Nghiên cứu định lượng neomycin sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ huỳnh quang tạo dẫn xuất trước cột với - íluorenylmethyl cloroíorm Trần Thị Oanh*, Nguyễn Thị Kim Thanh** *Cục Khoa học Công nghệ Đào tạo, Bộ Ỵ tế **Học viên cao học khoớ 14, Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY A pre-column derivatization procedure using -fluorenylmethyl chloroform and fluorescence detection has been developed for HPLC analysis o f neomycin sulfate in eye drops, nasal drops and nasal spray formulations Neomycin was separated using a Hypersil BDS column (250 x 4.6 mm; Ịjm) The composition o f mobile phase was acetonitrile - water (85:15 v/v) at flow rate o f 1.5 ml/ Fluorescence measurements were carried out at the excitation - emission wavelengths o f 268 nm and 315 nm, respectively The method was shown to be linear, specific and reproducible Từkhoá: Neomycin, HPLC, detectơ huỳnh quang, FMOC, dân chất hoá trước cột Đặt vấn đề Nguyên vật liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu Neomycin (NEO) kháng sinh thuộc nhóm aminosid, có phổ rộng vi khuẩn Gram (-) Gram (+) [2] Cũng kháng sinh khác nhóm, neomycin không hấp thụ quang vùng tử ngoại - khả kiến phương pháp định lượng phổ biến phương pháp vi sinh vật [1 ], [7] Phương pháp nhiều thời gian làm chậm trình sản xuất (cẩn kiểm tra bán thành phẩm Mầu thử - Chế phẩm thử: Thuốc nhỏ mắt Neo - Dexa SDK: VD-3392-07, SKS: 016111 Dung dịch nhỏ mắt Nemydexan SDK: VD-8338-09, SKS: 12102 Dung dịch xịt mũi Alaka SDK: VD-13127-10, SKS: 040212 Dung dịch xịt mũi Dophazolin SKS: VD-13129-10, trình sản xuất) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với khả tách, định tính, định SKS: 0190911 - Mẫu placebo gồm: Dexamethason natri phosphate 5,50 mg; Thiomersal: 6,25 mg; lượng đồng thời nhiều chất phân tích có cấu trúc Xylometazolin hydroclorid 2,5 mg; Dung dịch đệm tính chất đa dạng ứng dụng, phát borat vừa đủ ml triển nhằm nâng cao khả kiểm tra chất lượng thuốc đáp ứng nhanh chóng yêu cẩu vể thời gian cho nhà sản xuất Bài báo trình bày kết nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp định lượng NEO dung dịch HPLC nhằm góp phán kiểm Hóa chất - dung môi - Chất đối chiếu Neomycin sulphat Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh (SDK: QT051 060111) Hàm lượng 648,7 Ul/mg nguyên trạng - Acetonitril (MeCN) tinh khiết HPLC Merck, Đ ức soát chất lượng chế phẩm chứa NEO, đặc biệt - Natri tetra borat (Na^Bp^ 10 HjO), glỵcin, - giai đoạn đòi hỏi vể thời gian kiểm tra bán fluorenylmethyl cloroform (FMOC - Cl) tinh khiết thành phẩm trình sản xuất (in-process) phân tích Merck, Đức Thiết bị nghiên cứu Hệ thống HPLC - detectơ huỳnh quang Agilent 1260 Infinitive, phẩn mểm Aligent Chemstation version B, Mỹ Cân phân tích Mettler Toledo (d = 0,01 mg), Thụy Sĩ Máy đo pH Eutech instrument pHI 50, Mỹ Phương pháp