BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC XANTHON TỪ RỄ CÂY VIỄN CHÍ ĐUÔI VÀNG (POLYGALA FALLAX HEMSL.) HỌ VIỄN CHÍ POLYGALACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC XANTHON TỪ RỄ CÂY VIỄN CHÍ ĐUÔI VÀNG (POLYGALA FALLAX HEMSL.) HỌ VIỄN CHÍ POLYGALACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 72 04 06 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TSKH.Nguyễn Minh Khởi HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PSG.TSKH Nguyễn Minh Khởi TS Phƣơng Thiện Thƣơng, Viện Dƣợc Liệu, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, động viên, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới NCS Đoàn Thái Hƣng, ngƣời thầy tận tình góp ý, giúp đỡ, hỗ trợ suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên phòng Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn - Viện Dƣợc liệu cán khoa Y - Dƣợc – Đại học Thành Đô tận tình, tạo điều kiện thuận lợi hết lòng giúp đỡ suốt trình thực luận văn Sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới chồng trai, bố mẹ, anh chị em bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2015 Học viên Trần Thị Hằng An MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung họ Viễn chí (Polygalaceae) 1.2 Tổng quan chi Polygala 1.2.1 Giới thiệu chi Polygala 1.2.2 Một số loài thuộc chi Polygala Việt Nam 1.3 Tổng quan Viễn chí đuôi vàng 1.3.1 Đặc điểm thực vật 1.3.2 Phân bố sinh thái 1.3.3 Thành phần hóa học 1.3.4 Tính vị, công chủ trị 12 1.3.5 Tác dụng sinh học Viễn chí đuôi vàng 12 1.3.6 Dược liệu dễ nhầm lẫn 15 1.4 Xanthon 15 1.5 Các phƣơng pháp xác định khả chống oxy hóa chất 17 1.5.1 Thử tác dụng dọn gốc tự DPPH 17 1.5.2 Thử tác dụng dọn gốc tự superoxide anion (O2-∙) 17 1.5.3 Một số phương pháp khác 17 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết bị 20 2.2.2 Hóa chất 21 2.3 Thiết kế nghiên cứu 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Chiết xuất cao phân đoạn 22 2.4.2 Phân lập 23 2.4.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học chất phân lập từ rễ Viễn chí đuôi vàng 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Chiết xuất cao phân đoạn 29 3.3 Phân lập chất 30 3.3.1 Phân lập phương pháp sắc ký cột 30 3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập rễ Viễn chí đuôi vàng 32 3.3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 36 3.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học chất phân lập từ Viễn chí đuôi vàng 46 3.4.1 Thử tác dụng dọn gốc DPPH 46 3.4.2 Thử tác dụng dọn gốc superoxyd 47 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 49 4.1 Các chất phân lập đƣợc 49 4.2 Về tác dụng sinh học chất phân lập đƣợc 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận 53 Kiến nghị 54 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Giá trị Rf chất phân lập đƣợc 34 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất BB1và 1,7- 37 dihydroxy-4-methoxy xanthon Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất BB2 1,3- 39 dihydroxy xanthon Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất BB3 1,7- 41 dihydroxy xanthon Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất BB4 1- methoxy 43 2,3-methylendioxy xanthon Bảng 3.6: Số liệu phổ 1H- 13C-NMR chất BB5 1,7- 45 dimethoxy xanthon Bảng 3.7: Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự DPPH 46 chất BB1, BB2, BB3, BB4, BB5 Bảng 3.8: Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự