NGHIấN CU BO CHẫ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BNG PHNG PHP PHA LONG ETHANOL Pham Thuv Ngoe* HDKH: ThS Nguyn Vn Lõm^, ThS Nguyn Tun Quang^ 'A4K64, Trng i hc Dc H Ni ^B mụn Bo ch, Trng i hc Dc H Ni ^ Hc vin Quõn y H Ni T khoỏ: liposome Amphotercin B, pha loóng ethanol Túm tt Kho sỏt bo ch lposome Amphotericn B (AmB) bng phng phỏp pha loóng ethanol (tiờm ethanol) Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, Amphotericn B c ho tan hn hp dung mụi ethanol v N,Ndmethylacetamid (DMA) 60c ri tiờm nhanh dung dch ny vo pha nc cỏc t l th tớch khỏc to lposome, sau ú ỏnh giỏ v kớch thc tiu phõn, ng nht, cu trỳc hỡnh thi v hiu sut gn dc cht vo liposome Kt qu cho thy phng phỏp to cỏc liposome cú kớch thc nh (khong 200 nm), ng nht (PDI khong 0,1) m khụng cn cú thờm bin phỏp lm gim kớch thc tiu phõn hay ng nht hoỏ, hiu sut gn dc cht vo liposome lờn ti 70Yo vi hn dch AmB 50mg/0ml, chp TEM thy liposome cú cu trỳc a khoang a lp nhng s khoang v s lp khụng nhiu (di 3) t Liposome vi lch s gn 50 nm (t nm 1965) ó cú rt nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v cỏc phng phỏp bo ch v u nhc im ca chỳng Mt nhng phng phỏp khỏ n gin bo ch liposome l pha loóng ethanol (tiờm ethanol)-ln u tiờn c cụng b bi hai nh khoa hc Batzri and Kom phng phỏp ny, dung dch phospholipid (cú hoc khụng dc cht) ethanol c tiờm nhanh vo dung dch m ang c khuy trn Ethanol nhanh chúng pha loóng vo nc, phõn t phospholipid s hp li thnh lúp kộp, ri t úng thnh cỏc liposome Cỏc lp kộp cú xu hng ln lờn v kớch thc, ri mi t úng thnh liposome hoc thm bao ngoi cỏc tiu phõn khỏc, nờn liposome nguyờn thu cú kớch thc khỏ to, cú nhiu hin tng a khoang a lp Khi cú s phõn tỏn mnh mụi trềTig hydrat hoỏ, cn tr s ln lờn v kớch thc lp kộp phospholipid, to nờn cỏc tiu phõn nh v ớt a khoang a lp hn Do ú, u im ni bt ca pha loóng alcol l to c liposome cú kớch thc nh v ng nht cao sau bo ch Phng phỏp ny ó v ang c ng dng khỏ rng rói, bo ch liposome trng hay lipsome hoỏ cỏc dc cht thõn du tan ethanol Cụng ngh bo ch cng ngy c ci tin vi cụng ngh tiờm ct dũng (crossflow injection) Vit Nam, B mụn Bo ch Trng i hc Dc H Ni l ni thc hin nhiu nghiờn cu nht v liposome Cỏc nghiờn cu trc ó bo ch liposome AmB bng phng phỏp bc hi pha o, hydrat hoỏ mng film [1] Tuy nhiờn, phng phỏp bc hi pha o cú nhc im l quy trỡnh bo ch phc tp, tri qua nhiu giai on, cú s phi nhim dung mụi hu c ch phm Cũn phng phỏp hydrat hoỏ mng film, quỏ trỡnh hydrat kộo di v khụng búc tỏch c hon ton lp mng film trờn thnh bỡnh Kt qu ca hai phng phỏp u cho liposome AmB to cú kớch thc to (trờn 1000 nm), ch s a phõn tỏn PDI cao Cú l bi tan rt hn ch ca AmB ong hu ht dung mụi, c bit l ethanol m phng phỏp tiờm ethanol cha c kho sỏt õy cng l khú khn chung vi cỏc nghiờn cu trc, sn phm bo ch ch cú hm lng lý thuyt lOmgAmB/lOml Bi vy ci thin tan cho AmB khụng ch giỳp ng dng phng phỏp, m cũn tng hm lng ch phm Sau kho sỏt cỏc u im v hn ch, nghiờn cu quyt nh bo ch liposome AmB bng phng phỏp tiờm ethanol (pha loóng