nghiên cứu Điều kiện sốc ký; - Cột sắc ký: Hypersil C18 BDS (250 X 4,6 mm; 5|am), nhiệt độ 25°c - Pha động: MeCN : nước (85 ; 15) - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: |jl - Phát hiện: Detectơ huỳnh quang bước sóng kích thích/phát xạ (Ex/Em) 268 nm/315 nm Tinh toán: - Hàm lượng (%) neomycin Sulfat chế phẩm Chuẩn bị dung dịch: so với lượng ghi nhãn tính theo công thức: - Dung dịch đệm borat pH 9,0: Hoà tan pha loãng 0,10 g Na^Bp^ 10 HjO 450 ml nước Điều chỉnh pH đến 9,0 dung dịch HCI 0,1 M, thêm nước vừa đủ 500 ml, lắc - Dung dịch Glycin: Hoà tan 0,75 g Glycin X X X 648,7 Sc x V , x P xioo Trong đó: vừa đủ ml nước - Dung dịch FMOC - Ch Hòa tan 24 mg FMOC - Cl S^, S^: Tổng diện tích pic neomycin Sulfat sắc ký đổ dung dịch thử dung dịch MeCN vừa đủ 100 ml chuẩn (LU.s) m^: Khối lượng neomycin Sulfat chuẩn (mg) - Dung dịch chuẩn g ố c Cân xác chất đối chiếu neomycin sulfat tương ứng khoảng 3250 UI, cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan định mức đến vạch dung dịch đệm borat v^; thể tích đóng gói thử (ml) - Dung dịch chuẩn: Lấy xác ml dung dịch chuẩn gốc, cho vào bình định mức 0 ml, P: hàm lượng neomycin Sulfat ghi nhãn lọ dung dịch chế phẩm thử (IU) thêm dung dịch đệm borat đến vạch, lắc đểu Các sổ liệu thống kê tính toán dựa vào phẩn mềm Excel Lấy 1,00 ml dung dịch này, cho vào ống nghiệm lọ dung dịch chế phẩm V^: thể tích mẫu thử chuẩn bị dung dịch thử (ml) nút xoáy, thêm 0,50 ml dung dịch FMOC - Cl (24 mg/ml), lắc xoáy phút Để 15 phút Sau đó, thêm 50,0 |jl dung dịch Glycin (75 mg/ml), lắc xoáy 30 giây Lọc dung dịch thu qua màng lọc 0,45 ụm dung dịch tiêm sắc ký Dung dịch sau chuẩn bị phải sắc ký vòng 60 phút - Dung dịch thử: Lấy xác lượng chế phẩm (tương đương với khoảng 3250 UI neomycin sulfat vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch đệm borat vừa đủ đến vạch, lắc Lấy xác Kết bàn luận Khảo sát lựa chọn điểu kiện phán tích -Xử lý mẫu: Neomycin có chứa nhóm amin bậc nên thực phản ứng dẫn chất hoá với số thuốc thử để tạo sản phẩm có khả hấp thụ bước sóng ngắn phát huỳnh quang bước sóng dài [1], [7] Tuy nhiên, để tiến hành hệ HPLC với detecto huỳnh quang dẫn xuất hoá sau cột, FMOC - Cl 5,00 ml dung dịch cho vào bình định mức 100 lựa chọn làm thuốc thử nghiên cứu Dựa ml, thêm dung dịch đệm borat đến vạch, lắc đểu điểu kiện thực phản ứng tạo dẫn xuất Lấy 1,00 ml dung dịch này, cho vào ống nghiệm nút với thuốc thử FMOC - Cl tác giả D Stead, R.M.E xoáy tiếp tục tiến hành chuẩn bị Richards [5], tiến hành đánh giá thông số phản dung dịch chuẩn - Dung dịch placebo: Chuẩn bị từ mẫu placebo dung dịch th ứng bao gổm nổng độ dung dịch NEO, lượng thuốc thử FMOC - Cl, thời gian thực phản ứng, lượng dung dịch glycin cho vào để kết thúc phản ứng nhiệt độ phản ứng, thời gian mẫu thử cần sắc ký sau dẫn chất Từ xác định điểu kiện xử lý mẫu phù hợp trình