PHẠM DOÃN LÂN – Phân tích đa dạng trình tự nucleotid ADN ty thể PHÂN TÍCH ĐA DẠNG TRÌNH TỰ NUCLEOTID ADN TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA BÒ H’MÔNG VỚI MỘT SỐ QUẦN THỂ BÒ KHÁC Phạm Doãn Lân1, Nguyễn Trọng Bình1, Trần Xuân Hoàn1, Vũ Chí Cương1, Lê Đình Lương2 J.C Maillard3 Phòng TN trọng điểm Công nghệ tế bào động vật -Viện Chăn nuôi - Thụy phương - Từ Liêm - Hà Nội Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia - Hà Nội Giám đốc CIRAD vùng Đông Nam Á * Tác giả liên hệ: Phạm Doãn Lân - Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật Tel: (04).2.166.147 / 0914 366 975; Fax: (04) 389.775; Email: pdlanvn@yahoo.com ABSTRACT Mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationships of H’Mong cattle to other cattle populations H’mong cattle is an local breed with unclear origin To assess the mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationship of H’mong cattle to various other cattle populations, we analyzed for partial (530bp) of mtDNA D-loop sequences of 26 H’mong cattle samples in conjunction with previous published sequences from Northeast Asian (Korea, Japan), Europe, Africa, India and American bison cattle The results showed that 14 haplotypes were observed in total of 26 analyzed cattle samples, indicating that the H’mong cattle population had a high diversity of mtDNA In phylogenetic analysis, the H’mong cattle samples were clustered into two distinct genetic lineages: taurine (Bos taurus) and zebu (Bos indicus) The H’mong zebu lineages are closely related to Indian zebu cattle and are clearly separate from other cattle populations while the H’mong taurine lineages, Eropean, African, Japanese and Korean cattle clustered together These results suggested that H’mong taurin lineages are closely related to cattle of Northeast Asian and Europe Keywords: Mitochondrial DNA diversity, phylogenetic relationship, Bos indicus, Bos taurus ĐẶT VẤN ĐỀ Bò có vai trò phát triển văn minh loài người loài vật nuôi hoá có ý nghĩa kinh tế Có hai phụ loài bò u (Bos taurus) bò có u (Bos indicus) cho bắt nguồn từ bò rừng Châu Âu (Bos primigenius) tồn từ cách 8.000 - 10.000 năm hoá riêng biệt (Epstein, 1971; Epstein Mason, 1984; Machugh cs, 1997; Loftus cs, 1994) Các giống bò biến thể hai phụ loài Bos indicus Bos taurus Tính đa dạng di truyền, nguồn gốc, bảo tồn lợi ích giống bò quan tâm nghiên cứu nhiều Thế giới Bò H’mông hay bò Mèo giống bò địa phương đặc trưng tỉnh Hà Giang, chúng gắn liền với đời sống văn hoá đồng bào dân tộc H’mông Cùng với người H’mông, bò H’mông sinh sống bán cô lập độ cao cao 1.000 mét so với mặt nước biển chúng bị lai tạp giống bò khác Theo số giả thiết cho bò vàng Việt Nam có nguồn gốc từ bò có u Ấn Độ (Bos indicus) bò vàng Trung Quốc u (Bos taurus) (Lê Viết Ly cs, 1999) Tuy nhiên, chưa có chứng mức độ phân tử lai tạp nguồn gốc hai dòng bò có u bò u bò Vàng Việt Nam nói chung bò H’mông nói riêng công bố Trong nghiên cứu trình bày: Một số kết phân tích đa dạng trình tự AND vùng D-loop ty thể, xác định lai tạp hai loại bò có u bò u quần thể bò VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 13-Tháng 