DPPH 46 quercetin Bảng 3.9: Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự superoxyd 47 chất BB1, BB2, BB3 Bảng 3.10: Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự superoxyd chất quercetin 48 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Hình ảnh Viễn chí đuôi vàng Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu Viễn chí đuôi vàng 20 Hình 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn cao rễ Viễn chí đuôi vàng 29 Hình 3.2: Sơ đồ phân lập chất cao EtOAc từ rễ Viễn 32 chí đuôi vàng Hình 3.3: Sắc ký đồ chất BB1, BB2, BB3, BB4, BB5 33 với hệ dung môi I Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC chất BB1, BB2, BB3, BB4, 35 BB5 Hình 3.5: Đồ thị kết tác dụng dọn gốc tự superoxyd chất BB1, BB2, BB3 quercetin 48 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol HDL-c Lipoprotein tỉ trọng cao cholesterol (High Density Lipoprotein cholesterol) Hex Hexan HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LDL-c Lipoprotein tỉ trọng thấp cholesterol (Low density lipoprotein cholesterol) M Khối lƣợng phân tử (Mass) MDA Maloyldialdehyd MDA Malondialdehyd MeOH Methanol MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Rf Hệ số lƣu SKLM Sắc ký lớp mỏng TBA Thiobarbituric acid TC Cholesterol toàn phần (Total cholesterol) TCA Triclo acetic acid TG Triglycerides TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Phổ tử ngoại (Ultra violet) VCB Cao chiết phân đoạn n-butanol VCE Cao chiết phân đoạn ethyl acetat VCH Cao chiết phân đoạn n-hexan VCN Cao chiết phân đoạn nƣớc VCTP Cao chiết toàn phần ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nƣớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm cao, lƣợng mƣa lớn, thảm thực vật phát triển vô phong phú với 12000 loài thực vật 4000 loài làm thuốc [4] Với hệ thực vật đa dạng nhƣ vậy, chúng cung cấp nguồn thực phẩm dồi mà cho nguồn thuốc chữa bệnh quý giá Theo đánh giá Tổ chức Y tế giới (WHO) có tới 80% dân số giới sử dụng cỏ phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe Ngày nay, để biện luận công chủ trị dƣợc liệu theo Y học cổ truyền, tìm nguồn nguyên liệu thảo dƣợc mới, nhu cầu nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học cỏ ngày cao, thu hút quan tâm nhà khoa học nƣớc Viễn chí đuôi vàng (Polygala fallax Hemsl.) Viễn chí trắng (P karensium Kurz.) từ lâu đƣợc đồng bào dân tộc Dao đỏ H’mông Sapa, Lào Cai sử dụng rễ nhƣ vị thuốc bổ để chữa đau nhức xƣơng khớp với tên gọi Bổ béo tía Bổ béo trắng [7] Do rễ loài giống với Ba kích nên ngƣời dân bán với tên Ba kích trắng Ba kích tía, dễ gây nhầm lẫn cho nhiều ngƣời Theo y học cổ truyền, rễ loài có vị đắng, ngọt, tính bình, có tác dụng bồi bổ sức khỏe, lợi tiểu, kích thích tuần hoàn, điều hòa kinh nguyệt [3] Khác hẳn với vị thuốc Ba kích (Morinda officinalis) đƣợc dùng lƣng gối mỏi đau, liệt dƣơng, xuất tinh sớm, phụ nữ kinh nguyệt không [2] Ngoài ra, tên gọi có phần giống vị thuốc Viễn chí mà Y học cổ truyền sử dụng với tác dụng chữa ho nhiều đờm, hồi hộp, hay quên, hay sợ hãi khác với tác dụng bồi bổ Viễn chí trắng Viễn chí đuôi vàng nên dễ gây nhầm lẫn Đến nay, nghiên cứu hai loài Polygala Nhằm phân biệt loài với dƣợc liệu dễ nhầm lẫn, năm 2012, Đào Trọng Tuấn cộng phân lập đƣợc 10 xanthon từ rễ loài Polygala karensium thử hoạt tính kháng virút cúm A: H1N1, H9N2, H1N1 (WT), chủng kháng thuốc H274Y (kháng Tamiflu) Kết cho thấy, hợp