Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 14/2007, 44-48 Kết phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) thị phân tử RAPD Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Nguyễn Đức Thành, Trần Thuỳ Linh Viện Công nghệ sinh học Tóm tắt Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100% Trong tổng số 50 mẫu thu từ vùng tỉnh mẫu L1, L3 L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao so với mẫu lại Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với mẫu khác Các mẫu lại chia làm nhóm chính: Nhóm I gồm mẫu E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1 có khác biệt so với hai nhóm II nhóm III khoảng 50%; Nhóm II gồm E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2 có mức độ khác biệt so với nhóm III khoảng 45% Nhóm III gồm mẫu lại Từ khóa: Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib), RAPD, phân tích đa dạng di truyền I MỞ ĐẦU Gõ đỏ (Cà te, Gõ cà te) có tên khoa học Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib (hoặc Pahudia xylocarpa Kurz) thuộc họ Đậu (Leguminosae), họ phụ Vang (Caesalpinoideae), loài gỗ lớn, cao tới 30 m đường kính đạt tới 80 - 100 cm Cây sống rừng nhiệt đới thường xanh hay nửa rụng lá, có phân bố Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Khánh Hoà tỉnh vùng Đông Nam Bộ Phân bố không tập trung mà gặp cá thể rải rác loài khác rừng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999) Gỗ Gõ đỏ ưa chuộng thị trường, dùng rộng rải để đóng đồ gỗ, bàn ghế, giường tủ, đồ chạm trổ cao cấp, đồ mỹ nghệ Các “nu gõ” có giá trị bán đắt Chính lý mà Gõ đỏ bị khai thác đến cạn kiệt khắp nơi Số lượng cá thể có kích thước lớn bị giảm sút nhanh chóng không nhiều Các chuyến khảo sát gần cho thấy số lượng cá thể trưởng thành loài tổ thành rừng tự nhiên thấp, hầu hết trước bị khai thác nhiều lần, nên nguồn gen loài bị suy giảm mạnh Do việc đánh giá đa dạng di truyền loài xuất xứ khác nhu cầu cấp thiết góp phần vào việc lựa chọn khu bảo tồn in situ xây dựng quần thụ bảo tồn ex situ Những năm gần thị phân tử dùng rộng rãi nghiên cứu phân loại số loài trồng, thị RAPD sử dụng rộng rãi kỹ thuật đơn giản tốn RAPD sử dụng để xác định mối quan hệ phát sinh loài loài Citrus (Federici et al., 1998) Juglans regia (Nicese et al., 1998), hoa mõm chó (Jimenez et al., 2005), loài Tinospora (Ahmed et al., 2005) Việt Nam, RAPD sử dụng vào nghiên cứu đa dạng di truyền loài Lim xanh (Quách Thị Liên et al., 2004) loài Tràm (Trần Quốc Trọng et al., 2005) Bài viết trình bày kết sử dụng RAPD nghiên cứu mối quan hệ di truyền xuất xứ loài Gõ đỏ nhằm đưa đề xuất việc bảo tồn nguồn gen loài quan trọng II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Mẫu 50 Gõ đỏ thu hái từ rừng tự nhiên tỉnh (Đồng Nai, Đắc Lắc, Gia Lai, Ninh Thuận) khu rừng trồng 50 tuổi Đắc Lắc (Bảng 1) sử dụng Bảng Các mẫu Gõ đỏ sử dụng phân tích TT Địa điểm lấy mẫu VQG Cát Tiên, huyện Tân Phú, Đồng Nai Huyện Bắc ái, Ninh Thuận Đèo Ngoạn Mục, Ninh Thuận VQG Yokdon, huyện Buôn Đôn, Đắc Lắc Thôn Jun, huyện Lắc, Đắc Lắc Eakmat, Tp Buôn Ma Thuột, Đắc Lắc Kon Hà Nừng, huyện Kbang, Gia Lai Tổng Số lấy mẫu 10 5 10 10 50 Ký hiệu C1 đến C10 B1 đến B5 N1 đến N5 D1 D2 L1 đến L10 E1 đến E8 K1 đến K10 Phương pháp nghiên cứu ADN genome mẫu Gõ đỏ tách từ mẫu khô bảo quan silicagel theo phương pháp CTAB Saghai Maroof et al (1994) Kỹ thuật PCR với mồi RAPD tiến hành với tổng thể tích 25 μl/mẫu gồm thành phần sau: ADN genome (50 ng); mồi cpDNA (10 ng); dNTP (200 mM); MgCl2 (2 mM); enzym Taq polymerase (0,5 đơn vị) đệm thích hợp cho enzym Chu trình nhiệt bao gồm bước: 94oC - phút; 94oC - phút; 34oC - phút; 72oC - phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước đến bước 4; 72oC -7 phút; giữ nhiệt độ 4oC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1%, quan sát đèn cực tím chụp ảnh hệ thống Thermal Imaging System FTI-500 (Pharmacia