8-2008 H’mông đồng thời so sánh mối quan hệ di truyền bò H’mông với số quần thể bò khác Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Phi, Châu Âu, bò rừng Mỹ (Bison bison) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Hai mươi sáu cá thể bò H’mông chọn ngẫu nhiên huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Xín Mần Hoàng Su Phì tỉnh Hà Giang Trình tự nucleotid vùng D-loop ty thể mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi bò rừng Châu Mỹ thu thập từ ngân hàng gen Quốc tế (GeneBank) Tách chiết ADN nhân ADN đặc hiệu (PCR) Quy trình tách chiết ADN hệ gen từ mẫu mô tai 26 cá thể bò H’mông thực theo kít tách QIAamp hãng Qiagen (Đức) Vùng ADN D-loop ty thể có kích thước 990 bp nhân đặc hiệu phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự: Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’ Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’ Phản ứng PCR tiến hành tổng thể tích 50µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM loại mồi xuôi, mồi ngược 50-100 ng ADN khuôn Phản ứng PCR thực theo bước: Trước tiên ADN biến tính 94oC phút, với 32 chu kỳ, chu điều kiện sau: biến tính 92 oC phút, gắn mồi 55oC phút, tổng hợp chuỗi ADN 72 oC phút 20 giây Cuối kết thúc phản ứng 72 oC 10 phút Phản ứng giải trình tự Sản phẩm PCR sau tinh kít tinh (QIAquick PCR Purification kit) hãng Qiagen (Đức) Phản ứng giải trình tự thực trực tiếp từ sản phẩm PCR tinh với mồi xuôi ngược sử dụng kít giải trình tự (DTCS-Quick Start Master Mix) hãng Beckman Coulter tiến hành phân tích máy giải trình tự CEQ8000 Phân tích trình tự Trình tự nucleotid vùng D-loop ty thể mẫu bò H’mông so sánh với trình tự mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bò rừng Mỹ (Bos binson) trình tự toàn ADN ty thể hai mẫu bò u có u đối chứng với mã truy cập ngân hàng gen tương ứng V00654 NC-005971 sử dụng công cụ CLUSTALW phần mềm BIOEDIT DNAsp Khoảng cách di truyền trình tự vùng D-loop ty thể nhóm bò tính theo phương pháp Tamura Nei (1993) Cây quan hệ di truyền (phylogenetic tree) xây dựng phần mềm MEGA phiên 4.0 (Kuma cs, 1994) PHẠM DOÃN LÂN – Phân tích đa dạng trình tự nucleotid ADN ty thể KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự đa dạng trình tự ADN vùng D-loop ty thể ADN ty thể dạng vật liệu di truyền nằm nhân di truyền theo dòng mẹ Chúng có tỷ lệ đột biến cao 5-10 lần so với hệ gen nhân, đặc biệt vùng điều khiển D-loop (displacement loop) có tỷ lệ thay đổi cao thường sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại nguồn gốc tiến hoá loài Tiến hành giải trình tự ADN vùng D-loop ty thể mẫu bò H’mông thu đoạn trình tự nucleotid có độ dài 530 bp (base pair) độ dài 990 bp sản phẩm PCR Đoạn trình tự có vị trí từ nucleotid 15813 đến 16343 toàn trình tự ADN ty thể công bố Anderson cs (1982) với mã truy nhập ngân hàng gen Quốc tế V00654 So sánh phân tích trình tự vùng D-loop ty thể 67 mẫu bò bao gồm: H’mông (26 mẫu); Hàn Quốc (4 mẫu bò vàng); Nhật Bản (9 mẫu bò đen), Ấn Độ (6 mẫu gồm giống Harianna, Sahiwal, Tharparkar); Châu Phi (8 mẫu gồm giống: Butana, Fulani, Kenana N’Dama); Châu Âu (12 mẫu gồm giống: Aberdeen Angus, Charolais, Friesian, Here