Đánh giá độc tính tê bào số dòng tế bào mức độ giải phóng dược chất /fi vÊtro liposome doxorubicin Bùi Bá Minh\ Nguyễn Thị Lập^ ^Học viện Quân Y ^Trường Đợi học Dược Hà Nội SUMMARY Liposomes have been extensively investigated as a drug carrier system in attempt to enhance the therapeutic efficacy o f anticancer drugs As on initial investigation o f this potential application, we have examined the cytotoxicity o f liposomal doxorubicin in three lines o f cultured tumor cells, HeLo, HepG2 and MCF7 All the cell lines showed the cytotoxicity and inhibitory rates when exposed to liposomal doxorubicin Inhibitory rates to cancer cells o f the doxorubicin liposomes were lower as compared to that o f free doxorubicin The release rotes (%) o f drug from the encapsulated liposomes were also monitored by a dialysis method The concentration o f drug was analyzed at various times points during dialysis The results showed the more concentration o f fetal bovine serum in the culture medium, the higher release rate o f doxorubicin from liposomes Từ khóa: diệt tế bào ung thư, dòng tế bào, mức độ giải phóng, doxorubicin, liposomes Đặt vấn để Doxorubỉcin (Dox) thuốc chống ung thư dùng phổ biến Tuy nhiên thuốc gây tác dụng không mong muốn nghiêm trọng (đặc biệt tim tủy xương) Do đó, thuốc tác dụng đích điểu trị bệnh ung thư lựa chọn tối ưu để táng cường hiệu giảm độc tính thuốQ liposome dạng thuốc hướng đích có triển vọng tăng sinh khả dụng giảm độc tính nhiều dược chất Đây dạng thuốc đẩu tư nghiên cứu phát triển nước giới Gần đây, kĩ thuật bào chế dạng liposome Dox nhóm nghiên cứu bước đầu thu số kết khả quan, nhiên việc đánh giá tác dụng hạn chế Để góp phần khẳng định hiệu tác dụng diệt tế bào ung thư, độ an toàn dược động học dạng thuốc liposome Dox so với dạng Dox tự do, thực nghiên cứu nhằm mục tiêu: Đánh giá độc tính tế bào số dòng tế bào ung thư mức độ giải phóng dược chất in vitro chế phẩm liposom Dox Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên vật liệu Phospholipid lòng đỏ trứng hydrogen hóa Cholesterol, doxorubicln hydroclorid đạt tiêu chuẩn 130 Nghiên cứu d u ợ cT h ô n g tln th u õ c; SỐ4/2014 USP 30 - Merck (Đức) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ỵl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma cung cấp Cloroform số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích Các dòng tế bào thử nghiệm cung cấp ATCC (American type culture collection) lưu giữ nitơ lỏng, gổm: HeLa(ATCC CCL2 ”): dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung người, MCF7 (ATCC HTB-22"): dòng tế bào ung thư vú người, HepG2 [HEPG2] (ATCCHB8065'“): dòng tế bào ung thư gan người Thiết bị Túi thẩm tích MWCO: 2000 -14000 Da (Spectrum Labs-Mỹ) Thiết bị siêu âm cầm tay Labsonic tẩn số 30 kHz (Nhật Bản) Máy đo quang phổ huỳnh quang Shimadzu RF 1501 (Nhật Bản) Máy cất quay BUCHI R-210(ThụySỹ) Phương pháp nghiên cứu Tạo liposome doxorubicin Đầu tiên tạo tiểu phân liposome nhiều lớp (MLV) phương pháp Bangham [1], tóm tắt nhưsau: Hòa tan phospholipidxholesterol (55:45 mol/ mol) vào cloroform Toàn