Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 PHN TH NHT M U 1.1 T VN nc ta, trng trt v chn nuụi ú l hai ngnh truyn thng ó cú t lõu i ca cha ụng ta Hai ngnh ny luụn song song tn ti v h tr cựng phỏt trin Vit Nam l nc cú th mnh v trng trt, l mt nhng quc gia ng u v xut khu go, c phờ, h tiờu, ht iu Trong ú, ngnh chn nuụi nc ta nhng nm gn õy cng ang trờn phỏt trin mnh v thu c nhng kt qu kh quan nh giai on 2002 -2005 tc chn nuụi bỡnh quõn cao hn ngnh trng trt lờn n 9.8%/nm c bit ngnh chn nuụi gia sỳc ln nh trõu, bũ, dờ, ln l ngh chn nuụi truyn thng v cú vai trũ quan trng i vi Nụng nghip ca Vit Nam thi k hi nhp Thc hin ch trng ca chớnh ph v chuyn i c cu kinh t nhm nõng cao nng sut, cht lng, hiu qu ca chn nuụi v tng thu nhp cho nụng dõn, mc dự cũn gp nhiu khú khn nhng chn nuụi gia sỳc ln luụn gi c mc tng trng tt v tng bc ỏp ng nhu cu tht, sa ngy cng cao ca t nc c bit cú quyt nh 167/2001 ca Th tng chớnh ph v chớnh sỏch phỏt trin bũ sa thỡ n bũ sa Vit Nam ó phỏt trin mnh m Mt du n quan trng i vi Vit Nam ú l chớnh thc tr thnh thnh viờn th 150 ca T chc thng mi th gii (WTO) Khi gia nhp WTO nc ta ng trc rt nhiu c hi ln song nhng thỏch thc m chỳng ta phi i u cng khụng phi l ớt Cnh tranh s din gay gt hn vi nhiu i th hn trờn bỡnh din rng hn, sõu hn Ngnh nụng nghip cng khụng phi l ngoi l ó cú nhiu chuyờn gia nhn nh rng nhng thỏch thc i vi ngnh Nụng nghip l quỏ ln so vi c hi mang li Nu Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 i sõu vo tng lnh vc Nụng nghip thỡ chn nuụi l im yu nht ú m thỏch thc ca ngnh chn nuụi nc phi i u l rt ln Do ú, mc tiờu t l cn a chn nuụi tr thnh ngnh sn xut chớnh v chim v trớ cao ngnh sn xut Nụng nghip t c mc tiờu ú, ng v chớnh ph luụn dnh s quan tõm u t cho ngnh chn nuụi Vit Nam Tuy vy, iu kin khớ hu Vit Nam cựng vi cỏi nhỡn tng th v chn nuụi thỡ c im chung ca c nc l mụ hỡnh chn nuụi phõn tỏn, ch yu ly cụng lm lói, cha cú nhiu trung tõm chn nuụi chuyờn nghip vi quy mụ ln, iu kin chm súc nuụi dng cú s khỏc nhau, khụng ng b nờn cỏc ch tiờu sn xut ca n trõu, bũ v.v cng b nh hng, cỏc ch tiờu sinh sn khụng n nh, c bit l hin tng ri lon sinh sn xy trờn n gia sỳc cỏi, khụng chu c hoc cht lng tinh suy gim ca c ging v.v lm cho vic phỏt trin n gia sỳc gp nhiu khú khn Cú nhiu nguyờn nhõn dn ti tỡnh trng trờn nh: di truyn, ch chm súc nuụi dng, quỏ trỡnh khai thỏc v qun lý n, d tt v cỏc bnh lý c quan sinh sn v c bit ri lon ni tit, ó lm cho t l ton n thp, t l th thai thp, h s phi ging cao v khong cỏch kộo di v.v õy l nhng yu t hn ch khụng nhng lm gim nng sut sinh sn ca n gia sỳc m cũn nh hng rt ln ti hiu qu kinh t cho ngi chn nuụi Mun lm gim thit hi cỏc yu t ú gõy cn phi cú nhng bin phỏp chn oỏn nhanh, chớnh xỏc cú c phng hng iu tr hiu qu nhm ci thin v nõng cao nng sut sinh sn ca chỳng, t ú phỏt trin n trõu, bũ núi riờng v phỏt trin ngnh chn nuụi gia sỳc núi chung Vit Nam Mt nhng nguyờn nhõn chớnh gõy ri lon sinh sn trõu, bũ núi riờng v cỏc n gia sỳc núi chung ú l s thay i cỏc ch tiờu sinh lý, sinh húa, s chuyn húa ca cỏc hormon sinh sn quan trng nh progesterone, Follicle Stimulating Hormone (FSH), Luteinizing Hormone (LH), testosterone v.v Do ú, vic nh lng cỏc hormone sinh