bày phần phương pháp phút - 2,0 ml/phút (A = 0,25 ml/phút) cho thấy tốc độ dòng pha động 1,5 ml/phút cho khả tách tốt, áp suất cột vừa phải Bước sóng xác định Điều kiện sắc ký: Dẫn chất NEO FMOC - cách quét phổ kích thích phổ phát xạ pic NEO sắc ký đồ, lựa chọn cặp bước sóng phân Cl có tính phân cực nên sử dụng sắc ký lỏng tích Ex/ Em 268 nm/ 315 nm Từ kết khảo sát pha đảo để phân tích Cột Hypersil C18 BDS (250 X thực nghiệm, điều kiện sắc ký để định lượng 4,6 mm, um) lựa chọn nghiên cứu Pha động gốm hai thành phần MeCN nước khảo sát với tỷ lệ MeCN thay đổi từ 80 - 95% (A = 2,5%) Kết cho thấy, tăng nổng độ MeCN thời gian lưu pic NEO giảm đi, nhiên tỷ lệ MeCN 90% - 95% pic NEO chưa đạt độ phân NEO nhưtrình bày phần phương pháp nghiên cứu Thẩm định phương pháp Độ phù hợp hệ thống sác ký Tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn Kết cho thấy RSD thời gian lưu diện tích pic giải đường nển, tỷ lệ MeCN 80%, thời gian NEO đểu nhỏ 2% hệ thống sắc ký có phân tích dài Với tỷ lệ 85% MeCN pic NEO tách rời khỏi pic khác với thời gian phân tích hợp lý (khoảng 12 phút) Đồng thời, với tỷ lệ dung tính tương thích phù hợp để định lượng NEO môi pha động, tốc độ dòng khảo sát từ dịch chuẩn NEO sắc ký đổ trình bày hình 1 ,0 ml/ Tính chọn lọc Tiến hành sắc ký dung dịch placebo, dung Hinlì ỉ: Sác kỷ đố mẫu: a Plũcebo; b Neomỵơn chuẫn; c ĩhuỗc nhỏ mát Neo - Dexũ; ẩ ỉhuâcxịt mũi Alako Kết hình cho thấy sắc ký đồ dung lệ tương ứng thực tế NEO chủ yếu hỗn dịch NEO chuẩn, pic giống nhưtrên sắc ký hợp dạng B c, dạng B thường chiếm khoảng 90% đồ dung dịch placebo xuất pic có thời Kết tương với kết nghiên gian lưu khoảng 4,3 phút 11,2 phút Khi tăng nổng cứu công bố [4], [6 ], độ NEO dung dịch chuẩn, đáp ứng vể chiểu Khoảng nổng độ tuyến tính cao diện tích pic hai pic đểu tăng theo tỷ Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng ề dung dịch đệm borat thành dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ NEO xác khoảng 2,2 4,1 Ul/ml Tiến hành sắc ký, kết trình bày bảng Kết bảng cho thấy, khoảng nống độ khảo sát có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ với diện tích pic NEO (tổng diện tích pic) với hệ số tương quan xấp xỉ Bòng Két quà kháo sát khoảng nóng độ tuỵến tính Nóng độ (UI/ml) 2,21 2,52 3,16 3,47 3,79 4,11 Diện tích pic (LU.s) 41,21 45,4 89,78 71,11 73,65 107,39 Diện tích pic (LU.s) 1480,6 1705,5 2265,4 2514,4 2793,1 3050,7 Tổng điện tích pic (LU.s) 1521,8 1750,9 2355,1 2585,5 2866,8 3158,1 Phương trình hổi quy: y = 867,9 X - 412,9 Hệ số tương quan: r = 0,9996 Độ xác lượng hoạt chất thêm vào tương ứng với 80, 0 , Đánh giá độ xác phương pháp dựa vào khảo sát độ lặp lại (độ xác ngày) độ xác trung gian (độ lặp lại ngày phân tích nồng độ chuẩn bị mẫu Thêm dung dịch đệm borat vừa đủ tới vạch Lấy xác 5,00 ml dung khác) chế phẩm Thuốc nhỏ mắt Neo - Dexa dịch cho vào bình