hỗn hợp cất quay chân không 30°c thu lớp màng film Hydrat hóa lớp màng film dung dịch (NH^)jSO^ 250 mM đệm PBS Ở40°c Làm giảm kích thước liposome máy siêu âm cẩm tay kết hợp làm lạnh Loại mảnh kim loại đẩu titan siêu âm, phương pháp lí tâm lạnh 4°c 16000 rpm, 20 phút Dox đưa vào liposome phương pháp chủ động nhờ chênh lệch nồng độ amoni sulphat hai bên màng liposome Liposome Dox tiêu chuẩn hóa tiêu chí: cảm quan (hỗn dịch màu đỏ cam, đục mờ, đóng lọ thủy tinh có nắp hàn kín), pH (7-8), định tính (thể phép thử định tính Dox hydroclorỉd), kích thước tiểu phân (các tiểu phân có đường kính trung bình từ 80- 150 nm, PDI < 0,30) hàm lượng dược chất (không 80% lượng Dox hỵdroclorid gắn vào liposome; chế phẩm phải chứa từ 90,0 -110,0% lượng doxorubicin hỵdroclorid so VỚI lượng ghi nhãn) Phương pháp đánh giá độc tính tế bào Tiến hành đánh giá độc tính tế bào (hoạt tính kháng tế bào ung thư) theo phương pháp MTT [6 ] Các tế bào pha logarit trypsin hóa phân tán đểu vào giếng đĩa 96 giếng với mật độ tế bào X O^^tế bào/giếng Các loại tế bào nuôi cấy môi trường DMEM có bổ sung mmol/l L-glutamin, 50 lU/ml penicillin, 50 Mg/nnl streptomycin 10 % FBS (huyết tương bào thai bò), 37°c điểu kiện 5% CO^ 24 tế bào gắn ổn định vào đĩa nuôi cấy Liposome Dox pha loãng môi trường DMEM thêm vào đĩa nuôi cấy nồng độ khác đảm bảo nồng độ DMSO cuối giếng < 0,1 %, thí nghiệm lặp lại lần Sau ủ đĩa 48 37°c 5% co^, tế bào rửa lẩn với PBS bổ sung 20 ụ\ dung dịch MTT mg/ml ỉsopropanohHCI (1 : ) ủ tiếp trong bóng tối Loại bỏ môi trường bổ sung 200 |jl DMSO, lắc 15 phút đo độ hấp thụ phương pháp quang phổ UV-VIS bước sóng cực đại 550 nm.Tiến hành song song với giếng đối chứng điểu kiện tương tự với mẫu thử liposom Dox Tỷ lệ ức chế tế bào tính theo công thức: 100 Trong đó: H % phân trâm ức chế tế bào, OD^ mật độ quang lô đối chứng, OD^ mật độ quang lô thử ICjg nổng độ Dox mà ức chê' 50% tế bào Nồng độ ức chế tính dựa đồ thị bán log sử dụng phần mểm Sigmalot 1 Phương pháp đánh giá mức giải phóng doxorubicin in vitro từ tiểu phân liposome Hỗn dịch chế phẩm liposome Dox loại hết Dox tự phương pháp thẩm tích Liposome Dox pha loãng hai môi trường nuôi cấy tế bào DMEM chứa 10% FBS 50% FBS tới nổng độ 0,5 mg/ml, thu mẫu Lấy ml mẫu đặt túi thẩm tích đặt 50 ml môi trường chứa % FBS 50% FBS tương ứng với mẫu trên, sử dụng tốc độ khuấy 100 vòng/phút 37°c 48 Tại thời điểm khác nhau, lấy ml dịch thử bổ sung lại ml môi trường Định lượng Dox mẫu phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS bước sóng 485 nm, tính lượng dược chất giải phóng theo công thức: m ,=q.50 + ^ C j.5 % GP = -^ 0 Trong đó: ưìị m : khối lượng Dox giải phóng lẩn lấy mẫu thứ/và khối lượng Dox đem thử ban đầu; c, C: nổng độ doxorubicin dung dịch bên túi thẩm tích thời điểm i, j; % GP: Nổng độ Dox giải phóng Mỗi mẫu tiến hành lặp lại lần, tiến hành song song với mẫu trắng môi trường nuôi cấy tương tự liposome Dox Phương pháp x lý số liệu Các số liệu xử lý phần mềm Microsoft Office Excel 2007 để tính giá trị trung bình độ lệch chuẩn SD.Sửdụng Student'sT-Test để so sánh