sn ny Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 nhm xỏc nh thc trng cỏc ri lon ni tit, thc trng sinh lý cng nh bnh lý ca vt nuụi ri t ú gii phỏp phự hp ci thin nng sut sinh sn l hp lý v cn thit Cựng vi quỏ trỡnh phỏt trin ca nhõn loi, ngnh cụng ngh sinh hc c i v ó thu c nhiu thnh tu quan trng Cỏc cụng ngh nh sc kớ lng kt ni ph (Liquid Chromatography Mass Spectrophotometer LC MS), k thut dch phúng x (Radioactive Immuno Assay RIA) v.v l mt nhng thnh tu ú Nh vo cỏc thit b cụng ngh cao ny ngi ta cú th phỏt hin v phõn tớch hm lng ca cỏc hormone sinh sn núi riờng v cỏc c cht sinh hc núi chung Tuy nhiờn, õy l cỏc cụng ngh liờn quan n cỏc thit b t tin, hnh phc hoc phi s dng n cht phúng x v.v õy l k thut khụng phi nc no cng cú th ỏp dng c rng rói, ú, vic s dng khỏng th n dũng to cỏc b kit-ELISA nhm phõn tớch nh tớnh v nh lng cỏc cht sinh hc núi chung v cỏc hormone sinh sn núi riờng li rt hiu qu m ớt tn kộm So vi cỏc phng phỏp nh tớnh v nh lng khỏc thỡ phng phỏp ELISA s dng cỏc kit ELISA nh lng nh ng dng cụng ngh khỏng th n dũng d thc hin cỏc phũng thớ nghim v khụng ũi hi cỏc thit b cụng ngh cao vi k thut phc Hin nay, cú nhiu cụng ty sinh hc sn xut v bỏn cỏc kit-ELISA ny Nm 1975, Georges Kohler, Cộsar Milstein, v Niels Kaj Jerne ln u tiờn sn xut v a khỏi nim v khỏng th n dũng (monoclonal antibody) Cỏc ụng ó nhn c gii Nobel nh tm quan trng, ý ngha khoa hc cng nh thc tin ca khỏng th n dũng So vi khỏng th a dũng, khỏng th n dũng cú tớnh c hiu (quyt nh s chn lc) v ỏi lc khỏng nguyờn khỏng th (quyt nh nhy) rt cao, vỡ vy ó m rng phm vi, lnh vc ng dng ca khỏng th n dũng m khỏng th a dũng khụng cú c Vit Nam, hin cỏc kit-ELISA phõn tớch nh lng cỏc Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 hormone núi trờn u phi nhp khu t M, Anh, Thỏi Lan v.v vi giỏ thnh rt cao nờn cha th s dng rng rói Do vy, to cỏc dũng t bo lai hybrid sn sinh khỏng th n dũng khỏng mt s hormone sinh sn quan trng nh progesterone, FSH, LH c bit l FSH Vit Nam nhm ng dng phõn tớch nh tớnh v nh lng nhng hormone ny thc s cn thit phc v cho vic phỏt trin ngnh chn nuụi Vit Nam Cú c khỏng th n dũng khỏng cỏc hormone trờn sn xut ti Vit Nam s giỳp to cỏc kit phõn tớch nh lng vi giỏ thnh thp T ú vic ng dng rng rói cỏc kit phõn tớch ny h tr chn oỏn v ci thin nng sut sinh sn cho vt nuụi nh trõu, bũ, dờ v.v s tr nờn hiu qu hn Xut phỏt t nhng c s nờu trờn v t yờu cu thc tin nhm nõng cao nng sut sinh sn ca gia sỳc t ú cú th a chn nuụi tr thnh ngnh sn xut chớnh v chim v trớ cao ngnh sn xut nụng nghip ca t nc, chỳng tụi tin hnh ti: To dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng khỏng FSH 1.2 MC CH CA TI To c dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng (mAb) khỏng c hiu hormone sinh sn FSH Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 PHN HAI TNG QUAN TI LIU 2.1 GII THIU V HORMONE NểI CHUNG V HORMONE SINH SN FOLLICLE STIMULATING HORMONE (FSH) Hormone l nhng cht truyn tin húa hc, cỏc t bo c bit tit vi lng nh, thng vo mỏu v nh dũng mỏu a n c quan nhn, ti ú chỳng phỏt huy tỏc dng iu hũa cỏc hot ng sinh lý v cỏc quỏ trỡnh chuyn húa ca c th, ng thi chu tỏc ng theo phng thc iu khin xuụi v ngc Cng nh enzyme