ethanol) gm hai mc tiờu: - a quy trỡnh bo ch liposome AmB 50mg/10ml bng phng phỏp pha loóng ethanol - ỏnh giỏ mt s yu t nh hng ti kớch thc tiu phõn Nguyờn liu, thit b v phng phỏp nghiờn cu Nguyờn liu Amphotericin B (AmB) Trung Quc, tiờu chun USP Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) ca Lipoid, cholesterol ca Sigma-Aldrich, ethanol (Trung Quc), ng sucrose (Trung Quc), dinatrisuccinat hexahydrat (Trung Quc) Thit b Mỏy ng nht hoỏ nidrive X I000, thit b lc tip tuyn MicroKrosđ Filter Moducles, mng polysulfone, kớch thc l 10 kD, din tớch lc 20 cm^, h thng thit b phõn tớch kớch thc Zetasizer nano ZS90 (Malvem-Anh), h thng mỏy sc ký lng hiu nng cao HPLC Aligent Phng phỏp bo ch liposome Am B Ho tan phospholipid HSPC, cholestertol (2.5:1) vo ml ethanol 50c , iu chnh pH bng acid HCl 2.5N n pH 1-3 50 mg AMB c ho tan ml ng dựng mụi DMA:EtOH (1:2, v/v) ri trn vi dung dch phospholipid un cỏch thu 50c n thu c pha ethanol mu vng da cam sut Pha nc: m dinatri succinat mM pH 5-6 + sucrose 7.5% Phi hp pha ethanol vi pha nc: Tiờm chớnh xỏc pha ethanol vo pha nc (60C) vi t l 5; 6,7; 8; 10; 20% ethanol/nc (v/v) tng ng Khuy tc cao 3900 vũng/phỳt 10 phỳt Lc tip tuyn cụ c dung dch v th tớch 10 ml Tip tc lc tip tuyn bng 100 ml dd pha nc thu c hn dch cha 50 mg AmB Hiu sut np thuc nh lng AmB dch thi sau lc tip tuyn ca cụng thc liposome AmB 8% ethanol/nc bng phng phỏp HPLC [5] Ct sc kớ: Eclipse XDB C18, |im, 4,6x150 mm Pha ng gm cỏc ng dung mụi ca m natri acetat 5mM pH 6.0; acetonitrihmethanol vi t l pha A l 48:20:32; pha B l 25:5:70 tng ng Chng trỡnh chy: 2,5 phỳt u chy bng 100% A Phỳt th 2,5 n 3,5; chuyn dn sang B Phỳt 3,5-8: chy bng 100% B Tc dũng l 1,8 ml/phỳt Hiu sut gn dc cht vo liposome c tớnh theo cụng thc lng AmB cõn - lng AmB inh lng Hiu su t gn(H ) = ^ -^ -khi lng AmB cõn o kớch thc tiu phón v ng nht S dng phng phỏp tỏn x ỏnh sỏng ng vi thit b Zetasizer ZS90 Pha loóng h phõn tỏn liposome 100 ln bng nc ct ri tin hnh o kớch thc tiu phõn ỏnh giỏ kt qu thụng qua th phõn b kớch thc theo th tớch, Z a v e r a g e , ch s a phõn tỏn (PDI) Nghiờn cu hỡnh thỏi cu trỳc tiu phõn S dng phng phỏp chp hin vi in t truyn qua (TEM) vi k thut nhum soi õm bn Kt qu nh hng ca t l ph a ethanol/nc ti kớch thc tiu phõn ỏnh giỏ c tớnh phõn b KTTP ca liposome to bi quy trỡnh bo ch cỏc t l ethanol/nc khỏc nhau, kt qu c cho bi Bng Ta thy cỏc mu u to c liposome vi kớch thc nh (Z a v era g e < 300 nm) v tng i ng u (PDI < 0,3) Tuy nhiờn ỏnh giỏ theo phõn b th tớch, cú s khỏc bit rừ rng gia cỏc cụng thc trờn 10% ethanol v di 10% ethanol Hỡnh la cho thy s chim th tớch ca cỏc tiu phõn th tớch to (>1000 nm) ln hn nhiu so vi th tớch cỏc tiu phõn nh Vi cỏc cụng thc di 10% ethanol, s phõn b th tớch trung cỏc tiu phõn nh (hỡnh Ib), cỏc ch phm tng i ng nht (PDI khong 0,12) Do vy, nờn s dng lng ethanol nh hn 10%, c bit vi nng 8% ethanol, tiu phõn t c kớch thc 204 nm, PDI 0.125 tng i nh v ng nht iu ny cng phự hp vi ti liu tham kho [4] Bng Phõn b kớch thc theo th tớch tng ng vi tng t l th tớch pha ethanol/pha m T l ^average (d.nm) PDI 20% 176.0 0.208 10% 157.8 0.222 8% 204.3 0.125 6.7% 282.2 0.120 5% 243.1 0.129 Stze Disfribution Sy Intensity & ze OiStủbL'tớon by Volume S ize fd-nm) R ecord 3: !ip ;5 s a u LTT o R ecord : Itp 4-'iO n gay 3/1 R ecofd 30: iip &40 n qay 3-1 _ R ecord 20: t:p4/50 R ecord 28: lip 4.