khác vể biến định lượng nhóm sử dụng x test để so sánh khác tỷ lệ Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 Kết nghiên cứu Đánh giá độc tính tếbào liposom doxorubicin dòng t ế bào ung thư Kết thu dòng tế bào Hela (Bảng ) cho thấy nổng độ ức chế liposome Dox dòng tế bào khoảng 8,38 - 32 (|ag/ml) thu % tế bào bị ức chế khoảng 15,41 - 83,53%, ICjj) 16,38 |jg/ml Trong đó, Dox tự 0,35 ụg/ml Kết thu dòng tế bào MCF7 (Bảng ) cho thấy nồng độ ức chế liposome Dox dòng tế bào khoảng 0,33 - 5,24 (ng/ml) thu % tế bào bị ức chế khoảng 11,29 - 74,77%, ICji, 1,03 ng/ml Trong đó, ICju Dox tự 0,17 |ag/ml Báng l.%tébàobịứcchễvàlC^củaliposomeDoxvàDoxtựdoưên dòng tễbàoHelũ % tế bào bị ức chế liposome Dox Nồng độ liposome Dox ((ig/ml) 32,00 TB 83,53 SD 0,80 20,48 80,85 5,34 16,38 50,04 12,87 13,10 13,92 5,15 10,48 12,59 6,35 8,38 15,41 8,53 ICji^cùa liposome Dox (|ig/ml) ICjgCÙa Doxtựdo (ng/ml) 16,38 0,35 Trong đó: TB: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Bảng % tếbào bị ức ché vù IC^ cũa liposome Dox Dox tự dòng tếbào MCF7 Nóng độ liposome Dox (|ig/ml) % tế bào bị ức chế liposome Dox TB SD 5,24 74,77 4,03 2,62 71,85 5,86 1,31 55,04 5,23 0,66 45,01 18,91 0,33 11,29 17,41 ICjgCÙa liposome Dox (ậig/ml) IC,,củaDoxtựdo (ng/ml) 1,03 0,17 Trong đó: TB: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Kết thu dòng tế bào HepG2 (Bảng 3) cho thấy nổng độ ức chế liposome Dox dòng tế bào khoảng 10,48 - 40 (|jg/ml) thu % tế bào bị ức chế khoảng 20,32 - 75,73%, ICju 20,82 |ag/ml.Trong đó, ICjgCLia Doxtựdo 2,40 ng/ml Bảng % tế bào bị ức chế IC50 liposom Dox Dox tự dòng té bào HepG2 Nồng độ liposome Dox (Mg/ml) % tế bào bị ức chế liposome Dox TB SD 40,00 75,73 1,32 32,00 75,23 0,89 25,60 74,79 0,98 16,38 35,83 9,52 10,48 20,32 8,63 , IC„ cùa liposome Dox (ng/ml) ICỊ^củaDoxtựdo (Ịig/ml) 20,82 2,40 Trong đó: TB: trung bình; SD: độ lệch chuẩn Kết cho thấy từ Bảng ,2 ,3 cho thấy ICgg liposome Dox lớn so với Dox tự (46,8 lẩn Hela, lẩn với MCF7,8 ,7 lẩn với HepG2 ) Đánh giá mức độ giải phóng doxorubicin in vitro từ tiểu phân liposome Trong nghiên cứu đánh giá mức độ giải phóng Dox theo thời điểm vòng 48 giờ, môi trường nuôi cấytê'bào có bổ sung 10% FBS 50% FBS, kết trình bày nhưở Hình 1.Trong môi trường nuôi cấy tê' bào DMEM chứa 10% FBS (Hình 1, bên trái) lượng Dox giải phóng từ liposom tăng dần theo thời gian Sau 48 giờ, phẩn trăm Dox giải phóng 22,43% Sau đầu tiên, Dox giải phóng 1,27%, nhiên thời điểm tốc độ giải phóng Dox giảm dẩn Khi thời gian tiếp xúc với môi trường tăng lên lượng Dox giải phóng tăng làm giảm chênh lệch nổng độ thuốc liposome môi trường  -4 Trong môi trường nuôi cấy tế bào DMEM chứa 50% FBS (Hình bên phải) lượng Dox giải phóng từ liposome tăng dẩn theo thời gian Sau 48 giờ, Dox giải phóng 37,66% Tuy nhiên, thời điểm phần trăm Dox giải phóng táng lên so với môi trường có 10% FBS 01 23 57 12 24 36 48 Thời gian (h) 57 12 Thời gian (h) Hình Đỗ thị biểu diễn mối tương quan CỈIQ % doxorubicin giỏi phóng môi trường 10%FBS (bên trái) vò 50% FBS (bên phỏi) theo thời gian Bàn luận Về độc tính tế