v vitamin, hormone cú tỏc dng nh mt cht xỳc tỏc sinh hc, xỳc tỏc nhiu quỏ trỡnh chuyn húa ca c th Hormone cú tỏc dng iu hũa quỏ trỡnh sinh lý quan trng nh sinh trng, phỏt dc, sinh sn ( Lờ c Trỡnh, 1991) [11] 2.1.1 S iu hũa hot ng sinh dc ca tuyn ni tit Sinh sn ú l mt quỏ trỡnh sinh hc ht sc phc ca c th ng vt Hot ng sinh dc l hot ng phong phỳ, sinh ng t m, nhp nhng rt hp dn iu hũa quỏ trỡnh ny l h thng thn kinh th dch ca c th, ú iu hũa bng hormone l trc tip Trong cỏc t chc ca h thn kinh kim soỏt s hot ng ca tuyn sinh dc, vựng di i (hypothalamus) chim v trớ quan trng nht ú trung nhng ng Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 liờn h nhiu phớa t cỏc phn ca k thn kinh v l ni bin cỏc xung thn kinh ú thnh tỏc ng ni tit (Trn Tin Dng, 2002) [2] Hypothalamus tit cỏc cht kớch thớch (yu t gii phúng) GnRF kớch thớch thựy trc tuyn yờn tit FSH, LH FSH - kớch t ny kớch thớch s phỏt trin noón nang ca bung trng, noón nang phỏt trin trng chớn v khin lng oestrogen c tit nhiu hn Oestrogen tỏc ng vo b phn sinh dc th cp ng thi tỏc ng lờn trung tõm Hypothalamus, v i nóo gõy nờn hin tng ng dc LH - hormone ny tỏc ng vo bung trng lm trng chớn m bo tt quỏ trỡnh chớn v rng trng thỡ hm lng hai loi hormone ny phi t mt t l nht nh v t l ú theo a s cỏc nh khoa hc l FSH/LH =3/1 (Lờ Vn Th, 1979) [9] Vựng di i GnRH Yờn trc FSH Nang trng LH Rng trng Th vng Inhibine Progesteron Oestrogen T cung Tuyn vỳ T chc sinh dc ph Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 Hỡnh 2.1 C ch thn kinh th dch iu ho hot ng sinh dc ca gia sỳc cỏi Ghi chỳ: (-) Kim soỏt ngc õm tớnh (+) Kim soỏt ngc dng tớnh S liờn h gia Hypothalamus, tuyn yờn v bung trng iu hũa hot ng sinh dc ca gia sỳc cỏi khụng ch theo chiu thun (hormone c bi tit t tuyn ch huy n tuyn ớch) m cũn theo c ch iu hũa ngc (feedback) t tuyn ớch n tuyn ch huy Trong ú, c ch iu hũa ngc úng vai trũ quan trng ú l c ch ch yu, nhanh v nhy trỡ nng hormone luụn hng nh v thớch ng c vi hot ng ca c th sng mụi trng luụn thay i Khi Hypothalamus tit GnRH, GnRH ó kớch thớch thựy trc tuyn yờn tit hormone kớch noón t - FSH v hormone kớch th vng t LH FSH lm cho nang trng nguyờn thy (primordial follicles) bung trng phỏt trin Nang trng phỏt trin, chớn ó tit Oestrogen Nng Ostrogen mỏu cao s kim soỏt ngc õm tớnh lờn thựy trc tuyn yờn lm gim bi tit FSH Tuy nhiờn, thi gian u thi k rng trng, s tng nng ca oestrogen cú tỏc dng kim soỏt ngc dng tớnh hn l õm tớnh lờn thựy trc tuyn yờn Tỏc dng ny lm Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 tng s gii phúng LH v FSH Nng ca FSH c gii phúng thp hn so vi LH vỡ nang trng sn xut cht inhibin (cht c ch), l mt hormone polypeptid, nú c ch c hiu s gii phúng FSH v khụng tỏc dng lờn LH S tng nng LH tham gia vo quỏ trỡnh rng trng Sau rng trng s lutein húa hỡnh thnh th vng, th vng tng tit progesteron bo v v nuụi dng thai, ng thi gõy tỏc ng ngc õm tớnh lờn Hypothalamus v thựy trc tuyn yờn c ch quỏ trỡnh tit GnRH, FSH, LH Khi cỏi khụng cú cha, Prostaglandin c tit t cỏc t bo niờm mc õm o, t cung lm thoỏi húa th vng v chu k mi li tc (Lờ c Trỡnh,1998) [11] Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 2.1.2 Hiu bit v hormone peptid 2.1.2.1 Bn