Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, chitosan đƣợc cắt mạch trạng thái trƣơng dung dịch hydro peoxit chiếu xạ tia gamma Co-60 Khối lƣợng phân tử chitosan cắt mạch đƣợc xác định phƣơng pháp sắc kí gel thấm qua (GPC) Phổ hồng ngoại (FT-IR) tử ngoại – khả kiến (UV-vis) đƣợc sử dụng để nghiên cứu cấu trúc chitosan cắt mạch Kết cho thấy chitosan khối lƣợng phân tử thấp Mw ~ 30 - 45 kDa đƣợc chế tạo hiệu phƣơng pháp chiếu xạ chitosan trƣơng dung dich hydro peoxit liều xạ thấp 20 kGy Cấu trúc nhƣ độ đề axetyl chitosan cắt mạch hầu nhƣ không thay đổi so với chitosan ban đầu Hiệu suất cắt mạch xạ (Gs) đƣợc gia tăng đáng kể có mặt H2O2 Chitosan khối lƣợng phân tử thấp thu đƣợc có hoạt tính kháng khuẩn tốt, sử dụng để bảo quản thực phẩm mục đích kháng khuẩn khác Abstract: In this study, degradation of chitosan in swollen state with hydrogen peroxide solution by γ-irradiation was investigated Molecular weight (Mw) of irradiated chitosan was determined by gel permeation chromatography (GPC) Fourier transform infrared (FT-IR) and ultraviolet-visible (UV-vis) spectra were analyzed to study the structure changes of degraded chitosan The results showed that the chitosan of low Mw ~ 30 - 45 kDa was efficiently prepared by γ-irradiation of chitosan swollen in hydrogen peroxide solution at low dose less than 20 kGy The main structure as well as the degree of deacetylation of the degraded chitosan was almost no significant change Furthermore, the radiation degradation yield (Gs) was remarkably enhanced by the presence of H2O2 The obtained low Mw chitosan revealed high antimicrobial activity for E coli that can be used for food preservation and other purposes as well DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTS Chitosan CTSM91 Chitosan có khối lƣợng phân tử 91 kDa CTSM60 Chitosan có khối lƣợng phân tử 60 kDa CTSM45 Chitosan có khối lƣợng phân tử 45 kDa CTSM30 Chitosan có khối lƣợng phân tử 30 kDa ĐĐA Độ đề axetyl E coli Vi khuẩn Escherichia coli FT-IR Phƣơng pháp Phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier transform infrared) GPC Phƣơng pháp sắc kí gel thấm qua (Gel Permeation Chromatography) Gs Kí hiệu hiệu suất cắt mạch xạ HSCMBX, Hiệu suất cắt mạch xạ HSTĐPƢ Hằng số tốc độ phản ứng kGy Đơn vị iều hấp thụ xạ KLPT Khối lƣợng phân tử Mn Kí hiệu khối lƣợng phân tử trung bình số lƣợng Mw Kí hiệu khối lƣợng phân tử trung bình khối lƣợng UV-vis Phƣơng pháp phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - visible spectroscopy) XRD Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X–ray diffraction) γCo60 Bức xạ gamma Co – 60 w/v Khối lƣợng/thể tích α Mức thống kê DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số thông số đặc trƣng chitin, CTS Bảng 1.2 Nồng độ tối thiểu CTS để ức chế loài vi khuẩn khác 11 Bảng 2.1 KLPT thời gian lƣu mẫu chuẩn Pullulan 18 Bảng 3.1 Sự thay đổi ĐĐA CTS theo thời gian phản ứng 22 Bảng 3.2 KLPT CTS cắt mạch theo liều xạ với nồng độ H2O2 khác 25 Bảng 3.3 HSCMBX Gs theo liều xạ nồng độ H2O2 khác 27 Bảng 3.4 ĐĐA CTS chiếu xạ 10 kGy với nồng độ H2O2 khác 29 Bảng 3.5 KLPT PI CTS cắt mạch dạng trƣơng H2O2 5% 32 liều xạ 10 kGy với suất liều khác Bảng 3.6 Ảnh hƣởng H2O2 đến KLPT ĐĐA CTS liều xạ 33 10,5 kGy Bảng 3.7 Hiệu suất kháng khuẩn CTS có KLPT Mw (kDa) khác 35 E coli Bảng 3.8 Hiệu suất kháng khuẩn E Coli CTSM60 có nồng độ khác 36 Bảng 3.9 Hiệu suất kháng khuẩn E Coli CTS KLPT thấp theo thời gian khuấy tiếp xúc 37 DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Cấu tạo phân tử chitin Hình 1.2 Công thức cấu tạo CTS Hình 1.3 Công thức cấu tạo xác CTS Hình 2.3 Đƣờng chuẩn tƣơng quan KLPT thời gian lƣu 18 Pullulan Hình 2.4 Phổ đồ GPC thời gian lƣu mẫu chuẩn Pullulan với 19 KLPT a) 380.000, b) 23.700 c) 738 Hình 3.1 Ảnh hƣởng thời gian đề axetyl đến ĐĐA CTS 22 Hình 3.2 CTS có ĐĐA ~67% (a) ; 91% (b) chế tạo từ chitin 23 Hình 3.3 Sự suy giảm KLPT CTS trƣơng nƣớc 25 dung dịch H2O2 theo liều xạ Hình 3.4 Sự phụ thuộc (1/Mw –1/Mw0) CTS ( ĐĐA ~ 91,3%) cắt 28 mạch dạng trƣơng nƣớc theo liều xạ Hình 3.5 Phổ FT-IR CTS ban đầu (a) sản phẩm cắt mạch CTS 29 dạng trƣơng với H2O2 nồng độ 1% (b), 3% (c), 5% (d) liều xạ 10 kGy Hình 3.6 Giản đồ XRD CTS ban đầu (a) sản phẩm cắt mạch 30 CTS dạng trƣơng với H2O2 nồng độ 1% (b), 3% (c), 5% (d) liều xạ 10 kGy Hình 3.7 Phổ UV-vis dung dịch CTS 0,1% có KLPT khác 31 dung dịch axit axetic 0,05% Hình 3.8 CTS ban đầu – dạng bột (a), CTS trƣơng dung dịch 32 H2O2 5% (b) CTS sau chiếu xạ (c) Hình 3.9 Phổ FT-IR sản phẩm cắt mạch CTS dạng trƣơng với 34 H2O2 nồng độ 0% (5ml H2O/1g CTS, a); 5% (b); 7,5% (c); 10% (d) liều xạ 10,5 kGy Hình 3.10 Sự phát triển E.coli sau 24h cấy vào môi trƣờng 35 CTSM60 (b) so với môi trƣờng đối chứng (a) Hình 3.11 Sự phát triển E.Coli sau 24h cấy vào môi trƣờng đối chứng (a) môi trƣờng chứa CTSM60 nồng độ 25 ppm (b) 50 ppm (c) 36 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH VẼ ii DANH MỤC BẢNG iii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ CHITIN, CHITOSAN 1.1.1 Cấu trúc phân tử 1.1.2 Các phản ứng hóa học chitin, chitosan 1.1.3 Một số dẫn xuất chitin 1.1.4 Các ứng dụng chitosan 1.2 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP 10 1.2.1 Chitosan khối lƣợng phân tử thấp 10 1.2.2 Hoạt tính chitosan khối lƣợng phân tử thấp 10 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 15 2.2 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 15 2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC VÀ THÔNG SỐ ĐẶC TRƢNG CỦA CHITOSAN 16 2.3.1 Đo phổ IR 16 2.3.2 Đo phổ UV-vis 17 2.3.3 Đo XRD 17 2.3.4 Xác định độ đề axetyl 17 2.3.5 Xác định khối lƣợng phân tử 17 2.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ BIẾN TÍNH CHITOSAN 20 2.4.1 Phƣơng pháp đề axetyl chitin chế tạo chitosan 20 2.4.2 Phƣơng pháp biến tích cắt mạch chitosan 20 2.5 PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT HIỆU ỨNG KHÁNG KHUẨN 20 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 CHẾ TẠO CTS CÓ ĐĐA TỪ 70% ĐẾN 90% 22 3.2 CHẾ TẠO CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP 24 3.2.1 Ảnh hƣởng nồng độ/ liều xạ đến suy giảm khối lƣợng phân tử 25 3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ/ liều xạ đến độ đề axetyl 29 3.3 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP 34 3.3.1 Ảnh hƣởng khối lƣợng phân tử chitosan 34 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ chitosan 36 3.3.3 Ảnh hƣởng thời gian khuấy tiếp xúc KẾT LUẬN Tài liệu tham khảo MỞ ĐẦU Chitosan polyme có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sản xuất từ chitin cách loại nhóm axetyl Chitosan tự phân hủy sinh học, độc tính thấp, hoạt tính sinh học cao đa dạng Chúng có khả kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng cƣờng