định mức Chuẩn bị riêng biệt song song mẫu dung dịch thử 120% lượng hoạt chất mẫu thử Mỗi mức mẫu dung dịch chuẩn ngày phân tích Tiến hành sắc ký Kết trình bày bảng thể bảng Bâng Két quờ khăo sát độ xác phương pháp Bòng Két kháo sát độ đứng ứ a phưmg pháp TT Trong ngày Mức 80% (2600 UI) Khác ngày TT Lương tìm lại (UI) TổngA(LU.s) H(%) Tổng A (LU.s) H(%) 3404,13 105,8 3592,90 104,4 3296,96 102,4 3557,45 103,4 3 3253,18 101,1 3479,67 101,1 3367,76 104,6 3424,26 99,50 3386,43 105,2 3515,46 102,2 3331,07 103,5 3510,30 102,0 TB 103,8 102,1 RSD(%) 1,72 1,68 0 ml, thêm dung dịch đệm borat đến vạch, lấc đểu Thực phản ứng dẫn xuất hoá tiến hành định lượng, kết MứclOŨ% 3250 UI) Mức 120% (3900 UI) H{%) Lương tìm H(%) lại (UI) Lương tìm H(%) lại(UI) 2615,34 100,6 3243,50 99,80 3949,53 101,3 2554,24 98,24 3192,80 98,24 3968,25 101,8 2615,34 100,6 3247,08 99,91 3934,32 100,9 Qá trí tìm lai ưung bình (n = 9): 100,ĩ% HSD(n = ì : m Nhận xét chung: Kết thẩm định tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ xác độ phương pháp cho thấy phương pháp định lượng NEO dựa dẫn chất NEO FMOC - Cl tạo Giá tri trung bình (n = 12): 102,9% RSD(n = ):l,83% A: diện tích pic H: Hòm lượng NEO so vă nhõn Kết bảng cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao với RSD đểu nhỏ 2,0% (trong ngày khác ngày) Độ thành từ phản ứng dẫn chất trước cột HPLC với detectơ huỳnh quang cho phép định lượng NEO chế phẩm ứng dụng Tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích theo cách Độ xác định phương pháp trình bày phẩn phương pháp Làm lặp lại lẩn thêm chuẩn Thêm xác 1,00 ml dung dịch mẫu chế phẩm Song song chuẩn bị hai mẫu chuẩn có nống độ NEO 2600 Ul/ml, 3250 chuẩn Tiến hành sắc ký So sánh với kết định Ul/ml 3900 Ul/ml (chuẩn bị dung dịch NEO lượng chế phẩm theo phương pháp vi sinh chuẩn dung dịch đệm borat) vào vật (theo tiêu chuẩn sở chế phẩm) Kết ml dung dịch mẫu placebo bình định mức 50 ml, trình bày hình 1c 1d bảng B À I N G H IÊ N cứu Bàng 4: Két định lượng neomydn sulíat mộ! sổ ché phẩm Hàm lượng neomycin Sulfat so với lượng ghi nhãn (%) nhiên, kỹ thuật dẫn chất hoá sau cột với thuốc thử 0-Phthalaldehyd, 2-Mercaptoethanol [4] hay 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen [6 ] phát triển Phương pháp HPLC - FLD (Trung bình ± sd) Phương pháp vi sinh vật (theo TCCS) Giới hạn cho phép Dung dịch nhỏ mắt Neo-Dexa 17000 Ul/5ml 103,8 ± 1,62 102,7 90,0-110 Dung dịch nhỏ mắt Neniydexan 27200 Ul/8ml 118,2 ± 1,49 Dung dịch xịt mũi Alaka 52500 Ul/15ml 97,04 ± 1,56 97,91 90,0-120 xây dựng phương pháp cho thấy, tiêu thẩm định đáp ứng quy định thẩm định phương pháp Dung dịch xịt mũi Dophazolin 52500 Ul/15ml 109,1 ± 1,25 108,7 90,0-120 định lượng thuốc chê' phẩm Phương pháp cỏ tính khả thi cao, có khả ứng dụng để phân Chế phẩm để định lượng NEO Kỹ thuật sử dụng thuốc thử độc, mùi khó chịu, thiết bị