ford, Jersey Simantal) mẫu đối chứng bò có u u, kết cho thấy xuất 39 kiểu di truyền đơn ty thể (haplotype) có 50 điểm đa hình (polymorphic site) toàn đoạn trình tự ADN phân tích (530 bp) Trong số 26 mẫu bò H’mông phân tích có 14 kiểu di truyền ty thể xác định, kết trình bày Hình Hình 1: Đa dạng trình tự vùng D-loop ty thể 67 mẫu bò phân tích Ký hiệu mẫu thể cột thứ nhất: EU (Châu Âu); AF (Châu Phi); JP (Nhật Bản); KR (Hàn Quốc); VN (Viêt Nam); IN (Ấn Độ) V00654 NC005971- tương ứng trình tự ADN ty thể chuẩn mẫu bò u (Bos taurus) bò có u (Bos indicus) Ký hiệu (-) tương đồng nucleotid, (*) thêm nucleotid VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 13-Tháng 8-2008 Qua Hình cho thấy trình tự ADN vùng D-loop ty thể bò H’mông tách biệt thành hai nhóm: nhóm H’mông với mẫu từ VN1 đến VN9 có trình tự dòng bò u (Bos taurus); nhóm H’mông với mẫu từ VN10 đến VN14 có trình tự dòng bò có u (Bos indicus) Trong số 26 mẫu bò H’mông phân tích ngẫu nhiên Kết cho thấy, có 14 mẫu thuộc dòng bò có u 12 mẫu thuộc dòng bò u (Hình 2) Điều cho thấy tính đa dạng ADN ty thể quần thể bò H’mông tương đối cao Khoảng cách mối quan hệ di truyền Khoảng cách di truyền trung bình quần thể bò ước lượng dựa phương pháp Tamura-Nei Kết thể Bảng Bảng 1: Ma trận khoảng cách di truyền quần thể bò bao gồm bò rừng Mỹ theo Tamura-Nei [1] Châu Âu [2] Châu Phi [3] Ấn Độ [4] Nhật Bản [5] Hàn Quốc [6] H’mông [7] H’mông [8] Bò rừng Mỹ [1] 0,000 0,008 0,060 0,007 0,007 0,058 0,007 0,135 [2] [3] [4] 0,000 0,061 0,013 0,011 0,060 0,012 0,133 0,000 0,065 0,063 0,004 0,058 0,140 0,000 0,009 0,064 0,009 0,139 [5] [6] [7] [8] 0,000 0,062 0,010 0,139 0,000 0,057 0,137 0,000 0,133 0,000 Qua Bảng cho thấy, khoảng cách di truyền bò rừng Mỹ quần thể bò khác (Châu Âu, Châu Phi, Ấn Độ, Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản) lớn 0,1 Trong đó, khoảng cách di truyền bò Ấn Độ, H’mông (thuộc dòng bò có u) quần thể bò thuộc dòng u (Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc, Châu Phi, H’mông 1) lớn 0,05 Khoảng cách di truyền quần thể bò Châu Âu, Châu Phi, Nhật Bản, Hàn Quốc H’mông dao động khoảng 0,007–0,013 Khoảng cách di truyền nhóm bò H’Mông bò có u Ấn Độ 0,004 Cây phân loài di truyền hình cho thấy quần thể bò H’mông nhóm Châu Âu, Châu Phi, Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc dòng bò u có mối quan hệ gần đồng thời chúng tách biệt so với bò có u Ấn Độ bò rừng Mỹ Trong nhóm bò H’mông có mối quan hệ di truyền gần với quần thể bò có u Ấn Độ Mặc dù kết tính khoảng cách di truyền Bảng cho thấy, nhóm bò H’mông bò Châu Âu, Hàn Quốc, Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần so với nhóm bò Châu Phi tương ứng (0,007-0,01) (0,012) phân loài di truyền (Hình 2) không cho thấy có tách biệt hẳn nhóm bò Châu Phi H’mông 1, Châu Âu, Hàn Quốc Nhật Bản Kết nghiên cứu giống với Kim cs (2003), nghiên cứu mối quan hệ di truyền số giống bò Hàn Quốc không cho thấy tách biệt bò Hàn Quốc, Châu Âu Châu Phi Trong đó, Mannen cs (1998) nghiên cứu nguồn gốc giống bò đen Nhật Bản (Bos taurus) dựa phân tích trình tự ADN ty thể cho thấy tách biệt bò Châu Âu với bò Châu Phi Trong đó, số cá