miễn dịch thể với tác dụng kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol máu, hạn chế phát triển khối u, có tác dụng tốt vết thƣơng, vết bỏng [41] Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, chitiosan đƣợc ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực khác đời sống Chitosan dùng để sản xuất glucosamin; vải; sơn công nghiệp, làm khâu phẫu thuật y tế, làm chất bảo vệ hoa nông nghiệp, chất hấp phụ kim loại nặng bảo vệ môi trƣờng [2] Chitosan thông thƣờng có khối lƣợng phân tử cao, tan môi trƣờng axit Điều làm hạn chế khả ứng dụng loại polyme nhiều trƣờng hợp Các phƣơng pháp cắt mạch chitosan để giảm khối lƣợng phân tử, nhằm mở rộng khả ứng dụng loại polyme này, đƣợc tập trung nghiên cứu vài năm gần Trong đó, phƣơng pháp phổ biến bao gồm: phƣơng pháp hóa học sử dụng tác nhân oxy hóa, phƣơng pháp enzym phƣơng pháp chiếu xạ Phƣơng pháp enzyme cắt mạch chitosan cho hiệu suất cao nhiên giá thành đắt nhiều so với phƣơng pháp hóa học Phƣơng pháp chiếu xạ gamma Co – 60 phƣơng pháp hóa học sử dụng H2O2 đƣợc cho kỹ thuật cắt mạch hiệu thân thiện với môi trƣờng thời điểm Vấn đề chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn đƣợc nghiên cứu từ lâu Kết cho thấy khả kháng khuẩn chitosan phụ thuộc phức tạp vào khối lƣợng phân tử, độ đề axetyl, phân bố khối lƣợng phân tử nguồn gốc chitin Những nghiên cứu gần cho thấy chitosan có khối lƣợng phân tử trung bình có khả kháng khuẩn tốt Tuy vậy, hiệu kháng khuẩn phụ thuộc vào độ đề axetyl vấn đề chƣa đƣợc làm rõ Từ thông tin chọn thực đề tài: “Nghiên cứu chế tạo chitosan khối lƣợng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn” Trong khuôn khổ công trình khoa học cấp sở, đề tài không sâu nghiên cứu cấu trúc chi tiết sản phẩm vấn đề đƣợc thực phần đề tài có liên quan trƣớc Đề tài xem xét chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn làm rõ mối quan hệ khối lƣợng phân tử độ đề axetyl đến hoạt tính kháng khuẩn chitosan với nội dung nghiên cứu cụ thể nhƣ sau: a) Nội dung 1: Chế tạo chitosan có độ đề axetyl khoảng 70 – 90 % nhiệt độ phòng - Khảo sát thời gian phản ứng - Độ đề axetyl theo thời gian phản ứng b) Nội dung 2: Chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn cắt mạch sử dụng H2O2/ tia γ - Ảnh hƣởng nồng độ/liều xạ đến suy giảm khối lƣợng phân tử - Ảnh hƣởng nồng độ/liều xạ đến độ đề axetyl c) Nội dung 3: Khảo sát khả kháng khuẩn chitosan chế tạo đƣợc lên vi khuẩn Ecoli - Ảnh hƣởng khối lƣợng phân tử chitosan - Ảnh hƣởng nồng độ chitosan Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ CHITIN, CHITOSAN 1.1.1 Cấu trúc phân tử - Công thức cấu tạo chitin [32]: OH OH O O OH NHCOCH3 OH O O OH NHCOCH3 OH O OH O OH NHCOCH3 O O NHCOCH3 Hình 1.1 Cấu tạo phân tử chitin - Công thức cấu tạo chitosan (CTS) [29], [33]: Hình 1.2 Công thức cấu tạo CTS - Công thức nguyên: (C6H11NO4)n - Khối lƣợng phân tử (KLPT) trung bình: Mn = (161,157)n - Thành phần nguyên tố: %C = 44,72%, %H = 6,88%, %O = 39,71% %N = 8,69% Nhƣ vậy, CTS dẫn xuất chitin thu đƣợc từ phản ứng đề axetyl hoá, tách gốc axetyl khỏi nhóm amino vị trí C2 Đơn vị cấu tạo phân tử CTS D - glucosamin, mắt xích đƣợc liên kết với liên kết sau [32]: [15] El – Sawy N.M., El – Rehim H.A.A., Elbarbary A.M., Hegazy E.A (2010), “Radiation – induced degradation of chitosan for possible use as a growth promoter in agricultural purposes”, Carbohydrate Polymers 79, pp 555-562 [16] Gerasimenko D V., Avdienko I D., Bannikova G E., Zueva, O Y., & Varlamov V P (2004) Antibacterial effects of water-soluble low-molecularweight chitosans on different microorganisms Applied Biochemistry and Microbiology, 40, 253–257 [17] Gibson G R and Roberfroid M B., (1995) Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics J Nutr, 125: 1401-1412 [18] Han W T., et al (2002), Chitosan as matrix for nasal delivery of peptide drug (insulin), Proc of the 5th Asia Pacific Chitin and Chitosan, pp 674-682 [19] Hirano, S., & Nagao, N (1989) Effects of chitosan, pectic acid, lysozyme and chitinase on the growth of several phytopathogens Agricultural and Biological Chemistry, 53, 3065–3066 [20] Huang R L., et all (2005) Effect of dietary oligochitosan supplementation on ileal digestibility of nutrients and performance in broilers Poultry Science, 84: 1383-1388 [21] Je, J Y., Park, P J., & Kim, S K (2004) Free radical scavenging properties of hetero-chitooloigosaccharides using an ESR spectroscopy Food and Chemical Toxicology, 42, 381–387 [22] Jeon, Y J., & Kim, S K (2000) Production of chitooligosaccharides using ultrafiltration membrane reactor and their antibacterial activity Carbohydrate Polymers, 41, 133–141 [23] Jeon, Y J., & Kim, S K (2002) Antitumor activity of chisan oligosaccharides produced in an ultra filtration membrane reactor system Journal of Microbiology and Biotechnology, 12, 503–507 41 [24] Jeon, Y J., Park, P J., Byun, H G., Song, B K., & Kim, S K (1998) Production of chitosan oligosaccharides using chitin-immobilized enzyme Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering, 13, 147–154 [25] Jeon, Y J., Shahidi, F., & Kim, S K (2000) Preparation of chitin and chitosan oligomers and their applications in physiological functional foods Food Review International, 61, 159–176 [26] Jeon Y J., Park P J., Kim S K., (2001) Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor Carbohydrate Polymers, 44: 71–76 [27] Jeon Y J and Kim S K., (2001) Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharides N-conjugated with asparagines Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, 281–286 [28] Kang B., Dai D.Y, Zhang Q.H., Chen D (2007), “Synergetic degradation of chitosan with gamma radiation and hydrogen peroxide”, Polymer Degradation and Stability 92, pp 359-362 [29] Kim J Y., Lee J K., Lee T S., & Park, W H (2003) Synthesis of chitooligosaccharide derivative with quaternary ammonium group and its antimicrobial activity against Streptococcus mutans, International Journal of Biological Macromolecules, 32, 23–27 [30] Kurita, K (1998) Chemistry and application of chitin and chitosan, Polymer Degradation and Stability, 59, 117–120 [31] Macchi, G (1996) A new approach to the treatment of obesity: Chitosan’s effects on body weight reduction and plasma cholesterol levels Acta Toxicological Therapeutics, 27, 303–320 [32] Majeti N.V Ravi Kumar (2000), A review of chitin and chitosan applications, Reactive & Functional Polymers, 46, 1–27 42 [33] Marguerite R (2006), Chitin and chitosan: Properties and applications, Prog Polym Sci., 31, 603–632 [34] Nishimura K., Nishimura S., Nishi N., Saiki I., Tokura S., Azuma I., (1984) Immunological activity of chitin and its derivatives Vaccine, 2: 93–99 [35] Omura Y., Renbbutsu E., Nishiyama M., Morimoto