chất xanthon-1-hydroxy thể tác dụng kháng virus tốt có tác dụng kháng chủng virus [43] Về loài Polygala fallax, Lin cộng phân lập đƣợc xanthon từ phận rễ đánh giá tác dụng chống oxy hóa xanthon tốt [29] Tuy nhiên, chƣa có công trình nghiên cứu công bố thành phần hóa học, tác dụng sinh học rễ Viễn chí đuôi vàng (Polygala fallax Hemsl.) mọc Việt Nam Nhằm tạo sở khoa học cho việc khai thác sử dụng dƣợc liệu, tác dụng, tiến hành thực đề tài “Phân lập thử tác dụng chống oxy hóa xanthon từ rễ Viễn chí đuôi vàng (Polygala fallax Hemsl.) họ Viễn chí Polygalaceae” với mục tiêu: Phân lập số xanthon từ rễ Viễn chí đuôi vàng Polygala fallax Đánh giá tác dụng chống oxy hóa xanthon phân lập đƣợc PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB4 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H 40 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB4 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H (TIẾP) 41 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB4 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C 42 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB4 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C (TIẾP) 43 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB4 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT 44 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB4 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT (TIẾP) 45 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ TỬ NGOẠI 46 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ HỒNG NGOẠI 47 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ KHỐI 48 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H 49 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H (TIẾP) 50 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C 51 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C (TIẾP) 52 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT 53 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT BB5 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT (TIẾP) 54 [...]... từ rễ cây Viễn chí đuôi vàng chỉ ra rằng nó có tác dụng tăng cƣờng thực bào của đại thực bào, thúc đẩy sản xuất kháng thể đồng thời tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho cơ thể ngƣời [37] 13 Hiện nay, chƣa có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của các chất đã tách đƣợc từ cây Viễn chí đuôi vàng + Lin và cộng sự cũng thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa của 7 xanthon: ( 2); ( 3); ( 5); ( 6); ( 7); ( 8); ( 9) tách... 3-hydroxy-1,4-dimethoxy xanthon ( 1), 1,7- dihydroxy-2,3-methylendioxy xanthon ( 2), 7-hydroxy-1-methoxy-2,3- methylendioxy xanthon ( 3), 1,3,6-trihydroxy-2,7-dimethoxy xanthon ( 4), 1,3dihydroxy-2-methoxy xanthon ( 5), 1-methoxy-2,3-methylendioxy xanthon ( 6), 3-hydroxy-1,2-dimethoxy xanthon ( 7), 1,6,7-trihydroxy-2,3-dimethoxy xanthon ( 8), 1,3,7-trihydroxy-2-methoxy xanthon ( 9), 1,3-dihydroxy xanthon (1 0), ... đã phân lập đƣợc hai phenolic từ rễ Viễn chí đuôi vàng: Polygalolide A ( 1) and B ( 2) [45] Dongming zhang và các cộng sự còn phân lập đƣợc 5 oligo-polyeste saccharid mới từ Viễn chí đuôi vàng, đƣợc gọi là fallaxose A-E (2- 6), cùng với bốn oligosaccharid đã biết, reiniose D ( 1), senegose G ( 7), tenuifoliose C ( 8) và P ( 9) [11] 10 Năm 2005, Huang Zhaohui và cộng sự đã phân lập từ rễ cây Viễn chí đuôi vàng. .. dụng đƣợc Võ Văn Chi mô tả [7] 1.3.5 