Xác định hàm lượng allantoin củ mài {Dioscorea persÊmìlis Dioscoreaceae) sắc ký lỏng hiệu cao Trần Thị Oanh\ Nguyễn Thị Vân Anh^ Kục Khoa học công nghệ &Đào tạo - Bộ Y tế, Kònq ty cổphân Traphoco SUMMARY A simple and reliable HPLC with u v detection was reported for the determination of allantoin in (Dioscorea persimilis Dioscoreơceae) The chrom atographic separation was achieved by using a cyano column (150 X 4.6mm, Sjjm ) at 25°c Effluent was monitored Ơt215nm using a mixture ofmethanol-water (2:98) ƠS the mobile phase at Ũ flow rate of 0.2 ml/min The total run time was less than 15 The content ofollontoin in 15 real samples ranged from 1.21 to 6.18 mg/g dry weight Từkhoá:Allantoin, Củ mài, HPLC, cộtcyano Đ ặt vấn đề Củ mài gọi Hoài sơn có tên khoa học Dioscorea persimilis (Dioscoreaceae), dùng rộng rãi làm thức ăn thuốc chữa bệnh Chuyên luận "Củ mài" Dược điển Việt Nam IV quy định phận dùng rễ củ với tiêu chuẩn chất lượng yêu cầu tiêu kiểm nghiệm mô tả, bột, định tính (dựa vào soi huỳnh quang bột dược liệu, sắc ký lớp mỏng với chuẩn dược liệu Củ mài chuẩn), tạp chất, độ ẩm [ ], Đã có số nghiên cứu rằng, dược liệu chi Dioscorea có chứa lượng lớn chất có hoạt tính sinh học allantoin - dẫn chất purin [6], Allantoin có khả làm lành vết thương, bảo vệ, làm mềm da chống viêm, chống gây độc tế bào, [7] Có nhiểu nghiên cứu định lượng allantoin dịch sinh học công bố HPLC dẫn chất hóa trước cột với thuốc thử 2,4-dinitrophenylhydrazin phát bước sóng 360 nm [3], LC-MS/MS [2], GCMS [4], điện di mao quản [9] Trong đó, định lượng allantoin dược liệu chủ yếu thực phương pháp HPLC (trực tiếp) với detector u v [5-8] điện di mao quản [9] Mục tiêu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng allantoin Củ mài ứng dụng xác định hàm lượng allantoin số mẫu Củ mài thu hái tự nhiên trổng địa điểm khác số tỉnh miền Bắc Việt Nam HPLC với detector uv 82 Nghỉén cứu duợcThõng tin thuõc Số3/2014 Hóa chất, thiết bị phương pháp nghiên cứu Mơu thử 15 mẫu Củ mài thu hái tự nhiên tỉnh khác trổng vùng trổng dược liệu Công ty cổ phẩn Traphaco, chế biến theo phương pháp Dược điển Việt Nam IV, xay thành bột nửa thô, đóng gói lẩn túi polyetthylen, bảo quản nhiệt độ phòng Hóa chất, chất chuẩn Chất chuẩn: Allantoin hàm lượng 98,0% Lot: BCBG 2959, Fluka (Đức) Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho HPLC PA (Merck - Đức) Thiết bị Hệ thổng HPLC - detector uv - DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mểm Aligent Chemstation version B Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01 mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo Nhật; Nổi cách thủy WiseCircu',Tây Ban Nha Các dụng cụ thủy tinh xác Phương pháp nghiên cứu Điểu kiện sâc ký: Cột: Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, um), nhiệt độ Cột25°c Pha động: Methanol - nước (2:98) Kết cho thấy cột Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, ịjm) cho