thể bò đen Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần gũi với bò Châu Âu PHẠM DOÃN LÂN – Phân tích đa dạng trình tự nucleotid ADN ty thể Ngoài ra, số nghiên cứu khác cho hầu hết giống bò ngày có nguồn gốc hoá từ khu vực khác nhau: Khu vực Tây Á nguồn gốc bò có u (Bos indicus) bao gồm giống bò có u Ấn Độ nay, vùng Cận Đông Châu Phi nguồn gốc bò u -Bos taurus (Bradley cs, 1996; Loftus cs, 1994; Troy cs, 2001) Cho dù giống bò Châu Phi chúng có đặc điểm hình thái dạng trung gian hai phụ loài Bos indicus Bos taurus nhiên nguồn gốc xuất ban đầu Châu Phi cho bò Bos taurus JP U87635 JP U87633 KR AF409056 JP U87639 JP U87638 JP U87637 JP U87636 VN8 JP U87634 Bos taurusV00654 VN22 VN5 VN13 VN14 JP U87640 EU L27716 EU L27726 JP U87650 EU L27734 EU L27717 EU L27735 KR AF409055 EU L27718 EU L27719 EU L27727 EU L27712 EU L27725 KR AF409057 EU L27713 VN23 VN17 VN19 VN1 VN15 VN25 EU L27724 AF L27730 AF L27731 AF L27728 AF L27720 AF L27721 AF L27729 VN11 KR AF409054 AF L27714 AF L27715 VN4 VN20 VN24 IN L27723 VN18 IN L27722 IN L27732 IN L27736 IN L27737 IN L27733 Bos indicusNC005971 VN2 VN43 VN6 VN7 VN9 VN10 VN12 VN16 VN21 VN26 Bison U12946 Bison U51848 Bison U12936 Bison U12955 Bison U12959 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 Bò không u Bos taurus Bò có u Bos indicus Bò rừng Mỹ Bison bison 0.00 Hình 2: Cây phân loài di truyền 67 mẫu bò Việt Nam (VN), Hàn Quốc (KR), Nhật Bản (JP), Ấn Độ (IN), Châu Âu (EU), Châu phi (AF), mẫu bò rừng Châu Mỹ (Bison) mẫu bò có u u đối chứng tương ứng V00654, NC00597 VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 13-Tháng 8-2008 Theo tác giả Phillips (1961) Payne (1995) giống bò địa Trung Quốc Việt Nam lai tạp bò có u (Bos indicus) bò u (Bos taurus) Thực nhận định phù hợp với kết nghiên cứu quần thể bò H’mông (tỷ lệ bò có u chiếm 53,8%) kết nghiên cứu Xin Cai cs (2006) 18 giống bò địa toàn lãnh thổ Trung Quốc bò không u chủ yếu tập trung phía Bắc với tỷ lệ 81,8100% giống cho du nhập từ Mông Cổ khoảng thời gian 37663122 năm trước Công Nguyên Trong bò u chủ yếu tập trung phía Nam Trung Quốc với tỷ lệ 63,3-100% giống KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua phân tích sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể quần thể bò H’mông cho thấy tính đa dạng di truyền ADN ty thể tương đối cao Quần thể bò H’mông có nguồn gốc từ lai tạp hai dòng bò u (Bos taurus) có u (Bos indicus), tỷ lệ bò có u chiếm 53,8% Dòng bò u quần thể bò H’mông có mối quan hệ di truyền gần với bò không u Hàn Quốc, Nhật Bản (có nguồn gốc du nhập từ bò không u phía Bắc Trung Quốc) Châu Âu, dòng bò có u có mối quan hệ di truyền gần gũi với bò có u Ấn Độ Kết nghiên cứu bước đầu cung cấp chứng mức độ phân tử cho thấy phù hợp với nhận định bò Vàng Việt Nam có nguồn gốc từ bò có u Ấn Độ (Bos indicus) bò Vàng Trung Quốc u (Bos taurus) TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson, S., de Bruiji, M H., Coulson, A R., Eperon, I C., Sanger, F., and Young, I g, (1982) Complete sequence of bovine mitochondrial DNA Conserved features of the mammalian mitochondrial genome J Mol Boil 156, pp 683-717 Bradley, D G., Machugh, D