Tác dụng sinh học của Viễn chí đuôi vàng Hiện nay, trên thế giới chƣa có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của cây Viễn chí đuôi vàng Theo Guo Jingshen và cộng sự, khi nghiên cứu trên điện tâm đồ của thỏ bình thƣờng và quá trình truyền máu của động mạch vành tim chuột lang đã bị cô lập cho thấy liều 10% đến 30% cao toàn phần 12 của rễ Viễn chí đuôi vàng có tác. .. trắng cũng có hình dạng cây, rễ giống với Viễn chí đuôi vàng Trong Y học cổ truyền và trong dân gian, nó đƣợc sử dụng với cùng tác dụng của Viễn chí đuôi vàng  Ba kích (Morinda officinalis How .) có rễ giống với Viễn chí đuôi vàng Thực sự thì đó là các loài thuộc hai chi khác nhau là Morinda (họ Cà phê, Rubiaceae) và Polygala (họ Viễn chí, Polygalaceae) Trong y học cổ truyền, vị thuốc ba kích đƣợc dùng... amoni (muối Mo) của hãng Merck - Chứng dƣơng quercetin của hãng Sigma (M ) 2.3 Thiết kế nghiên cứu Bƣớc 1: Chiết cao các phân đoạn của dƣợc liệu rễ cây Viễn chí đuôi vàng  Chiết xuất cao toàn phần  Chiết lỏng lỏng để thu đƣợc cao các phân đoạn Bƣớc 2: Phân lập, tinh chế (độ tinh khiết > 90 %) và xác định công thức hóa học của các chất phân lập từ phân đoạn này  Phân lập, tinh chế bằng các phƣơng pháp... quan về cây Viễn chí đuôi vàng Viễn chí đuôi vàng có tên khoa học là: Polygala fallax Hemsl. , tên đồng nghĩa là Polygala fallax Hayek ex Zahlbruckner, Polygala aureocauda Dunn., Polygala forbesii Chodat [3], [4], [50], [54] Thuộc họ Viễn chí (Polygalaceae) , bộ Đậu (Fabales) Ngoài ra, nó còn có một số tên thƣờng gọi khác nhƣ: Bổ béo tía, Kích nhũ đuôi vàng [3] 1.3.1 Đặc điểm thực vật Viễn chí đuôi vàng. .. SaPa của dãy Hoàng Liên Sơn [3], [4], [51] 8 1.3.3 Thành phần hóa học Cho tới nay chƣa có công trình nghiên cứu về rễ Viễn chí đuôi vàng ở Việt Nam Theo các tài liệu đã đƣợc nghiên cứu trên thế giới, rễ Viễn chí đuôi vàng có chứa các thành phần: saponin triterpen, polysaccharid, phenolic và các dẫn xuất của xanthon Xanthon là nhóm chất chính trong rễ Viễn chí đuôi vàng, cho đến nay đã biết đƣợc 11 xanthon. .. thiệu chung về họ Viễn chí (Polygalaceae) [49], [51] Họ Viễn chí (Polygalaceae) là một họ thực vật có hoa thuộc bộ Đậu (Fabales), với khoảng 13-17 chi và 900-1000 loài Chúng phân bố khắp thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của cả hai bán cầu [49], [51] Các cây thuộc họ Viễn chí có thể là cây thân gỗ, cây cỏ hay cây bụi, đôi khi là cỏ kí sinh trên rễ, một vài cây có mùi salixilat,... sử dụng 2 loài Viễn chí là P tenuiflorum 4 (Viễn chí lá nh ), P sibirica (Viễn chí Xeberi), để điều trị bệnh thần kinh suy nhƣợc, chữa hồi hộp, hay quên, sợ hãi, chữa ho nhiều đờm [2], [5] Ngoài các loài Viễn chí đƣợc sử dụng với tác dụng chữa ho và tăng trí nhớ, thì hiện nay 2 loài Viễn chí đuôi vàng (Polygala fallax Hemsl. ) và Viễn chí trắng (P karensium Kurz .) cũng đƣợc đồng bào dân tộc Dao đỏ và ... lập thử tác dụng chống oxy hóa xanthon từ rễ Viễn chí đuôi vàng (Polygala fallax Hemsl.) họ Viễn chí Polygalaceae với mục tiêu: Phân lập số xanthon từ rễ Viễn chí đuôi vàng Polygala fallax Đánh... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC XANTHON TỪ RỄ CÂY VIỄN CHÍ ĐUÔI VÀNG (POLYGALA FALLAX HEMSL.) HỌ VIỄN CHÍ POLYGALACEAE. .. Nghiên cứu tác dụng sinh học chất phân lập từ Viễn chí đuôi vàng Thử tác dụng chống oxy hóa mô hình in vitro Mẫu nghiên cứu gồm: chất phân lập đƣợc từ Viễn chí đuôi vàng  Thử tác dụng dọn gốc