Biotech) Các số liệu đưa vào xử lý chương trình NTSYS pc (Rohlf F J, 1993) để tính ma trận tương đồng đôi mẫu Sau mẫu nghiên cứu xử lý tiếp NTSYS - SIMQUAL (phần mềm NTSYSpc 2.0) biểu biểu đồ quan hệ di truyền Mồi sử dụng cho nhân PCR mồi ngẫu nhiên RAPD hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPC8, OPC9, OPB6, OPB10, OPB17, OPB20 (Bảng 2) Bảng Trình tự mồi RAPD TT Tên mồi OPC8 OPC9 OPB6 OPB10 OPB17 OPB20 Trình tự 5’-TGGACCGGTG-3’ 5’-CTCACCGTCC-3’ 5’-TGCTCTGCCC-3’ 5’CTGCTGGGAC-3’ 5’-AGGGAACGAG-3’ 5’-GGACCCTTAC-3’ III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết tách chiết ADN genome Kết tách chiết cho thấy ADN genome tách chiết từ mẫu loài Gõ đỏ có độ tinh cao (hình 1), đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm Hình ADN genome tách từ số mẫu Gõ đỏ Kết phân tích RAPD Sản phẩm PCR với mồi RAPD điện di gel agarose 1% Các sản phẩm PCR ADN genome mẫu Gõ đỏ với mồi RAPD cho thấy tất mồi cho đa hình Trong mồi sử dụng có mồi OPC9 (hình 2) OPB10 (hình 3) cho nhiều băng đa hình Hình Sản phẩm PCR với mồi OPC9 E, D, C, L, N ký hiệu địa điểm thu mẫu, số số thứ tự mẫu Hình Sản phẩm PCR với mồi OPB10 Quan hệ di truyền mẫu Gõ đỏ Quan hệ di truyền mẫu Gõ đỏ thể hình E1 N2 N1 L6 L7 N3 K9 L1 E2 E3 E4 D1 D2 C8 E6 C2 E7 E8 K8 K6 C1 B5 C3 C4 C7 C5 C6 C9 L10 K5 L5 B3 L8 L9 N5 N4 C10 L4 L3 E5 K1 K3 K7 B4 B1 K10 K2 B2 K4 0.47 0.60 0.74 0.87 1.00 Coefficient Hình Biểu đồ quan hệ di truyền mẫu Gõ đỏ Biểu đồ hình cho thấy mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100% Mẫu K4 (thu từ Kon Hà Nừng tỉnh Gia Lai) có mức độ khác biệt đến 53% so với mẫu khác Các mẫu lại chia làm nhóm chính: • • • Nhóm I gồm mẫu E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1, nhóm có khác biệt so với hai nhóm II nhóm III khoảng 50%; Nhóm II gồm E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2, nhóm có mức độ khác biệt so với nhóm III khoảng 45%; Nhóm III gồm mẫu lại Trong nhóm mẫu có mức độ khác mức thấp có mẫu hoàn toàn giống nhau: nhóm I có mẫu E1và N2, L6 L7; nhóm II có E5 K1, B1 K10; nhóm III có D1 D2, C4 C7, C6 C9 mẫu giống mặt di truyền Điều giải thích sau: Các mẫu E1 E5 thu từ rừng trồng 50 tuổi không rõ nguồn gốc hạt, suy luận E1 thu hái hạt từ vùng đèo Ngoạn Mục (Ninh Thuận)(giống với mẫu N2) E5 từ vùng Kon Hà Nừng (Gia Lai)(giống mẫu K1) Các cặp mẫu khác cặp mẫu thu hái từ vùng: L6 L7 từ huyện Lắc, D1 D2 từ Yokdon, C4 C7, C6 C9 từ Cát Tiên, chứng tỏ cặp tái sinh từ mẹ nên cặp có nguồn gốc di truyền giống Riêng trường hợp B1 (Ninh Thuận) K10 (Gia Lai) chưa thể giải thích Phân tích theo vùng thấy sau: Mười mẫu thu từ VQG Cát Tiên (C1 đến C10) toàn nằm nhóm III Hai mẫu thu từ VQG Yondon giống hoàn toàn nằm nhóm III Chín mẫu thu từ huyện Lắc, Đắc Lắc (trừ mẫu L2 không thu số liệu) có mẫu nằm nhóm I (L1, L6, L7) mẫu nằm nhóm III (L3, L4, L5, L8, L9, L10) Mười mẫu thu từ Kon Hà Nừng, Gia Lai có mức đa dạng cao Các mẫu thu nằm rải rác nhóm tập trung chủ yếu nhóm II (K1, K3, K7, K10, K2), mẫu K9 nhóm I, mẫu K5, K6, K8 nhóm III riêng K4 có mức độ khác biệt di truyền lớn so với mẫu thu Kon Hà Nừng, Gia Lai nơi khác nên tạo thành nhóm riêng Năm mẫu thu Bắc ái, Ninh Thuận có mẫu (B1, B2, B4) nằm nhóm II mẫu (B3, B5) nằm nhóm III Năm mẫu thu từ đèo Ngoạn Mục, Ninh Thuận có mẫu (N1, N2, N3) nằm nhóm I, hai mẫu (N4, N5) thuộc nhóm II Tám mẫu thu rừng trồng Eakmat, Đắc Lắc chủ yếu nằm nhóm III (E2, E3, E4, E6, E7, E8) lại có E1 nằm nhóm I, E5 nằm nhóm II Trong tổng số 50 mẫu thu từ vùng tỉnh mẫu L1, L3 L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao so với mẫu lại IV KẾT LUẬN Các sản phẩm PCR ADN genome mẫu Gõ đỏ với mồi RAPD cho thấy tất mồi cho đa hình Trong mồi sử dụng có mồi OPC9 OPB10 cho nhiều băng đa hình Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100% Trong tổng số 50 mẫu thu từ vùng tỉnh mẫu L1, L3 L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao so với mẫu lại Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với mẫu khác Ngoài K4 lập thành nhóm riêng, mẫu lại chia làm nhóm chính: Nhóm I gồm mẫu E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1 có khác biệt so với hai nhóm II nhóm III khoảng 50%; Nhóm II gồm E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2 có mức độ khác biệt so với nhóm III khoảng 45% Nhóm III gồm mẫu lại Tài liệu tham khảo Ahmed SM, Verma V., Qazi PH., Ganaie MM, Bakshi SK., Qazi GN, 2005 Molecular phylogeny in indian Tinospora species by DNA based markers Plant Systematics and Evalution, 256 (1-4): 75-87 Federici CT et al, 1998 Phylogenetic relationship within the genus Citrus (Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis Theor Appl Genet, 96:812-822 Nicese F.P., Homaza JI., and McGranahan GH, 1998 Molecular Characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L) genotypes based on RAPD markers Euphytica 101: 199206 Jimenez JF., Guemes J., Sanchez-Gomez P., Rossello JA, 2005 Isolated populations or isolated taxa? A case study in narrowly-distributed snapdragons (Antirrhinum sect Sempervirentia) using RAPD markers Pl Syst Evol 252: 139-152 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999 Một số loài bị đe doạ Việt Nam Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2004 Sử dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền số xuất xứ Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống”, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2004 464-468 Rohlf FJ., 1993 NTSYS-pc Numerrical taxonomy and multivariate system, Version 1.80 Applied Biostatitics Inc., New York Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Việt Cường, 2005 Sử dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền số xuất xứ Tràm (Maleleuca cjuputy) từ vùng khác Việt Nam Kỷ yếu Hội thảo Quốc gia lần thứ Sinh thái tài nguyên sinh vật Hà Nội, 2005 259-265 Saghai Maroof M A., Biyashev R M., Yang G P., Zhang Q., Allard R W., 1994, Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc Natl Acad.Sci USA, 91: 5466-5470 Results on Genetic Diversity Analysis of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib Provenances by using RAPD markers Nguyen Hoang Nghia (Forest Science Institute of Vietnam) Nguyen Duc Thanh, Tran Thuy Linh (Biotechnology Institute) Summary By using RAPD markers, samples of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib, an important tree species of Vietnam, showed high genetic diversity Genetic similarity indeces varied from 47% to 100% Among 100 samples collected from locations of provinces, the samples L1, L3 and L4 (from Lac district, Dac Lac province) as well as K9 and K4 (from Kon Ha Nung, Gia Lai province) showed higher genetic difference than the other samples The sample K4 showed difference of 53% from other samples The remaining samples can be divided into main groups: Group I includes samples such as E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1 which showed difference of about 50% from other two groups; Group II includes samples such as E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2 which showed difference of 45% from Group III; and Group III includes remaining samples Keywords: Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib, RAPD, genetic diversity analysis ... đồ quan hệ di truyền mẫu Gõ đỏ Biểu đồ hình cho thấy mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100% Mẫu K4 (thu từ Kon Hà Nừng tỉnh Gia Lai) có mức độ... Sử dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền số xuất xứ Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống”, Nhà xuất Khoa học kỹ... lại IV KẾT LUẬN Các sản phẩm PCR ADN genome mẫu Gõ đỏ với mồi RAPD cho thấy tất mồi cho đa hình Trong mồi sử dụng có mồi OPC9 OPB10 cho nhiều băng đa hình Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền