ầ ứng dụng toán hóa để định lượng hỗn hợp cloramphenicol, dexamethason naphazolin quang phổ tử ngoại Vũ Đặng Hoàng Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY Chemometrics (Le Classical Least Squares and Inverse Least Squares) were proposed for possible spectrophotometric quantification of ternary mixtures These chemometrics-assisted u v spectrophotometric methods were successfully oppiied to real samples containing chlommphenicol - dexomethasone - naphazoline These spectrophotometric methods were also statistically comparable to the manufacturer's HPLC in terms of accuracy and precision Từ khóa: toán hóa, quang phổ tử ngoại, hỗn hợp đa thành phân Đ ặt vấn đề Định lượng thuốc đa thành phán quang phổ UV-VIS thường gặp nhiểu khó khán đan xen dải phổ thành phẩn Để khắc phục nhược điểm này, nghiên cứu ứng dụng thuật toán xử lý phổ hấp thụ Việt Nam triển khai từ thập niên 1990 kỷ XX [3] Tuy nhiên, hầu hết công trình công bố đểu sử dụng thuật toán đạo hàm để định lượng chế phẩm hai thành phẩn [2] Việc ứng dụng phân tích đa biến (multivariate analỵsis) lĩnh vực phân tích dược khiêm tốn [4] Đây điều khác biệt với xu hướng giới: kết hợp toán hóa (chemometrics) phân tích phổ để định lượng hỗn hợp hai [7], ba [6], bốn [8] thành phần ngày phát triển Mục tiêu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng thời ba thành phần cloramphenicol, dexamethason naphazolin thuốc nhỏ mắt Collydexa cách kết hợp toán hóa (CLS ILS) phép đo quang phổ tử ngoại Cloramphenicol, CLO (99,2%), dexamethason natri phosphat, DEX (99,6%) naphazolin nitrat, NAP (99,8%) Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp Nước cất sử dụng làm dung môi Trang thiết bị Máy quang phổ hai chùm tia Unicam u v 300 (ThermoSpectronic) kết nối với máy tính (chạy hệ điểu hành Windows XP) với phẩn mểm chuyên dụng Vision 32 với chế độ đo: - Start Lambda: 200 nm - Stop Lambda: 300 nm - Data Mode: Absorbance - Band width: 1,5 nm - Scan Speed: Intelliscan nm/min - Data Interval: Very high resolution Xử lý số liệu tiến hành phần mềm MATLAB 2013a (Mathworks) Phương pháp nghiên cứu Giả sử hỗn hợp cẩn phân tích có k cấu tử X^), tín hiệu phân tích hỗn hợp y phương trình hổi quy đa biến mô tả quan hệ y biến X (i=1,2 ,3 k ) có dạng: Nguyên liệu phương pháp Đối tượng nghiên cứu Thuốc nhỏ mắt Collydexa (Công Ty cổ Phán Dược phẩm Hà Nội) số lô 370711 có công thức: cloramphenicol 0,02 g + dexamethason natri phosphat 0,005 g + naphazolỉn nỉtrat 0,0025 g + vitamin B2 0,0002 g + tá dược vừa đủ ml Chất đối chiếu, dung môi, trang thiết bị Chất đối chiếu dung môi mặt lý thuyết để tìm nồng độ k cấu tử cắn có k phương trình hổi quy Vì thực tế cần tiến hành m thí nghiệm (m > k) với m dung dịch chuẩn hỗn hợp lập m phương trình hổi quy đa biến Dạng tổng quát hệ phương trình sau: y = a + Xb Trong đó: b vectơ chứa hệ số phương trình hổi quy y vectơ cột chứa m giá trị y , y X ma trận có m hàng (ứng với m quan sát) k cột (ứng với k biến) yi X i, yz x = y= '-21 -^22 X.2k ''mk yn tín hiệu đo ứng với thí nghiệm có nhiều giá trị (ví dụ đo độ hấp thụ quang dung dịch chuẩn hỗn hợp p bước sóng thay bước sóng) số liệu Y ma trận có m dòng p cột (y ) sau: Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (Inverse Least Squares - ILS) Phương pháp gọi ma trận p (P matrix) Phương pháp giả thiết nồng độ chất phân tích hàm tín hiệu phân tích theo phương trình: x = y.p + e -Trong phương pháp này, hệ số p phương trình hổi quỵ thành phẩn ma trận (m X k) tính theo phương pháp bình phương tối thiểu suy rộng: p = [Ýyì^ y^x -Việc phân tích nồng độ chất chưa biết (Xq) thực cách nhân trực tiếp giá trị tín hiệu đo Yq dung dịch cần phân tích với p x„ = yo-P ' >^11 >^12 y^p >^21 3^22 y2p ym\ ym2 mp Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (Classical Least Squares - CIS) Phương pháp gọi ma trận K (K-matrix) -Từ d ạn g tổ n g q u áty = XK + e (1) Với y vectơ (m X 1) ; X ma trận (m X k) e vectơ số d (m x ) K vectơ hệ số phương trình hổi quy dạng hàm (k Xl) y vectơ cột biểu diễn tín hiệu đo dung dịch chuẩn; K ma trận (k X p) ỵ số liệu dạng ma trận (m X p) biểu diễn tín hiệu dung dịch chuẩn đo nhiều thời điểm (ví dụ đo độ hấp thụ quang p bước sóng) - Nếu có giá trị nhập vào biến độc lập X biến phụ thuộc y tính giá trị hệ số Theo phương pháp bình phương tối thiểu, ma trận hệ số K tính nhưsau: K=(X^X)-^XV (2 ) Với ma trận chuyển vị X (transpose to matrix) - Với mẫu chưa biết cần tìm giá trị \ từ giá trị Yq ta c ó : = (3) Với ma trận chuyển vị K Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn gốc CLO, DEX NAP 1000 mg/l pha nước Các dung dịch hỗn hợp chuẩn (CLO + DEX + NAP) đểu pha từ dung dịch gốc thành phẩn Dung dịch thử có nồng độ khoảng CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP mg/l Kết nghiên cứu Đổ thị biểu diễn phổ hấp thụ dung dịch chuẩn chế phẩm có nồng độ tương ứng (hình ) cho thấy CLO 40 mg/l có khả hấp thụ ánh sáng mạnh với cực đại hấp thụ 278,8 nm, dẫn đến chồng phổ DEX 10 mg/l (cực đại hấp thụ 242,2 nm) NAP mg/l (cực đại hấp thụ 220,9 nm) khoảng bước sóng 200 - 300 nm Hình dạng phổ dung dịch chế phẩm Collydexa, phổ hỗn hợp phổ cộng dung dịch có nồng độ tương ứng (CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP mg/l + vitamin B2 0,4 mg/l) có tương đồng khoảng 225 300 nm Giả thiết lô thuốc kiểm tra đạt tiêu hàm lượng so với nhăn, nhận thấy có mặt vitamin B2 tá dược khác nển mẫu thuốc nhỏ mắt không gây ảnh hưởng đáng kể đến phổ hấp thụ hỗn hợp ba thành phần (CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP mg/l) Với thuật toán CLS, khoảng bước sóng 225 - 300 nm (AẦ = nm) đâ lựa chọn cho phép định lượng Mặt khác, bước sóng (225, 230, 235, 238, 240, 245, 260, 280 nm) lựa chọn cho thuật toán ILS Bước sóng (nm) H^inh Phổ hấp thụ củơ CLO 40 mg/l DEX10 mg/l NAP mg/l; phổ hỗn hợp (CLO 40 mg/l + DEX10 mg/l + NAP mg/l); phổ cộng phổ thònh phán (CLO 40 mg/l DEX10 mg/l vờ NAP mg/l) vờ phổcủo chẽphđiĩì Collỵdexũ có nông độ tương ứng Bảng biểu diễn dung dịch hỗn hợp chuẩn sửdụng cho phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp với hai thuật toán CLS ILS Sử dụng phần mểm MATLAB để xác định giá trị ma trận hệ số tương ứng để tính nồng độ thành phần hỗn hợp biết giá trị độ hấp thụ Ví dụ bước sóng 238 nm, hệ số K thuật toán CLS Trong nghiên cứu này, phương pháp HPLC nhà sản xuất sử dụng làm phương pháp đối chiếu (hình 3) Kết định lượng chế phẩm Collydexa phương pháp quang phổ HPLC trình bày bảng Kiểm định thống kê ANOVA (so sánh giá trị trung bình) Bartlett (so sánh phương sai) 0.0103] hệ số p thuật toán ILS [51,9426 phương pháp quang phổ HPLC nhà 12,7154 63527] Có thể nhận thấy hai phương pháp quang phổ có độ đúng: 98 -101% độ lặp RSD < % sản xuất định lượng CLO, DEX NAP chế 0.0308 0.0112 phẩm cho thấy khác biệt ý nghĩa thống kê với mức tin cậy 95% Bỏng Các dung dịch hỗn hợp chuổn %tìm lại Nồng độ (mg/L) STT CLO DEX ILS CLS NAP CLO DEX NAP CLO DEX NAP 98,6 101,5 98,5 99,1 30 100,9 99,1 50 101,7 99,0 97,7 102,3 99,3 98,7 30 12 101,3 98,3 98,3 102,1 99,1 98,6 50 12 99,1 97,9 99,3 100,6 98,3 99,2 30 98,7 98,6 99,0 100,9 97,6 99,8 97,9 100,9 99,2 98,6 99,4 99,1 99,3 50 99,6 100,4 30 12 102,1 100,3 98,2 50 12 101,8 99,5 98,5 98,9 100,1 99,4 40 10 100,6 99,0 97,9 101,0 100,0 97,0 10 40 10 100,8 99,8 98,3 100,7 100,6 97,6 11 40 10 100,3 101,0 99,5 100,8 99,9 98,4 Trung bình 100,6 99,4 98,4 100,8 99,2 98,7 RSD(%) 1,1 0,9 0,6 1,0 0,9 0,8 Bỏng Kết định lượng thuốc nhỏ mât Collỵdexũ % so vởi nhãn (trung bình ± SD, n = 6) Phương pháp CLO DEX NAP CLS 99,5 ±1,9 105,0 ±1,8 95,8 ±1,9 ILS 99,7 ±1,8 104,9 ±1,8 95,6 ±1,5 98,8 ±1,1 104,3 ±0,8 96,6 ±0,8 HPLC Hình Sắc kỷ đổ rủo giỏi Collỵdexo để định lượng CLO DEX Điểu kiện sđc kỷ: động: Methũnol - dung dịch KHfO^ 0,02 M (50:50); cột c 18 (5 Ịjm ; 4,6 X 150 ĩĩìm); bước sóng phát 254 nm; tổc độ dòng: lỉĩìl/phúĩ; thể tích tiêm mẫu 20 ụl MWOI0 siỊ-m, tern-m m ịcmỊmxềHìệmmmm Hình Sắc ký đổ rửo giỏi củơ Collỵdexo đế định lượng NAf! Điểu kiện sác kỷ: động: Methũĩiol - dung dịch đệm NH4N03 pH 9,5 (93:7); cột Silicơ (5 ụm; 4,6 X 150 mm); bước sóng phát 265 nm; tốc độ dòng: 1ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 ụl Bàn luận Hỗn hợp ba thành phẩn CLO, DEX NAP chọn ví dụ điển hình có chổng phổ rõ rệt vùng ánh sáng tử ngoại (hình ) Do vậy, tiến hành định lượng riêng thành phán hỗn hợp dựa phương pháp quang phổ trỵền thống Để định lượng thời hỗn hợp này, phương pháp đạo hàm tỉ đối [ ] HPLC [5] nghiên cứu Trong nghiên cứu này, hai thuật toán CLS ILS, đề xuất cho phép xử lý phổ hấp thụ hỗn hợp đa thành phần tiến hành với phẩn mềm xử lý số liệu MATLAB (MathVVorks) Đây phẩn mềm ứng dụng vào nhiểu lĩnh vực kỹ thuật liên quan đến tính toán nhờ khả tích hợp tính toán, hiển thị lập trình môi trường dễ sử dụng liên kết với chương trình máy tính viết nhiều ngôn ngữ lập trình khác Với phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp với toán hoá (CLS, ILS), việc lựa chọn ma trận nồng độ bước sóng định lượng yếu tố ảnh hưởng đến độ xác kết định lượng Vì hổn hợp CLO, DEX NAP (có nồng độ tương đương với mẫu thử) có cộng tính ánh sáng khoảng bước sóng 225 - 300 nm, nên dải bước sóng (AX = nm) sử dụng cho phép định lượng thuật toán CLS Phương pháp ghi tín hiệu phân tích dạng ma trận nên gọi phân tích toàn phổ CLS có độ xác cao số bước sóng sử dụng tăng lên Ngược lại, với thuật toán ILS tín hiệu mẫu phân tích phải ghi số bước sóng mà phản ánh đẩy đủ tín hiệu tất chất hỗn hợp Vì ma trận hệ số p tính theo thuật toán ILS ma trận nghịch đảo nên kích thước ma trận phải số bước sóng sử dụng phải nhỏ số dung dịch chuẩn đem dùng Do vậy, bước sóng (225, 230, 235, 238, 240, 245, 260, 280 nm) lựa chọn cho thuật toán ILS Ma trận nổng độ quy định giá trị nồng độ trung tâm giá trị tuỳ biến X Giá trị nồng độ trung tâm lựa chọn cho độ cộng tính phổ hấp thụ tốt Ma trận nổng độ xây dựng với giá trị nồng độ trung tâm tương ứng với nồng độ mẫu thử (CLO 40 mg/l + DEX 10 mg/l + NAP mg/l) Các giá trị X có nồng độ khoảng ± (20 - 25%) X nồng độ trung tâm lô thuốc lưu hành thị trường thường có nồng độ biến thiên khoảng giá trị số lượng dung dịch hỗn hợp chuẩn xác định theo mô hình toán học thiết kế đầy đủ - mức (full factorial design - levels) với mục đích thu tối đa thông tin hỗn hợp ba thành phẩn CLO + DEX + NAP với số lượng dung dịch chuẩn Kết tìm lại nồng độ dung dịch ma trận nồng độ (bảng ) cho thấy hai thuật toán CLS ILS có độ xác cao Điểu chứng tỏ tính phù hợp ma trận nồng độ lựa chọn Kết kiểm tra tính thích hợp hai thuật toán CLS ILS cho thấy phương pháp quang phổ có độ xác cao: độ lặp (RSD < 2%) độ (99 -101%) (bảng 4) Hai phương pháp quang phổ ứng dụng để định lượng thời CLO, DEX NAP chế phẩm Collydexa; có sử dụng phương pháp HPLC nhà sản xuất làm phương pháp đối chiếu (bảng 2) Kiểm định thống kê xác nhận khác biệt vể độ lặp (Bartlett) độ (ANOVA) áp dụng hai phương pháp quang phổ HPLC để định lượng thời CLO, DEX NAP chế phẩm Collydexa Điểu cho thấy độ xác phương pháp quang phổ không bị ảnh hưởng có mặt chất khác thành phẩn thuốc nhỏ mắt Collydexa Kết luận Nghiên cứu cho thấy định lượng đồng thời cách xác hoạt chất hỗn hợp ba thành phần CLO, DEX NAP kết hợp toán hóa (CLS ILS) với quang phổ tử ngoại Các phương pháp quang phổ xây dựng có khả thay HPLC nhà sản xuất kiểm nghiệm thường qui chế phẩm Collỵdexa Lời cảm ơn Nghiên cứu thực để tài số 104.07-2012.58 Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia Việt Nam (NAPOSTED) tài trợ TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Trần Phương Hồng, Trịnh Văn Quỳ (2000), Định lượng cloramphenicol,dexamethason natri photphat naphazolin nitrat thuốc nhỏ mắt Collydexa quang phổ tử ngoại đạo hàm tỷ đối, Kỷyếu Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, tr 148-152 Vũ Đặng Hoàng (2013),Tổng quan ứng dụng quang phổ đạo hàm định lượng thuốc đa thành phần Phẩn 2: Các phương pháp định lượng hỗn hợp đa thành phần quang phổ đạo hàm, Tạp chí Dược học, số 53, tr 2-7 Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Quỳ (1997), Phương pháp định lượng toàn phổ FSQ (Full spectrum Quantitation) phân tích đa cấu tử máy quang phổ uv - VIS Beckman DUR - series Thông báo Kiểm nghiệm số2 Thái Duy Thìn (2003 - 2005), Nghiên cứu phương pháp quang phổ HPLC để định lượng thuốc từ - thành phẩn, Đề tài cấp BỘYtế Huỳnh Kim Thoa, Võ Thị Thu Thủy (1998), Định lượng nhanh đồng thời dexamethason, chloramphenicol naphazolin số chế phẩm thuốc nhỏ mắt phương pháp HPLC, Tạp chí Dược học, số 6, tr 20-23 Alberto J.N., Patricia C.D., Alejandro CO (2003), Chemometrics assisted spectroscopic determination of vitamin B6, vitamin B12 and dexamethasone in injectables, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 31, pp 621-627 Erdal D., Dumitru B., FerdiT (2008), Simple mathematical resolution for binary mixture of oxfendazole and oxyclozanide in bolus by bivariate and multivariate calibrations based on the linear regression functions, Revue Roumoine de Chimie, vol 53, pp 303-312 López-de-Alba RL, Lopez-Martinez u Cerda V., Amador-Hernandez J (2006), Simultaneous determination and classification of riboflavin, thiamine, nicotinamide and pyridoxine in pharmaceutical formulations, by UV-Visible spectrophotometry and multivariate analysis, Journal of the Brozilian Chemical Society, vol 17, pp 715-722 I Nghiên Cứu dược Thong tin thuoc I So 3/2014 ... tương ứng Bảng biểu diễn dung dịch hỗn hợp chuẩn s dụng cho phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp với hai thuật toán CLS ILS Sử dụng phần mểm MATLAB để xác định giá trị ma trận hệ số tương ứng để. .. 148-152 Vũ Đặng Hoàng (2013),Tổng quan ứng dụng quang phổ đạo hàm định lượng thuốc đa thành phần Phẩn 2: Các phương pháp định lượng hỗn hợp đa thành phần quang phổ đạo hàm, Tạp chí Dược học, số 53,... khác Với phương pháp quang phổ tử ngoại kết hợp với toán hoá (CLS, ILS), việc lựa chọn ma trận nồng độ bước sóng định lượng yếu tố ảnh hưởng đến độ xác kết định lượng Vì hổn hợp CLO, DEX NAP (có