^60 n g ay 3/1 R bco ' 26: itp 3.-60 n gay 3-1 1; (a) ^ (b) Hỡnh Phõn b th tớch cỏc cụng thc t l ethanol trờn 10% (a) v Phõn b th tớch cỏc cụng thc t l ethanol di 10% (b) Kh nng gn dc cht vo liposome Tin hnh nh lng vi mu tt nht l 8% t l pha ethanol/nc, xỏc nh lng Amphotericin B dch thi 15,14 mg, tc hiu sut liposome hoỏ t 69.72% Nghiờn cu hỡnh thỏi cu trỳc tiu phõn liposome T hỡnh 2, cho thy cỏc tiu phõn cú hỡnh cu v kớch thc khỏ nh (Idiong 200 nm) cú mt s ớt tiu phõn kớch thc trờn 200 nm nhng Idiụng cú tiu phõn no kớch thc trờn 500 nm Liposome c to dự cũn cú cu trỳc a khoang, a lp nhng s khoang s lp khụng nhiu (di khoang/lúp liposome) L i p o s o m e A m p o f e n c i n B.001 P r i n t Ma g ; 39800x0 10 51 na nm L i p o s o m e A m p o f e n c i n B-0T2 Pr i n t Mag: 4:25:15 p / / HV^eO.OkV T E M M o d e : Iin^g.ing D i r e c t Mag: 0 0 X I 0 x (d bl rara 500 nra A :32:13 p / / HV-^SO.OkV TEM Mode:Imaging D i r e c t Mag: 0 X (a) ^ (b) Hỡnh nh chp TEM ca ch phm liposome % ethanol Bn lun Ci thin tan ca AmphotericinB Amphotericin l mt cht tng i tr v mt hoỏ lý, cú tớnh cht lng thõn v lng tớnh, khú tan hu ht cỏc dung mụi núi chung v cỏc alcol núi riờng Thc nghim cho thy tan ca AmB cỏc dung mụi (ethanol, methanol, isobutanol) v cỏc ng dung mụi ca cỏc alcol u rt hn ch (di mg/ml) Li dng cụng thc liposome cú cha phospholipid, tin hnh ci thin tan ca AmB nh to phc AmB-phospholipid ó acid hoỏ [2] Thc nghim cng cho thy cụng thc 50 mg AmB, 213 mg HSPC tan tt ml EtOH (pH 1-3) 60c Trong quy trỡnh bo ch cũn cú s dng hn hp dung mụi DMA:EtOH (1:2, v/v) bóo ho AmB, giỳp AmB phõn b vo pha lng cú th tin hnh phn ng vi phospholipid [3] nh hng ca quy trnh bo ch ti kớch thc tiu phõn Phng phỏp tiờm ethanol khỏ n gin nhng cho hiu qu cao, giỳp to cỏc liposome cú kớch thc nh, tng i ng nht [4] c bit vi AmB liposome hoỏ, s liờn kt ca cholesterol v AmB lm cho lúp lipid ny tr nờn cng nhc, mt tớnh linh hot, gõy khú khn lm gim kớch thc tiu phõn [1] Thc nghim cho thy, gim kớch thc tiu phõn bng phng phỏp y qua mng (extrusion) vi cỏc KT l xp 400, 200, 100 nm thỡ s thay i kớch thc ca liposome AmB rt ớt (thng vt 50% kớch thc so vi l lc) Bo ch bng tiờm ethanol giỳp b qua c quy trỡnh gim kớch thc khụng my hiu qu Trong phng phỏp tiờm ethanol, cỏch thc phi hp pha ethanol vo pha nc nh hng nhiu ti cht lng liposome Nhit pha nc luụn c gi trờn nhit chuyn pha ca phospholipid (53c vi HSPC), m bo cho lp kộp phospholipid c linh hot, thun li cho vic úng vũng Khi dung dch phospholipid ethanol c tiờm vo pha nc, ethanol nhanh chúng b pha loóng v phospholipid hp li thnh lúp kộp, ri t kt hp thnh liposome Th tớch pha ethanol/nc l nhng