bào liposome doxorubicin dòng tế bào ung thư Các kết từ Bảng 1, cho thấy chế phẩm liposome Dox có tác dụng diệt tế bào ung thư ba dòng dòng tế bào sử dụng nghiên cứu.Tuy nhiên, kết thu cho thấy, dòng tế bào liposome Dox nhạy cảm với dòng tế bào ung thư vú MCF7, sau dòng tế bào ung thư cổ tử cung nhạy cảm với dòng tế bào ung thư gan HepG2 Điểu tương ứng khả đáp ứng lâm sàng Dox tự chế phẩm liposome Dox thị trường Việc lựa chọn dòng tế bào ung thưtrên dòng tế bào thuộc phổ tác dụng Dox Để chứng minh ưu điểm dạng thuốc liposome mang Dox so với dạng Dox tự do, nghiên cứu so sánh giá trị dạng thuốc dòng tế bào Kết thu Bảng 1, 2, cho thấy IC3Qcủa dạng liposome Dox cao có ý nghĩa thống kê so với dạng Dox tự (x2 test p < 0,05) Điểu chứng tỏ độc tính tế bào in vitro Dox dạng liposome giảm nhiều so với Dox dạng tự do, cho thấy màng liposome giống hàng rào cản trở tiêu diệt tế bào ung thư.Trong kết nghiên cứu độc tính tế bào tác giả trước [2], [3], [5] dòng tế bào HeLa, MCF7 HepG2 cho thấy IC5Q có mức độ táng tương tự dạng liposome Dox so với dạng Dox tự Tuy nhiên IC5Qcủa liposome Dox nghiên cứu nhỏ so với chế phẩm nghiên cứu trưỚQ trình loại Dox tự không hoàn toàn nghiên cứu bước sau liposome hóa Dox, tổn dư Dox tự bám bể mặt tiểu phân liposome Vì điểu kiện có hạn nên chưa xác định trực tiếp độc tính tế bào Dox tự chế phẩm liposome Dox tương tự thị trường, việc so sánh mang tính tương đối Tuy nhiên, khác rõ rệt IC5Qcủa liposome Dox với Dox tự chứng tỏ tác dụng diệt tế bào ung thư giảm độc tính liposome Dox Về mức độ giải phóng doxorubìcìn in vitro từ tiểu phân liposom Trong nghiên cứu mô hình đánh giá mức độ giải phóng in vitro thiết kế giống với môi trường in vivo sau khỉ Dox đưa vào hệ tuần hoàn thể Trong nghiên cứu phương pháp định lượng Dox giải phóng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS chấp nhận môi trường nuôi cấy tế bào chứa huyết tương không bị ảnh hưởng màu sắc hổng cẩu Dox chưa bị chuyển hóa thành dạng phân khác enzynn nhưtrong điểu kiện in vìvo Mặt khác, sai số loại trừ thí nghiệm bố trí mẫu trắng điểu kiện tương tự liposome Dox Trong môi trường nuôi cấy tế bào DMEM chứa 10% FBS (Hình , bên trái) lượng Dox giải phóng từ liposome tăng dẩn theo thời gian Sau 48 giờ, phẩn trăm Dox giải phóng 22,43% Như khả nàng giải phóng Dox từ từ liên tục lỉposome giống việc chia nhỏ liều Dox truyền kéo dài, giúp làm giảm tác dụng không mong muốn thuốc Trong môi trường nuôi cấy tế bào DMEM chứa 50% FBS (Hình , bên phải) lượng Dox giải phóng từ lỉposome tăng dẩn theo thời gian Sau 48 giờ, Dox giải phóng 37,66% Tuy nhiên thời điểm phán tràm Dox giải phóng tăng lên so với môi trường có 0% FBS Kết phù hợp với kết nghiên cứu trước [4] Từ kết hình cho thấy ảnh hưởng huyết tương đến giải phóng Dox từ liposome Điểu giải thích huyết tương có nhiều thành phần tác động đến độ ổn định bền vững liposome đặc biệt lipoprotein Lipoprotein hấp phụ trao đổi thành phẩn phospholipid, cholesterol với liposome làm phá vỡ màng, nồng độ huyết tương tăng lên tiếp xúc phá vỡ liposome xảy lớn Mặt khác, nhược điểm nghiên cứu