phức tạp, đắt tiền (HPLC với dẫn xuất hoá sau cột) mà nhiều phòng phân tích không đáp ứng Kỹ thuật dẫn chất hoá trước cột với thuốc thử FMOC - Cl nhanh chóng, đơn giản, không đòi hỏi 119,5 90,0-120 thiết bị phức tạp, độc hại lựa chọn phù hợp để phát triển phương pháp định lượng NEO Kết tích số chế phẩm dạng dung dịch chứa NEO, Bàn luận kết thu tương với kết định lượng NEO phương pháp vi sinh vật Trên thị trường có nhiều dạng bào mẫu nghiên cứu chê' chứa NEO viên nén, dung dịch, hỗn dịch, thuốc mỡ lưu hành Các chế phẩm bào chế Kết luận đểu sản xuất theo GMP kiểm soát chất lượng bán thành phẩm yêu cẩu bắt buộc Một phương pháp phân tích nhanh với độ xác đảm bảo lựa chọn phù hợp Theo tiêu chuẩn, định lượng NEO đểu theo phương pháp vi sinh vật [1], [7] với thời gian phân tích khoảng ngày, trở ngại trình sản xuất Đã có số nghiên cứu sử dụng HPLC để định lượng NEO cho kết khả quan HPLC với detectơ tán xạ bay [3] phát trực tiếp NEO loại detectơ không phổ biến Phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang định lượng NEO dung dịch số chế phẩm thuốc nhỏ mắt, thuốc dùng đường mũi xây dựng có tính chọn lọc cao, độ xác độ đảm bảo, thời gian phân tích nhanh, quy trình sắc ký đơn giản, phù hợp với trang thiết bị phòng thí nghiệm Phương pháp ứng dụng để định lượng NEO số chế phẩm thuốc nhỏ mắt, thuốc dùng đường mũi dạng dung dịch, góp phẩn phòng kiểm nghiệm, dùng detectơ điểu kiện phân tích phải kiểm soát chặt chẽ HPLC với detectơ huỳnh quang - tạo dẫn xuất tiêu chuẩn hoá chế phẩm chứa NEO Phương pháp đặc biệt hữu hiệu kiểm tra hàm lượng NEO bán thành phẩm phục vụ kịp thời yêu cẩu sản hoá với thuốc thử thích hợp lựa chọn tốt Tuy xuất dây chuyền GMP TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội 427-429 Bộ Y tế (2010), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội 838-840 1.CIarot, A.Regazzeti, N.Auzeil, Flaadani, M.Citton, P.Netter, A.Nicolas (2005), "Analysis of neomycin sulphate and framycetin sulphate by high performance liquid chromatography using evaporative light scattering detection", Journal of Chromatography A (1088), 236 -244 Maria Ofitserova, Sareeta Nerkar (2008), "Aminoglycoside antibiotics in feed: Apamycin, Gentamycin, Neomycin", Pickering Laboratories (205) D Stead, R.M.E Richards (1995), "Sensitive fluorimetric determination of gentamicin sulphate in biological matrices using solid phase extraction, pre - column derivatization with - fluorenyl ethyl chlorofomate and reversed-phase high-performance liquid chromatography", Journal o f Chromatography B: Biomedical application, (675), 295 - 302 Kiyoshi Tsuji, John F Goetz, William van Meter and Kathy A Gusciora (1979)," Normal - phase high-performance liquid chromatography determination of neomycin sulphatderivatized with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen", Journo/o/'C/)romcjfograp/7y,(l 