vuông hay tam giác (các loài cá nóc hòm), hình cầu (các loài cá nóc) cho tới dẹp bên (các loài cá đầu) Cá nóc phòng thủ bằng cách hy sinh tốc độ: ở loài này lớp vảy đã biến đổi thành các tấm hay các gai cứng Các gai này đôi khi có thể thụt vào và có thể khóa tại chỗ (như ở các... phòng thí nghiệm về chất chuẩn với các nước trong khu vực và trên thế giới Trong 10 năm lại đây, một số đề tài thực hiện ở Việt Nam do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương chủ trì đã thiết lập chất được khoảng 50 chất chuẩn DĐVN là chất đặc trưng chiết từ dược liệu 1.5.3 Đánh giá liên phòng thí nghiệm Để đảm bảo kết quả đánh giá chất chuẩn được khách qua, chất chuẩn sau khi được thiết lập và đóng gói phải... thí nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế ISO IEC 17025 hoặc tiêu chuẩn thực hành tốt phòng thí nghiệm GLP, theo protocol phù hợp đã được phê duyệt 22 1.5.4 Chất chuẩn tetrodotoxin Để nghiên cứu về độc tính cá nóc cũng như ứng dụng TTX trong y học, cần thiết phải có chất chuẩn TTX Trong những năm qua, ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu về cá nóc cũng như về TTX nhưng vẫn chưa thiết lập được chất chuẩn TTX biết chính...Nhằm giải quyết vấn đề cấp thiết đó, trong phạm vi của đề tài cấp nhà nước mã số ĐT.NCCB-ĐHƯD.2011-G/02 do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương chủ trì, chúng tôi thực hiện đề tài Thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin từ cá nóc (Tetraodontidae) với một số nội dung chính, bao gồm: - Xây dựng được quy trình chiết xuất, tinh chế tetrodotoxin từ cá nóc; - Xây dựng bộ dữ liệu phân tích cấu trúc,... tinh khiết của tetrodotoxin; - Thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin phục vụ nghiên cứu, tiêu chuẩn hoá và kiểm tra chất lượng thuốc 2 CHƯƠNG 1 1.1 TỔNG QUAN TETRODOTOXIN Tetrodotoxin (TTX) được phát hiện ở Nhật Bản năm 1909 [27], là một độc tố thần kinh cực mạnh cho tới nay không có chất giải độc, được đặt tên theo loài cá nóc đầu tiên phát hiện thấy có chứa độc tố này [40] 1.1.1 Tính chất hoá lý TTX... miligam/lọ Chất chuẩn TTX có hoạt lực cao, có giá trị lớn, trên thế giới thường đóng 1mg/lọ và được bảo quản ở nhiệt độ rất thấp (-20oC) Các chất chuẩn thông thường định kỳ được đánh giá và bảo quản sự dụng dài lâu 21 Hình 1 9 Buồng đóng chuẩn (Glove-Box) và tủ bảo quản chất chuẩn tại VKNTTW 1.5.2.4 Hoạt động thiết lập chất chuẩn tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Hiện nay, VKNTTW đã có bộ chất chuẩn phục ... nhn dng v ỏnh giỏ tinh khit ca tetrodotoxin; - Thit lp cht chun tetrodotoxin phc v nghiờn cu, tiờu chun hoỏ v kim tra cht lng thuc CHNG 1.1 TNG QUAN TETRODOTOXIN Tetrodotoxin (TTX) c phỏt hin... nguyờn t H C-4 l xớch o v OH l trc Tetrodotoxin cu trỳc A c gi tetrodotoxin, l thnh phn ch yu ca TTX thu c t cỏ núc t nhiờn Tetrodotoxin cu trỳc F thng c gi 4-epi tetrodotoxin Do nhúm hydroxyl C-4... 51 3.6 XY DNG TIấU CHUN C S CA NGUYấN LIU TETRODOTOXIN 55 3.7 NGHIấN CU THIT LP CHT CHUN TETRODOTOXIN 56 3.7.1 Nghiờn cu n nh ca tetrodotoxin mt s dung mụi 56 3.7.2 Nghiờn