pic allantoin cân đối, tách khỏi đường rõ ràng, thời gian phân tích ngắn nên cột lựa chọn dùng nghiên cứu Thực sắc ký allantoin VỚI hệ pha động gồm: 1) dung dịch đệm phosphat 20 mM, pH 3,0; 2) methanol - nước với tỷ lệ thay đổi, methanol 10% (AC = 2%), nước từ 100 - 90%, lưu lượng dòng ml/ phút chế độ gradient lưu lượng dòng Kết cho thấy, sử dụng pha động dung dịch đệm phosphat 20 mM, pH 3,0 pic allatoin không ổn định; với hệ pha động 2, tăng tỷ lệ dung môi hữu thời gian rửa giải allantoin giảm, chưa đạt độ phân giải đường nền, tỷ lệ nước 100% thời gian phân tích dài Do đó, việc kết hợp hệ pha động chứa tỷ lệ lớn nước (98%) lưu lượng dòng pha động thấp (0,2 ml/phút) giúp cho trình tách allantoin khỏi mẫu dễ dàng với thời gian phân tích hợp lý Bước sóng phát lựa chọn bước sóng cực đại hấp thụ khỉ quét phổ hấp thụ pic allantoin sắc ký đổ dung dịch chuẩn Từ kết khảo sát thực nghiệm, lựa chọn điểu kiện sắc ký để định lượng allantoin trình bày phẩn phương pháp nghiên cứu Xử lý mâu Xử lý mẫu dược liệu Củ mài để thu dung dịch dùng cho tiêm HPLC tiến hành tương tự p =— — — nghiên cứu Kee Dong Yoon et al (2008) Sau khỉ m X (1 - R % ) X tiến hành khảo sát thực nghiệm với thời gian Trong đó: chiết thể tích nổng độ dung môi chiết (ethanol từ m: khối lượng dược liệu (g) 70 - 100%), thời gian để lạnh để lựa chọn quỵ trình R: độ ẩm dược liệu (%) xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao nhất, loại tạp C: nồng độ (|jg/nnl) allantoin dung dịch thử nhiều với thời gian xử lý ngắn Từ kết thu (dung dịch tiêm sắc ký) quy trình xử lý mẫu lựa chọn trình bày Nồng độ allantoin dung dịch thử tính phẩn phương pháp nghiên cứu (Dung dịch thử) dựa vào phương trình hổi quy thiết lập Đánh giá phương pháp ngày phân tích khoảng nổng độ allantoln Nghiên cứu tiến hành theo phương từ 12,5 -100 |ag/ml, với hệ số tương quan r > 0,999 pháp Kee Dong Yoon et al (2008) xây dựng, với vài thay đổi nhỏ Do đó, không tiến Kết nghiên cứu hành thẩm định toàn tiêu chí yêu cầu Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích xây dựng quy trình mới, mà thực thẩm định số tiêu chí nhằm đánh giá giá trị sửdụng Khảo sát lựa chọn điều kiện sác ký Dựa vào kết nghiên cứu định lượng phương pháp, bao gồm tính chọn lọQ khoảng nồng allantoin HPLC công bố [5, 6, 8], tiến hành độ tuyến tính (sử dụng để tính kết định lượng khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp mẫu thực), độ xác Tính chọn lọc khả thi Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu trắng (cô cách - Tiến hành khảo sát cột sắc ký nhồi pha tĩnh octadecyl (C18), cyano (-CN) hãng khác nhau, thủy tới cắn ml ethanol 95%, hòa cắn vừa đủ bao gồm Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm, ịiiTi), Hypersil ml nước, lọc qua màng lọc 0,22 |am), dung dịch chuẩn C18 BDS (250 X 4,6 mm, laỉTì), Zorbax Eclip C18 (150 X allantoin, dung dịch thử từ mẫu dược liệu Củ mài 3,9 mm, 3,5 |im) Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, |jm) (CM1 ) Kết trình bày hình Detector: u v 215 nm Thể tích tiêm mẫu:5 |il Tốc độ dòng: 0,2 ml/ phút Chuẩn bị dung dịch: Dung dịch chuẩn gốc: cân xác lượng chất chuẩn tương đương khoảng 25 mg allantoin cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan vừa đủ thể tích nước Dung dịch chuẩn làm việc Pha loãng xác thể tích dung dịch chuẩn nước để dãy dung dịch chuẩn có nồng độ allantoin 12,5 - 25 - 50 -75-100 |jg/ml Dung dịch thử: Cân xác khoảng 2,0 g bột dược liệu (có độ ẩm R %), cho vào bình nón, thêm khoảng ml nưỚQ lắc nhẹ tạo thành hỗn dịch Thêm 50 ml ethanol 95%, đậy giấy nhôm Siêu âm 30 phút nhiệt độ phòng Bảo quản 4°c qua đêm (15 giờ) Lọc qua giấy lọc băng xanh Rửa bình nón giấy lọc lần lần với ml ethanol 95% Tập trung dịch rửa dịch lọQ cô cách thủy khoảng 60°c tới cắn Hòa tan cắn xác 10 ml nước (siêu âm 15 phút) Ly tâm dung dịch thu °c tốc độ 10000 vòng/phút 15 phút Lấy 1,00 ml dịch trong, cho vào bình định mức 20 ml, thêm nước vừa đủ Lắc đểu Lọc qua màng 0,22 |jm Hàm lượng Allantoin p (mg/g) dược liệu tính theo dược liệu khô tính theo công thức: ĩĩlAU 25 9 Aíỉantoỉn 20 15 10 (a) 10 12 14 m in (b) mAU 25 20 15 9 Allantoin 10 10 12 14 m in (c) tỉinh l Sâc ký đổ mẫu: ũ mẫu trâng; b ũllQíìĩoin chuổn; c Củ mòi (CM1) Kết hình cho thấy thời gian lưu pic sắc đổ dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu pic allantion dung dịch mẫu chuẩn (9,59 phút) sắc ký đổ mẫu trắng không xuất pic khoảng 8-11 phút Như phương pháp có tính chọn lọc cao Tính thích hợp hệ thống xác định dựa vào độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic thời gian lưu allantoin sắc ký lán liên tiếp dung dịch chuẩn allantoin nồng độ 50 |ig/ml Kết cho thấy RSD diện tích pic thời gian lưu pic allantoin lẩn lượt 1,38% 1,06% (n = 6) thấp 2,0%, hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng allantoin Khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp xác định dựa mối tương quan hổi quy nồng độ allantoin diện tích pic allantoln khoảng nồng độ khảo sát 12,5 -100 |jg/ml Kết trình bày bảng sau: Bỏng Kết quở khỏo sát khoáng nông độ tuyến tính Nỗng độ allantoin (ng/ml) 12,5 25 50 75 100 Diện tích pic (mAU giây) 63,8 124,3 263,1 391,1 517,7 Phương trình hổi quy; y = 5,222 X -2,1524 Hệ số tương quan: r = 0,9998 Độ xác phương pháp đánh giá dựa vào phân tán số liệu (RSD) tiến hành phân tích lẩn riêng biệt ngày mẫu bột dược liệu Củ mài (CM l) theo quy trình Kết cho thấy hàm lượng allantoin mẫu thử có giá trị trung bình 3,91 mg/g tính theo dược liệu khô với RSD = 2,93% (n = 6) ứng dụng Tiến hành định lượng allantoin mẫu nghiên cứu gồm mẫu Củ mài thu hái tự nhiên, mẫu Củ mài trổng Xử lý mẫu tiến hành sắc ký Tính kết dựa vào đường chuẩn xây dựng ngày phân tích với hệ số tương quan không nhỏ 0,999 Kết trình bày hình bảng mẵSS 25f 2ữ 15 9.5 lơ s lA lla n t o i» ữ ỉ CM ỉ ĩõ Ỉ2 ĩĩliiii CM2 CMS CM4 ■lUĩ mm 25 25 B 20 IS 20 ÌAIcmtoln 9.59S AtoiToín 15 10 lỉl 5 0 10 12 14 « in é i CM6 CMS mãXỊ 25 2Ũ 15 9.S91 ịMgx^oin 10 0 i 10 12 14 « i n CM7 CMS mm^ 25 20 ^ 15 ẳAlonAain to s G _ CM9 Hình Sâckỷđổcủomộtsổmẫuữmũi 1) thuhóitựnhiên (CMl, m i (M ì, CM4, CMS, CMS) 2)tm gm 7,CM 8,CM 9,CM W ) CM10 lỡ 12 14 wăM Bảng3 KếtquảhàmlượngQllantoinữongcácmẫuCủmài (n=3) Củ mài thu hái tự nhiên TT Tên mẫu Độ ẩm (%) P(mg/g) CM1 6,10 3,91 CM2 6,32 6,00 CM3 7,07 4,54 CM4 7,24 4,83 CMS 7,76 6,18 CM6 9,35 5,78 CM7 7,08 3,21 CM8 6,79 4,26 CM9 7,25 4,78 10 CM10 6,87 3,77 11 CM11 7,44 1,21 12 CM12 6,56 1,55 13 CM13 6,75 5,36 14 CM14 7,00 3,22 15 CM15 7,21 5,48 Củ mài trổng P: Hàmlượngallantoin(mg/g) tínhtheodượcliệukhô Bàn luận Xu hướng ứng dụng phương pháp phân tích đại (quang phổ, HPLC, G C , ) để tiêu chuẩn hóa dược liệu chế phẩm từ dược liệu với chất đánh dấu có hoạt tính sinh học nhằm đánh giá góp phẩn kiểm soát chất lượng dược liệu Phương pháp HPLC định lượng allantoin Củ mài xây dựng đơn giản cẩn sử dụng thiết bị HPLC detector u v loại detector phổ biến phòng phân tích, có tính chọn lọc cao (pic allantoin tách khỏi pic cản trở, cân đối), xác (RSD = 2,93% với n = 6), khoảng nổng độ tuyến tính rộng (khoảng nổng độ 12,5 -100 |jg/ml với r > 0,999), kinh tế (pha động phẩn lớn là; nước 98%; cột sắc ký loại thông thường: cyano) với thời gian phân tích hợp lý (15 phút) Phân tích allantoin HPLC dùng cột tách với pha tĩnh C18 cyano, dùng cột C18 hệ pha động dùng dung dịch acid formic [8] đệm phosphat [5] với tỷ lệ dung môi hữu khoảng 30%, dùng cột cyano pha động đơn giản nước với tỷ lệ nhỏ acetonitril (2 %) [7] allantoin chất phân cực nên sử dụng pha tĩnh phân cực (cyano) cho kết tốt So với nghiên cứu Kee Dong Yoon et al [7], điểu kiện phân tích có thay đổi, pha động tác giả dùng dung môi hữu acetonitril nghiên cứu dùng methanol chế độ dòng pha động đẳng dòng tác giả chế độ gradient lưu lượng dòng pha động; đồng thời thể tích tiêm mẫu giảm lần (5 |al so với 20 |il tác giả) phát bước sóng thấp 215 nm đường nển ổn định cho phép tách tốt allantoin khỏi mẫu với thời gian phân tích hợp lý Chuyên luận "Củ mài" Dược điển Việt Nam IV [1 ] chưa để cập tới tiêu định lượng, allantoin hoạt chất có hoạt tính sinh học với hàm lượng tương đối lớn dược liệu thuộc chi Dioscorea [6] Do đó, kết nghiên cứu góp phán cung cấp quy trình phân tích định lượng hoạt chất Củ mài nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hàm lượng allantoin Củ mài từ nguồn khác thu hái tự nhiên tỉnh khác trồng địa điểm có dao động khoảng từ 1,21 - 6,18 mg/g Trong đó, mức độ dao động hàm lượng allantoin mẫu Củ mài trổng thu hái tự nhiên mẫu nghiên cứu tương đương nhau; nhiên hàm lượng hoạt chất mẫu trổng thấp so với nguồn thu hái tự nhiêa kết cụ thể biểu thị hàm lượng trung bình ± RSD mẫu dược liệu có nguồn gốc tự nhiên trồng lán lượt 5,21 mg/g ± 17,5% với n = 6; 3,65 mg/g ± 41,9% với n = Kết