E., Cunningham, P and Loftus, R T, (1996) Mitochondrial diversity and the origins of African and European cattle Poc Natl Acad Sci USA 93, pp 5131-5135 Epstein, H., (1971) The origin of domestic animals of Africa Aficana Publishing Corporation, New York Vol.1, pp 185-555 Epstein, H., and Mason, I L, (1984) Evolution of domesticated animal Edited by I L Mason Long man, New York, pp.6-27 Kim, K I., Lee, J H., Lee, S S and Yang, Y H, (2003) Phylogenetic relationships of Northeast Asian cattle to other cattle populations determined using mitochondrial DNA D-Loop sequence polymorphism Biochem Gentic 41, pp 91-98 Kuma, S., Tamura, K and Nei, M, (1994) Molecular evolutionary genetic analysis software for microcomputers Comput.Appl.Biosci 10, pp 189-191 Lê Viết Ly., Hoàng Kim Giao., Mai Văn Sánh., Võ Văn Sự., Lê Minh Sắt, (1999) Chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi Việt Nam Tập I: Phần gia súc Nhà xuất nông nghiệp, Hà nội Loftus, R T., Machugh, D E.,Bradley, D G., Sharp, P M and Cunnigham, P, (1994) Evidence for two independent domestications of cattle Proc.Natl Acad Sci USA 91, pp.2757-2761 PHẠM DOÃN LÂN – Phân tích đa dạng trình tự nucleotid ADN ty thể Machugh, D E., Shriver, M D., Loftus, R T.,Cunningham, P and Bradley, D G (1997) Microsatellite DNA variation and the evolution, domestication and phylogeography of taurine and zebu cattle (Bos Taurus and Bos indicus) Genetic 146, pp.1071-1086 Mannen, H., Tsuji, S., Loftus, R T and Bradley, D G, (1998) Mitochondrial ADN variation and evolution of Japanese black cattle (Bos taurus) Genetic 150, pp 1169-1175 Payne WJA, (1995) Diffusion of cattle throughout of Asia in tropical cattle: origins, breeds and breeding policy Black well Sciences Ltd., Oxford, pp 15-22 Phillips W, (1961) World distribution of the major types of cattle J Heredity 86, pp 248-249 Tamura, K., and Nei, M, (1993) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Mol Biol Evol 10, pp 512-526 Troy, C S., Machugh, D.E., Balley, J F., Magee, D A., Loftus, R T., Cunnigham, P., Chamberlain, A T., Sykes, B C., and Bradley, D G, (2001) Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle Nature 410, pp 1088-1091 Xin Cai., Hong Chen., Chuzhao Lei., Shan Wang., Kai Xue and Bao Zhang, (2006) mtDNA diversity and genetic lineages of eighteen cattle breeds from Bos Taurus and Bos indicus in China Genetica, DOI 10.1007/s10709-006-9129-y Người phản biện: Ths Trần Thị Thu Thủy Ths Nguyễn Thị Quỳnh Châu ... trình tự ADN ty thể cho thấy tách biệt bò Châu Âu với bò Châu Phi Trong đó, số cá thể bò đen Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần gũi với bò Châu Âu PHẠM DOÃN LÂN – Phân tích đa dạng trình tự. .. 63,3-100% giống KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua phân tích sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể quần thể bò H’mông cho thấy tính đa dạng di truyền ADN ty thể tương đối cao Quần thể bò H’mông có nguồn gốc... Phân tích trình tự Trình tự nucleotid vùng D-loop ty thể mẫu bò H’mông so sánh với trình tự mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bò rừng Mỹ (Bos binson) trình tự toàn ADN ty thể