75), 141 - 152 The United States Pharmacopoiea (2009), vol 3, pp 3045- 3069 Nghiên cứu bào chẽ tiểu phân nano lipid rắn chứa vitamin K Ngó Thị Thu Trang, Nguyễn Trấn Linh Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY The purpose o f this study was to investigate novel vitamin Kj - loaded solid lipid nanoparticles (VITK - SLNs) formulation for topical delivery, following our previous study [ 1] Influences o f lipid carriers (cetyl alcohol, stearic acid, Suppocire), surfactants (Span 80, Tween 80, Cremophor EL, poloxamer 188) and methods o f preparation on in vitro drug release and particle size were studied The VITK - SLNs with 0.5% cetyl alcohol, 0.8% Suppocire, 0.7% Span 80, 15% Tween 80 showed good drug release after hours (82.34 ± 3.75%) and small Z - verage (90.65 rim) Ultrasonic and high shear homogenization were the most suitable method o f preparation in this study Từ khóa: Tiểu phán nano lipid rân, vitamin K, Đặt Vấn đề Trong vài năm trở lại đây, vitamin K, xuất mỹ phẩm chế phẩm dùng để điểu trị tĩnh mạch mạng nhện cải thiện triệu chứng ban đỏ, ban xuất huyết, vết thâm tím nhiều nguyên nhân khác Nhưng dùng tỉ lệ chúng đến giải phóng dược chất in vitro [1], Nghiên cứu thực với mục đích tiếp tục đánh giá ảnh hưởng loại, tỉ lệ lipid, chất diện hoạt ảnh hưởng kỹ thuật bào chế đến kích thước tiểu phân giải phóng dược chất hệ theo đường da vitamin gặp phải hạn chế tính thấm qua da khó trì tác dụng thời gian dài Bào chế đại có nhiều biện pháp để cải thiện tính thấm cho dược chất, Vitamin K, đạt tiêu chuẩn dược điển Trung Quốc, số bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn alcol cetỵlic, acid stearic, Suppocire, Cremophor EL, Bên cạnh tác dụng làm tăng tính thấm dược Span 80, Tween 80, poloxame 188, ethanol tuyệt đối, Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu chất, hệ tiểu phân nano lipid rắn có khả natri clorid, natri dihydrophosphat, natri hỵdroxyd uv, để bảo vệ vitamin K,, dược chất đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất Acid phosphoric, acid ngăn cản tia nhạy cảm với ánh sáng Với nghiên cứu trước, sơ đánh giá ảnh hưởng số loại lipid, chất diện hoạt acetic, methanol loại dùng cho HPLC Thiết bị Máy siêu âm LABSONIC® M, máy khuấy từ IKA - ... ứng dẫn xuất hoá tiến hành định lượng, kết MứclOŨ% 3250 UI) Mức 120% ( 390 0 UI) H{%) Lương tìm H(%) lại (UI) Lương tìm H(%) lại(UI) 2615,34 100,6 3243,50 99 ,80 394 9,53 101,3 2554,24 98 ,24 3 192 ,80... thấy phương pháp có độ lặp lại cao với RSD đểu nhỏ 2,0% (trong ngày khác ngày) Độ thành từ phản ứng dẫn chất trước cột HPLC với detectơ huỳnh quang cho phép định lượng NEO chế phẩm ứng dụng Tiến... đắt tiền (HPLC với dẫn xuất hoá sau cột) mà nhiều phòng phân tích không đáp ứng Kỹ thuật dẫn chất hoá trước cột với thuốc thử FMOC - Cl nhanh chóng, đơn giản, không đòi hỏi 1 19, 5 90 ,0-120 thiết