cho thấy tiêu chuẩn hóa dược liệu Củ mài dựa vào hàm lượng allantoin nhằm kiểm soát chất lượng nguyên liệu đẩu vào trình sản xuất đảm bảo ổn định chất lượng sản phẩm Kết luận Phương pháp HPLC định lượng allantoin Củ mài có tính chọn lọc cao, độ xác đảm bảo, khoảng tuyến tính rộng phù hợp với điểu kiện thiết bị phòng phân tích phương pháp có tính ứng dụng cao Hàm lượng allantoin 15 mẫu Củ mài có nguồn gốc tự nhiên (tại tỉnh khác nhau) trổng dao động khoảng từ 1,21 - 6,18 mg/g, sử dụng tiêu định lượng allatoin để kiểm soát chất lượng dược liệu kiểm soát quy trình trồng trọt TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr 730-731 Antoine Berthemy, John Newton, Danlin Wu, Deborah Buhrman (1999), Quantitative determination of an extremely polar compound allantoin in human urine by LC-MS/MS based on the separation on a polymeric amino column, of Phormaceutical and Biomedical Analysis, 19, pp 429-434 Chen XB, Kyle DJ, Orskov ER (1993), Measurement of allantoin in urine and plasma by high-performance liquid chromatography with pre-column derivatization, C/iro/T?ứfògr 11; 617(2), pp 241-247 X.B.Chen, A.G.Calder, P.Prasitkusol, DJ.Kyleand M.CNJayasuriyat(1998), Determination of Isotopic Enrichment and Concentrations of Allantoin and Uric Acid in Urine by Gas Chromatography/Mass Spectrometry, J of mass spectrometry, vol 33, pp 130-137 Ghasem Haghi *, Rohollah Arshi and Alireza Safaei (2008), Improved High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for Qualitative and Quantitative Analysis of Allantoin in Zea maysJ.Agric FoodChem., 56 (4), pp 1205-1209 Kee Dong Yoon, Min-Hye Yang, Young-Won Chin, Ju Hyun Park, and Jinwoong Kim (2008), Determination of Allantoin in Dioscoreo Rhizoma by High Performance Liquid Chromatography Using Cyano Columns, Natural Product Sciences, 14(4), pp 254-259 Kiran Kumar M and Sitaram B (2013), Biological activities, HPLC and NMR of Blepharis Glomerans, InternơtionaUournal of Biological & Pharmaceutical Research, 4(6), pp 437-440 Thermo Fisher Scientific Inc (2010), Thermo Scientific Syncronis HILICHPLC Columns Zhang, u Liu, Y., and Chen, G., (2004), Simultaneous determination of allantoin, choline and arginine inRhizoma Dioscoreae by capillary electrophoresis.-/ Chromơtogr A, 1043, pp 317-312  ... cứu góp phán cung cấp quy trình phân tích định lượng hoạt chất Củ mài nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hàm lượng allantoin Củ mài từ nguồn khác thu hái tự nhiên tỉnh khác... lượng allantoin nhằm kiểm soát chất lượng nguyên liệu đẩu vào trình sản xuất đảm bảo ổn định chất lượng sản phẩm Kết luận Phương pháp HPLC định lượng allantoin Củ mài có tính chọn lọc cao, độ xác. .. lưu pic allantoin lẩn lượt 1,38% 1,06% (n = 6) thấp 2,0%, hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng allantoin Khoảng nồng độ tuyến tính phương pháp xác định dựa mối tương quan hổi quy nồng độ allantoin