M., Saimoto H., and Shigemasa Y., (2002), Synthesis of New Derivatives and Their Metal Adsorption Behavior, Chitin and Chitosan in Life Science, pp 370-371 [36] Park P J., Je J Y., Byun H G., Moon S H., Kim S K., (2004) Antimicrobial activity of hetero-chitosans and their oligosaccharides with different molecular weights Journal of Microbiology and Biotechnology, 14: 317–323 [37] Park P J., Kim S K., Lee H K., (2002) Antimicrobial activity of chitooligosaccharides on Vibrio parahaemolyticus Journal of Chitin and Chitosan, 7: 225–230 [38] Peniche C., Argüelles-Monal W., Davidenko N., Sastre R., Gallardo A., Román J.S (1999), “Self-curing membranes of chitosan/PAA IPNs obtained by radical polymerization: preparation, characterization and interpolymer complexation”, Biomaterials 20, pp 1869-1878 [39] Qin C., Li H., Xiao Q., Liu Y., Zhu J., Du Y (2006), “Water-solubility of chitosan and its antimicrobial activity”, Carbohydrate Polymers 63, pp 367-374 [40] Qin C.Q., Du Y.M., Xiao L (2002), “Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan”, Polymer Degradation and Stability 76, pp 211-218 [41] Shao J., Yang Y., Zhong Q (2003), “Study on preparation of oligoglucosamine by oxidative degradation under microwave”, Polymer Degradation and Stability 82, pp 395-398 43 [42] Smidsrod O., and Varum K M., (2002), Structure function relations in chitosans, Chitin and Chitosan in Life Science, pp 1-11 [43] Souad El Ouakfaoui, Alain Asselin (1992), Multiple froms of chitosanase activities, Phytocchemistry, 31(5), pp 1513 - 1518 [44] Sudharshan N R., Hoover D G., Knorr D., (1992) Antibacterial action of chitosan Food Biotechnology, 6: 257–272 [45] Tahtat D., Mahlous M., Benamer S., Khodja A.N., Youcef S.L (2012), “Effect of molecular weight on radiation chemical degradation yield of chain scission of γ-irradiated chitosan in solid state and in aqueous solution”, Radiation Physics and Chemistry 81, pp 659-665 [46] Tarsi R., Corbin B., Pruzzo C., Muzzarelli R A., (1998) Effect of low molecular-weight chitosans on the adhesive properties of oral streptocci Oral Microbiol Immunol, 34: 217–224 [47] Terbojevich M., Cosani A., Focher B., Marsano E (1993), “Highperformance gel-permeation chromatography of chitosan samples”, Carbohydrate Research 250, pp 301-314 [48] Uchida, Y., Izume, M., & Ohtakara, A (1989) Preparation of chitosan oligomers with purified chitosanase and its application In G Braek, T Anthonsen, & P Sandford (Eds.), Chitin and chitosan: Sources, chemistry, biochemistry, physical properties and applications (pp 372–382) Barking, UK: Elsevier Applied Science [49] Ueno, K., Yamaguchi, T., Sakairi, N., Nishi, N., & Tokura, S (1997) Antimicrobial activity by fractionated chitosan oligomers In A Domard, G A F Roberts, & K M Varum (Eds.), Advances in chitin science (pp 156–161) Lyon: Jacques Andre Publisher 44 [50] Ulanski P., Rosiak J.M (1992), “Preliminary study on radiation-induced changes in chitosan”, Radiation Physics and Chemistry 39, pp 53-57 [51] Ulanski P., von Sonntag C (2000), “OH – radical – induced chain scission of chitosan in the absence and presence of dioxygen”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2, pp 2022-2028 [52] Wasikiewicz J.M., Yeates S.G (2013), “ “Green” molecular weight degradation of chitosan using microwave irradiation”, Polymer Degradation and Stability 98, pp 863-867 [53] Wolfgang F.Osswald, Jeffrey P.S., Hamed D., Roy E Mc., Randall P.N., C.Joseph Naim, C Jack Hearn, Richard T Mayer (1994), Identification and characterization of acidic hydrolases with chitinase and chitosanase activities from sweet orange callus tissue, Plant Cell Physiol., 35(5), pp.811-820 [54] Woods R.T., Pikaev A.K (1994), Applied radiation chemistry: radiation processing, New York: Wiley [55] Yanagiguchi K., Ikeda T., Takai F., Ogawa K., and Hayashi Y., (2002), Wound Heading Following Direct Pulp Capping with Chitosan - Ascorbic Acid Complex in Rat Incisors, Chitin and Chitosan in Life Science, pp 240-243 45 Công bố đề tài: Study on gamma - irradiation degradation of chitosan swollen in H2O2 solution and its antimicrobial activity for E.coli, Nuclear Science and Technology, accepted PHỤ LỤC 561.25 690.47 1072.35 1417.58 1379.01 1315.36 1550.66 1674.10 3250 2889.17 3500 3101.32 3263.33 1.5 Abs 1.25 3494.77 Phụ lục 1: CHẾ TẠO CTS CÓ ĐĐA TỪ 70% ĐẾN 90% 0.75 0.5 0.25 -0.25 -0.5 -0.75 -1 -1.25 -1.5 -1.75 4000 3750 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 1/cm 565.10 894.91 1068.49 1421.44 1379.01 1319.22 1647.09 1.5 Abs 2879.52 3506.35 Hình PL 1.1 FT-IR chitin ban đầu 1.25 0.75 0.5 0.25 -0.25 -0.5 -0.75 -1 -1.25 -1.5 -1.75 4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 Hình PL 1.2 FT-IR chitin sau 24 đề axetyl 500 1/cm 592.10 894.91 1076.20 1421.44 1375.15 1319.22 1647.09 2879.52 3506.35 1.5 Abs 1.25 0.75 0.5 0.25 -0.25 -0.5 -0.75 -1 -1.25 -1.5 4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 Hình PL 1.3 FT-IR chitin sau 48 đề axetyl Hình PL 1.4 FT-IR chitin sau 72 đề axetyl 750 500 1/cm 557.39 894.91 1081.99 1421.44 1380.94 1323.08 1658.67 2881.45 1.25 Abs 3550.71 Hình PL 1.5 FT-IR chitin sau 96 đề axetyl 0.75 0.5 0.25 -0.25 -0.5 -0.75 -1 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 Hình PL 1.6 FT-IR chitin sau 144 đề axetyl 600 400 1/cm 594.03 1081.99 1153.35 1323.08 1421.44 Abs 1652.88 3446.56 1.5 2881.45 Phụ lục CHẾ TẠO CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP 1.35 1.2 1.05 0.9 0.75 0.6 0.45 0.3 0.15 4000 3600 M-240s 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 1/cm Hình PL 2.1 Phổ FT – IR CTS có ĐĐA ~ 91,3% chế tạo từ CTS có ĐĐA ~ 67% cách đề axetyl lần 6.666/854552 uRIU 15 Detector B Ch1 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình PL 2.2 Sắc kí đồ GPC CTS có Mw ~ 91,7 kDa; PI=2,26, ĐĐA= 91,3% chế tạo từ CTS có ĐĐA ~ 67% cách đề axetyl lần Hình PL 2.3 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 83 kDa, PI = 2,3) tia γ, liều xạ 20 kGy, dạng trương nước (1gCTS/5ml H2O), từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) 7.843/818725 uRIU Detector B Ch1 7.5 5.0 2.5 0.0 -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.4 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 38 kDa, PI = 2,48) tia γ, liều xạ 20 kGy, dạng trương dung dịch H2O2 1%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) 7.946/811767 uRIU Detector B Ch1 -1 -2 -3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.5 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 36 kDa, PI = 2,52) tia γ, liều xạ 20 kGy, dạng trương dung dịch H2O2 3%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) 7.975/917757 uRIU Detector B Ch1 7.5 5.0 2.5 0.0 -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.6 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 35 kDa, PI = 2,51) tia γ, liều xạ 10 kGy, dạng trương dung dịch H2O2 5%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) 8.062/810859 uRIU Detector B Ch1 -1 -2 -3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.7 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 32 kDa, PI = 2,51) tia γ, liều xạ 15 kGy, dạng trương dung dịch H2O2 5%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) uRIU 8.236/779340 Detector B Ch1 -1 -2 -3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.8 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 30 kDa, PI = 2,49) tia γ, liều xạ 20 kGy, dạng trương dung dịch H2O2 5%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) 8.304/770358 uRIU Detector B Ch1 -1 -2 -3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.9 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 28,3 kDa, PI = 2,41) tia γ, liều xạ 10 kGy (1,8 kGy/h), dạng trương dung dịch H2O2 5%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) uRIU 8.468/762624 Detector B Ch1 -1 -2 -3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.10 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 26,9 kDa, PI = 2,40) tia γ, liều xạ 10 kGy (0,9 kGy/h), dạng trương dung dịch H2O2 5%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) 8.522/800704 uRIU Detector B Ch1 -1 -2 -3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 m in Hình PL 2.11 Sắc kí đồ GPC CTS cắt mạch (Mw = 26,3 kDa, PI = 2,41) tia γ, liều xạ 10 kGy (0,45 kGy/h), dạng trương dung dịch H2O2 5%, từ CTS ban đầu (Mw ~ 91,7 kDa, PI=2,26) Phụ lục KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP Hình PL 3.1 Kết phân tích E.coli mẫu đối chứng Hình PL 3.2 Kết phân tích E.coli mẫu CTSM91 Hình PL 3.3 Kết phân tích E.coli mẫu CTSM60 Hình PL 3.4 Kết phân tích E.coli mẫu CTSM30 [...]... HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP 1.2.1 Chitosan khối lƣợng phân tử thấp Về cơ bản chitosan khối lƣợng phân tử thấp có cấu tạo nhƣ CTS nhƣng KLPT nhỏ hơn 100 kDa CTS KLPT thấp đƣợc chế tạo bằng cách cắt mạch CTS ban đầu theo những phƣơng pháp khác nhau [28] 1.2.2 Hoạt tính của chitosan khối lƣợng phân tử thấp Hoạt tính sinh học của CTS KLPT thấp khá đa dạng, bao gồm: tính kháng. .. strain Vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram dƣơng a MIC là nồng độ thấp nhất của CTS có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn  Các cơ chế kháng khuẩn của CTS KLPT thấp Không giống nhƣ chitin, CTS KLPT thấp sở hữu các nhóm amino tự do trong cấu trúc của nó Số nhóm amino này thể hiện vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng khuẩn và một số cơ chế đã đƣợc đề nghị để mô tả hoạt tính này [9] Cơ 11 chế đƣợc... thực phẩm, CTS KLPT thấp thu hút sự quan tâm trong nghiên cứu ứng dụng nhờ khả năng kháng khuẩn và chống oxi hoá Từ các tính chất này, CTS KLPT thấp đƣợc xem nhƣ là chất nâng cao chất lƣợng dinh dƣỡng của thực phẩm [24] KLPT thấp của CTS đƣợc coi là một đặc tính quan trọng liên quan nhiều đến hoạt tính sinh học của nó Hoạt tính kháng khuẩn của CTS và các dẫn xuất đối với một số loài vi khuẩn đã đƣợc công... KLPT thấp có thể làm thay đổi các đặc tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và ngăn cản sự tiếp nhận khoáng chất hoặc gây rò rỉ các thành phần tế bào mà cuối cùng dẫn đến cái chết của vi khuẩn [43] Một cơ chế khác đƣợc đề nghị để giải thích về hoạt tính kháng khuẩn của CTS KLPT thấp là sự ngăn chặn việc sao chép RNA do sự hấp phụ của CTS KLPT thấp thâm nhập vào DNA của vi khuẩn [29] Để thỏa mãn cơ chế. .. kháng khuẩn tốt nhất [11] Xu hƣớng tăng hoạt tính kháng khuẩn của CTS cùng với sự gia tăng KLPT cũng đã đƣợc công bố [35] Trong nghiên cứu gần đây, Ueno, Yamaguchi, Shakairi, Nishi, và Tukora [48] đã xác nhận CTS có KLPT nhỏ hơn 2,2 kDa không có khả năng ngăn chặn sự phát triển vi khuẩn Khi tăng 12 KLPT lên khoảng 5,5 kDa, CTS đã thể hiện hoạt tính ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn và hiệu quả kháng. .. vi khuẩn là một hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng [36] 13  Các tính chất tích điện của thành tế bào vi khuẩn Ngoài đặc điểm tích điện dƣơng của CTS, sự phân bố điện tích của thành tế bào vi khuẩn đóng một vai trò đáng kể đối với các hoạt động kháng khuẩn của CTS và dẫn xuất của chúng Chung và cộng sự [11] nghiên cứu các đặc điểm bề mặt tế bào của một số loài vi khuẩn gram dƣơng và gram âm đã xác nhận có. .. quả kháng khuẩn tùy thuộc vào liều áp dụng Một công bố khác cũng cho thấy CTS có KLPT từ 5 - 27 kDa cho khả năng ngăn chặn sự phát triển vi khuẩn khá hiệu quả[17] Do điện tích dƣơng tạo thuận lợi cho hoạt động kháng khuẩn của CTS, nên sự thay đổi các nhóm amin ở vị trí C-2 của glucosamine bằng các nhóm tích điện dƣơng mạnh hơn nhằm tăng cƣờng hoạt tính kháng khuẩn của CTS đã đƣợc nghiên cứu Jeon và... ứng lên đến 144 giờ mới thu đƣợc CTS có ĐĐA ~ 97% Trong nghiên cứu của chúng tôi, với nồng độ NaOH 50% sau khoảng 72 giờ phản ứng đã thu đƣợc CTS có ĐĐA ~ 70% Hình 3.2 CTS có ĐĐA ~ 67% (a); 91% (b) chế tạo từ chitin 23 Để thu đƣợc CTS có ĐĐA ≥ 70% cho nghiên cứu, qua tham khảo các tài liệu [7], [45] và tiến hành các phản ứng thử nghiệm chúng tôi đã chế tạo đƣợc CTS có ĐĐA khoảng 91% (hình 3.2b) bằng... KLPT thấp đã tạo điều kiện cho chúng liên kết với tế bào vi khuẩn dẫn tới ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn Nhóm tích điện dƣơng ở vị trí C-2 của monome glucosamine tƣơng tác với nhóm axit cacboxylic tích điện âm của các đại phân tử trên bề mặt tế bào vi khuẩn tạo ra các phức polyelectrolyte [10], [29] Các phức polyelectrolyte có thể hoạt động nhƣ lớp không thấm xung quanh tế bào và cản trở các hoạt. .. (CTS-GTMAC) ức chế đáng kể sự tăng trƣởng của S.mutans so với CTS Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đƣợc gia tăng đáng kể khi CTS đƣợc gia tăng tích điện dƣơng Những quan sát này là phù hợp với sự hiểu biết chung về hoạt động kháng khuẩn của CTS và dẫn xuất của chúng Vì vậy, trên thực tế sự thay đổi cấu trúc của CTS bằng cách đƣa vào các nhóm tích điện dƣơng để cải thiện hoạt tính kháng khuẩn, đảm ... 1.2 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP 1.2.1 Chitosan khối lƣợng phân tử thấp Về chitosan khối lƣợng phân tử thấp có cấu tạo nhƣ CTS nhƣng KLPT nhỏ 100 kDa CTS KLPT thấp. .. TẮT CTS Chitosan CTSM91 Chitosan có khối lƣợng phân tử 91 kDa CTSM60 Chitosan có khối lƣợng phân tử 60 kDa CTSM45 Chitosan có khối lƣợng phân tử 45 kDa CTSM30 Chitosan có khối lƣợng phân tử 30... đề chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn đƣợc nghiên cứu từ lâu Kết cho thấy khả kháng khuẩn chitosan phụ thuộc phức tạp vào khối lƣợng phân tử, độ đề axetyl, phân bố khối lƣợng phân tử nguồn