yu t nh hng ti kớch thc tiu phõn Khi tng t l ethanol/nc (trờn 10%), mt phospholipid cao nờn cú xu hng kt t li to cỏc tiu phõn kớch thc ln Thm cỏc lp kộp phospholipid to thnh cú th úng vũng c cỏc liposome ó to thnh to liposome kớch thc ln, a lp T l ethanol cao cng lm cho s pha loóng ethanol gim, lm cỏc phõn t phospholipid khụng hon ton tỏch v hydrat hoỏ c Phng phỏp xỏc nh hiu sut gn dc cht vo liposome Trong phng phỏp nh lng AmB, iu quan trng nht l cht lng dch thi Lc tip tuyn ln giỳp gim th tớch v 10 ml, lc tip tuyn ln giỳp loi alcol v loi AmB t ch phm Vi kớch thc l 10 kD, cú sai s vi nhng tiu phõn AmB kớch thc ln hn Tuy nhiờn, hin cha cú nghiờn cu no trờn th gii cụng b v s tỏch hon ton AmB t ch phm liposome Kt qu np thuc 70% vi ch phm liposome 50 mg AmB/lOml cng khỏ kh quan, so vi cỏc nghiờn cu c: phng phỏp hydrat hoỏ flm 85% vi cụng thc 10 mgAmB/10 ml; phng phỏp bc hi pha o 75% vi cụng thc lOmgAmB/10 ml Kt lun Nghiờn cu ó hon thnh c mc tiờu ó a c quy trỡnh bo ch, to c cỏc liposome Amphotericin cú kớch thc nh ( Z a v e r a g e khong 200 nm), phõn b kớch thc ng nht (PDI khong 0.1), hiu sut liposome húa khỏ cao (70%) (Trong giai on tip theo s tip tc tin hnh nghiờn cu la chn c cỏc thụng s k thut ti u cho quy trỡnh bo ch v ỏnh giỏ tớnh n nh ca quy trỡnh bo ch cng nh kh nng trin khai quy mụ ln hn) Ti iu tham kho o Th Thu Dung (2013), lun Nghiờn cu bo ch - liposome Amphotericin B, B mụn Bo ch, Trng i hc Dc H Ni Adler-Moore, Jill, Chiang, Su-Ming, Profớtt, Richard Thomas (1989), Improved amphotericin B liposome preparation, California (US) c Michael Dicken, Thomas M Rossi, Natarajan Rajagopalan, Louis J Ravin and Lay A Stemson (1988), A study of the chemical stability o f amphotericin B in N,N-dimethylacetamide, Department of Pharmaceutical Research and Technologies, Division o f Research and Development, Smith Kline and French Laboratories, King of Prussia, PA 19406 Miquel Pons, Merce Foradada and Joan Estelrich (1992), Liposomes obtained by the ethanol injection method, Unitat de Fisicoqu[mica, Facultat de Fann-cia, Universitọt ~te Barcelona, 08028 Barcelona (Spain) Niranjan M Deshpandea,b,*, Manish G Gangradeb, Maharudra B Kekarea, Vikas V Vaidyac (2009), Determination of free and liposomal Amphotericin B in human plasma by liquid chromatography-mass spectroscopy with solid phase extraction and protein precipitation techniques, India  ... chế, nghiên cứu định b o chế liposome AmB b ng phương pháp tiêm ethanol (pha loãng ethanol) gồm hai mục tiêu: - Đưa quy trình b o chế liposome AmB 50mg/10ml phương pháp pha loãng ethanol - Đánh... Nam, B môn B o chế Trường Đại học Dược Hà Nội nơi thực nhiều nghiên cứu liposome Các nghiên cứu trước b o chế liposome AmB phương pháp b c pha đảo, hydrat hoá màng film [1] Tuy nhiên, phương pháp. .. nghiên cứu trước, sản phẩm b o chế có hàm lượng lý thuyết lOmgAmB/lOml B i cải thiện độ tan cho AmB không giúp ứng dụng phương pháp, mà tăng hàm lượng chế phẩm Sau khảo sát ưu điểm hạn chế, nghiên