giải phóng thuốc in vitro thiếu vận chuyển thuốc tới mô Trong điểu kiện in vivo, tiểu phân nano liposome (kích thước khoảng 10 nm) sau vào hệ tuần hoàn nhanh chóng đến hấp thu vào mô ung thư làm giảm thời gian lưu giữ hệ tuần hoàn Ngoài ra, chế giải phóng Dox từ liposome thể phức tạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhiều tương tác khác Tuy nhiên, việc thử nghiệm in vitro nghiên cứu bước đầu cho thấy khả náng giải phóng Dox từ liposome Hướng nghiên cứu cắn tiếp tục thử nghiệm in vivo thông số dược động học chế phẩm Kết luận Nghiên cứu chứng minh dạng thuốc liposome Dox có tác dụng diệt tế bào ung thư giảm tác dụng không mong muốn thông qua việc xác định số IC^^trên ba dòng tế bào ung thư Kết cho thấy liposome Dox nhạy cảm với dòng tế bào ung thư vú MCF7, sau dòng tế bào ung thư cổ tử cung thấp dòng tế bào ung thư gan HepG2 Mặt khác, nghiên cứu đánh giá mức độ giải phóng Dox từ liposome môi trường nuôi cấy tế bào có bổ sung 10% 50% huyết tương bào thai bò Kết cho thấy khả giải phóng Dox từ liposome Dox táng dần theo thời gian tăng cao môi trường có nồng độ FBS cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Bangham, A D., Standish, M M., Watkins, J c (1965), "Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids", J Mol B io n s, 238-252 Hussain s., Plu ’ckthun A., Allen T.M., et al (2007), "Antitumor activity of an epithelial cell adhesion molecule-targeted nanovesicular drug delivery system", Mol Cancer Ther, 6(11), 3019-3027 Li X., Ding L., Xu Y., Wang Y., et al (2009), "Targeted delivery of doxorubicin using stealth liposomes modified with transferrin", InternotionalJournal of Pharmaceutics, 373 (1 -2), 116-123 Luo c., Zhao H., Wang J., et al (2007), "In vitro characterization of two new doxorubicin liposomes modified with argine-glycineaspartic acid tripeptide or glycine-argine-glycine-aspartic acid-serine pentapepWde", Journal of ChinesePhormaceuticol Sciences, 16 (3), 162-169 Pastorino R, Brignole c, Marimpietri D., etal (2003),"Doxorubicin-loaded Fab'fragments of anti-disialoganglioside immunoliposomes selectively Inhibit the growth and dissemination of human neuroblastoma in nude mice", Cancer Res, 63 (1), 86-92 Van-de-Loosdrecht, A A., Beelen R H., at ol.{ 1994), "A tetrazolium-based colorimetric MTT assay to quantitate human monocyte mediated cytotoxicity against leukemic cells from cell lines and patients with acute meloid leukemia" J Immunol Methods, 174, 311-320  ... cứu Đánh giá độc tính t bào liposom doxorubicin dòng t ế bào ung thư Kết thu dòng tế bào Hela (Bảng ) cho thấy nổng độ ức chế liposome Dox dòng tế bào khoảng 8,38 - 32 (|ag/ml) thu % tế bào bị... hỵdroclorid gắn vào liposome; chế phẩm phải chứa từ 90,0 -110,0% lượng doxorubicin hỵdroclorid so VỚI lượng ghi nhãn) Phương pháp đánh giá độc tính tế bào Tiến hành đánh giá độc tính tế bào (hoạt tính kháng... với HepG2 ) Đánh giá mức độ giải phóng doxorubicin in vitro từ tiểu phân liposome Trong nghiên cứu đánh giá mức độ giải phóng Dox theo thời điểm vòng 48 giờ, môi trường nuôi cấytê 'bào có bổ sung