Tối ưu hóa qui trình chiết xuát phospho­ lipid từ lòng đỏ trứng phương pháp sử dụng co^ trạng thái siêu tới hạn Nguyễn Thị Lập*, Nguyễn Mai cương**, Nguyễn Xuân Bắc* * Trường Đợi học Dược Hà Nội * Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam SUMMARY Our objective was to optimize and improve existing methods to isolate an enriched phospholipid fraction from freeze-dried egg yolk by selective supercritical carbon dioxide extraction (SCOJ A phospholipid-rich fraction was successfully extracted with a unique two-step process, consisting of a first step with CO^ and a second step with ethanol as co-eluent In an effort to optimize the extraction conditions of the two steps, pressure, time and temperature effects were investigated Optimal conditions were jkund to be 316 bar pressure, 123 minute time, 47°C sample temperature and 368 bar pressure, hour time, 5I°C sample temperature for the first and the second steps, respectively Results presented demonstrate that supercritical fluid extraction can lead to the isolation of a value-added ingredien t from freeze-dried egg yolk with high yield (11.61%) and purity (97%), which may be suitable to make liposomal based drugs Đặt vấn đê' Hiện nay, công nghệ chiết COj ởtrạng thái siêu tới hạn (SCO j) áp dụng phổ biến để chiết tách hoạt chất sử dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, hợp chất thiên nhiên, dược phẩm mỹ phẩm Công nghệ có nhiều ưu điểm so với phương pháp chiết xuất truyền thống dung môi hữu như: giảm bớt thời gian, giảm lượng dung môi sửdụng sản phẩm thu tinh khiết Gẩn việc sử dụng công nghệ SCO^ với mục đích chiết xuất phospholipid (PL) ngày sử dụng rộng rải [2], [3] Lòng đỏ trứng nguồn nguyên liệu giàu PL, lượng lipid chứa lòng đỏ trứng chứa khoảng 31% PL (trong 74% phosphatidyl cholin (PC), 15% phosphatidyl ethanolamin (PE) 11% thành phẩn khác) PL nguồn nguyên liệu để chế tạo liposom, coi hệ vận NghlẽncửudiíỌcThõngtlnthuõc Số1/2013 chuyển dược chất đến đích đẩy tri|n vọng, Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu nhằm áp dụng dạng thuốc liposom vào điểu trị Một lý giá thành thương phẩm liposom nguyên liệu chủ yếu chế tạo liposom PL nhập ngoại cao Vì vậy, mục đích nghiên cứu tìm thông số tối ưu trình chiết xuất nhằm nâng cao hiệu suất chiết độ tinh khiết PL từ lòng đỏ trứng phương pháp SCOj để thu PL đáp ứng nguyên liệu tạo liposom Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu Lòng đỏ trứng vịt đông khô co^ lỏng 99,99 % mua nhà máy khí hoá lỏng Yên Viên, Hà Nội Ethanol, cloroíorm, aceton, methanol số hoá chất khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích Thiết bị chiết SFE-250 (Mỹ), sắc ký lỏng ề hiệu cao sử dụng detector tán xạ ánh sáng bay hơi: HPLC- ELS (Shimadzu, Nhật) Máy cô quay chân không Yamato (Nhật) Phương pháp nghiên cứu Chiết phospholipid bàng phương pháp sco^ G IAI LỏNd suất (P): 250-400 bar; Thời gian (tg):120 phút; Hàm lượng dung môi phụ trợ (C): 1-10% Tiến hành 17 thí nghiệm điểu kiện nhiệt độ, áp suất, thời gian nổng độ dung môi phụ trợ lựa chọn Quy hoạch hoá thực nghiệm Sử dụng mô hình thực nghiệm quy hoạch trực giao bậc , ba yếu tố, khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới trình thực nghiệm, tất thông số khảo sát biến thiên Các bước phương pháp quy hoạch hoá thực nghiệm mô tả sơ đồ hình únb ĐOẠN G IAI ĐOẠN Hinh ĩ Thiẽt kẽ nghiên cứu Thịết kế nghiên cứu xây dựng theo mô ta hình Trước tiên, sử dụng dung môi co^ trạng thái siêu tới hạn để chiết loại lipid trung tính có lòng đỏ trứng (giai đoạn 1) Cặn thu giàu PL chiết tách lấy riêng PL dung môi CO^ pha trộn dung môi phụ trợ ethanol trạng thái siêu tới hạn (giai đoạn 2) Quá trình chiết tách PL thực thiết bị chiết siêu tới hạn SFT-250 tóm tắt sau Nạp lòng đỏ trứng đông khô vào bình chiết rổi tiến hành gia nhiệt để đưa COj vể trạng thái siêu tới hạn Sau giờ, giảm áp suất 45 bar, tháo dịch chiết vào bình tách có áo gia nhiệt Tại đây, COj hóa thoát ngoài, phẩn cặn thu lipid trung tính (giai đoạn ) PL (giai đoạn 2) Trong giai đoạn 2, dung môi phụ trợ ethanol bổ sung cách đổ trực tiếp vào bình chiết hay thông qua bơm với tốc độ bơm ml/phút Quá trình nghiên cứu thông số kỹ thuật ảnh hưởng tới hiệu suất chiết PL thực qua giai đoạn sau: Giai đoạn 1: khảo sát thông số chiết loại lipid trung tính cholesterol lòng đỏ trứng đông khô điều kiện: Nhiệt độ (T): 30 - 60°C; Áp suất (P): 200-400 bar; Thời gian (tg): 90-120 phút Giai đoạn 2: khảo sát thông số chiết phospholipid điều kiện: Nhiệt độ (T): 30-60“C; Áp , tfinh Các bước quỵ hoạch hoá thực nghiệm Phân tích thành phần lipid Sản phẩm lipid trung tính giai đoạn 1, PL giai đoạn phương pháp SCOj PL thu từ phương pháp chiết dung môi hữu phân tích HPLC-ELS có so sánh với chất chuẩn (Sigma, Mỹ), tiến hành phòng thí nghiệm hợp chất sinh học, Viện Krict, Hàn Quốc với điểu kiện sau: Cột; Agilent Prep SIL Scalar Column, 4.6 Xl50 mm, cỡ hạt |jm; Pha động: n-hexan: isopropanol: nước = 40: 58 : (v/v); Detector: ELS; Tốc độ dòng: 1,25 ml/phút; Chế độ chạy: gradient nồng độ; Nhiệt độ:60°c xử lý số liệu Các nghiên cứu thực sở mô hình thực nghiệm quỵ hoạch trực giao bậc , ba yếu tố, sử dụng phần mềm MODDE 8.0.2 để xây dựng phương trình thực nghiệm, mô kết đồ thị, tối ưu hóa thông số Kết bàn luận Tối ưu hóa yếu tố khảo sát Trong nghiên cứu PL tách chiết từ lòng đỏ trứng phương pháp sử dụng COj trạng thái siêu tới hạn, đồng thời xây dựng mô hình qui hoạch hóa thực nghiệm, khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất, từ đưa thông số tối ưu trình chiết xuất Các thí nghiệm tiến hành theo phương pháp cổ điển (lẩn lượt thay đổi thông số, giữ nguyên thông số lại với giả thiết thông số độc lập, không ảnh hưởng đến nhau) có hạn chế yếu tố ảnh hưởng tăng lên số lượng thí nghiệm tăng lên nhiểu lẩn Mặt khác, thực tế thông số ảnh hưởng tới trình cho biến thay đổi cố định thông số lại, mà tất thông số biến thiên Do cẩn phải xây dựng thực nghiệm cách chủ động sở phương pháp xử lý số liệu đại, phương pháp quy hoạch hoá thực nghiệm Trong phương pháp quy hoạch hoá thực nghiệm trực giao bậc hai, ba biến, thí nghiệm tiến hành điểu kiện ba biến đểu biến thiên tính hiệu suất thu hai giai đoạn giai đoại , tiến hành làm 17 thí nghiệm điểu kiện T, p, tg lựa chọn thu số liệu nêu bảng 1 Bỏng l Mo trận thực nghiệm chiétlipid trung tính, cholesterol STT 1 X, X, -1 -1 -1 Hiệu suất (%) T p tg 30 200 90 17 17,5 1 -1 -1 60 200 90 -1 -1 30 400 90 19,6 1 -1 400 -1 -1 60 30 200 90 120 25,1 17,9 1 -1 60 200 120 19,5 -1 1 30 400 120 20,8 1 1 60 400 120 27,7 10 -1,215 1,215 11 12 1 0 13 14 0 0 -1,215 1,215 0 -1,215 26,775 300 105 105 63,225 300 45 45 45 178,5 105 421,5 105 300 86,775 27,6 31,2 12 19,7 28,5 30,2 0 1,215 45 300 15 300 300 105 105 0 0 30,1 0 45 16 17 0 300 105 30,1 45 45 30,2 Ghi chú: giá trị két trung bình cùũ lán thí nghiệm điéu kiện Trong X , X lò bién má hóa cùa bién thực I p, tg ĩ: nhiệt độ chiét ( ĩ) , P: áp suât chiết (borị tg: thời gian chiễt (phút) Bảng thể kết nghiên cứu trình chiết lipid trung tính từ lòng đỏ trứng đông khô thực theo phương pháp bố trí ma trận thực nghiệm kế hoạch bậc trực giao yếu tố Trong đó, X,, Xj, X lẩn lượt biến mã hóa T, p, tg, cụ thể sau: ) tể - A r X = ^ - tg ~ ... chiết từ lòng đỏ trứng phương pháp sử dụng COj trạng thái siêu tới hạn, đồng thời xây dựng mô hình qui hoạch hóa thực nghiệm, khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất, từ đưa thông số tối ưu trình. .. phospholipid từ lòng đỏ trứng phương pháp sử dụng co^ trạng thái siêu tới hạn" , Tạp chí Dược học, 487, p.35-37 Montanari L, King J.W., List G.R., Rennick K.A (1995), "Selective extraction of phospholipids... 2) Quá trình chiết tách PL thực thiết bị chiết siêu tới hạn SFT-250 tóm tắt sau Nạp lòng đỏ trứng đông khô vào bình chiết rổi tiến hành gia nhiệt để đưa COj vể trạng thái siêu tới hạn Sau giờ,