cht ca hormone peptid Hormone peptid cú t ti trờn 200 axit amin Nú gm nhng hormone ca cỏc tuyn: vựng di i, tuyn yờn, tuyn ty S tng hp hormone pepptid xy li ni cht nguyờn sinh di dng mt chui peptid di hn, ú l mt tin hormone (pro hormone) Hormone peptid l nhng hormone tan nc, nhng hormone ny lu thụng mỏu di dng t do, cú na i sng ngn (thng di 60), thi gian ỏp ng ngn Vớ d: vi giõy cho tỏc dng tng ng huyt ca glucagon hoc chng li niu ca vasopressin Hormone peptid khụng vo t bo ớch m tỏc dng trờn b mt ca th th c hiu mng t bo (Lờ c Trỡnh, 1998) [11] 2.1.2.2 C ch tỏc dng ca hormone peptid C ch phõn t tỏc dng ca cỏc hormone núi cỏch khỏc, ú l quỏ trỡnh truyn thụng tin (hormone) t ngoi t bo vo t bo ớch T bo ớch mang th th c hiu cho mi hormone Khi hormone c gn vi th th thỡ phc hp th th v hormone to thnh, s to mt lot phn ng nhm truyn thụng tin trờn b mt ca t bo ớch vo nhõn t bo (Lờ c Trỡnh, 1998) [11] Tuy nhiờn, c ch tỏc dng ca tng loi hormone l khỏc nhau, ph thuc vo bn cht húa hc ca chỳng C ch tỏc dng ca hormone peptid l c ch hormone mng Nhng hormone peptid c lu tr nhng nang bi tit, lu Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 thụng mỏu di dng t (khụng kt hp vi protein) v cú i sng ngn Nhng hormone ny khụng qua c mng t bo vo t bo Do vy nhng th th ca hormone khu trỳ mt ngoi ca mng t bo cú th kt hp vi hormone Khi hormone c kt hp vi mt th th mng t bo, iu ú cú ngha l cú s dn truyn tớn hiu hormone t ngoi t bo vo t bo S dn truyn tớn hiu c thc hin qua trung gian ca nhng tớn hiu húa hc t bo, thng l nhng nucleotid vũng, ú l nhng thụng tin th hai, hoc thụng tin ni bo Bn thõn nhng hormone ngoi t bo l thụng tin th nht Thụng tin th hai, vớ d AMP vũng (AMPc) t bo tip tc hot húa mt hoc nhiu enzym kinase t bo, nhng kinase ny li phosphoryl húa nhng protein c hiu ca t bo Nhng protein phosphoryl húa lm thay i quỏ trỡnh chuyn húa t bo (Lờ c Trỡnh, 2003) [12] Quan nim v cht thụng tin th hai: => Cỏc hormone, cht dn truyn thn kinh, hoc nhng hormone ti ch c coi l nhng thụng tin th nht hay thụng tin ngoi t bo, khụng vo t bo m kt hp vi cht th th mng t bo (tr hormone steroid v hormone tuyn giỏp, nhng hormone ny kt hp vi th th ni bo) => S kt hp gia nhng thụng tin th nht vi cht th th to nhng tớn hiu húa hc khỏc t bo Nhng tớn hiu ny c gi l thụng tin th hai hay thụng tin ni bo Nú hot ng t bo Thụng tin th hai hot húa mt s h thng enzym chc phn ca t 10 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 (Mi ging c kim tra ELISA vi lp li l ln) STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Ging a Giỏ tr OD OD tbỡnh A3 0,625 0,651 A3 A9 0,803 0,845 A9 B2 1,751 1,756 B2 B5 2,398 2,469 B5 B7 0,543 0,575 B7 E2 1,607 1,650 E2 E7 2,508 2,517 E7 E8 0,892 0,906 E8 F4 1,246 1,251 F4 F9 1,521 1,532 10 F9 G2 0,743 0,743 11 G2 C1 1,152 1,251 12 C1 C6 0,789 0,694 13 C6 E1 1,843 1,792 14 E1 E6 1,597 1,605 15 E6 E9 1,307 1,278 16 E9 F1 2,389 2,387 17 F1 F2 1,365 1,438 18 F2 G9 1,092 1,126 19 G9 G12 0,536 0,654 20 G12 H1 1,059 1,078 21 H1 H9 0,645 0,589 22 H9 A1 1,973 1,852 23 A1 A4 0,807 0,791 24 A4 A10 2,735 2,689 25 A10 B3 0,845 0,821 26 B3 C5 1,843 1,804 27 C5 D2 2,591 2,557 28 D2 E3 0,869 0,876 29 E3 E10 1,032 1,089 30 E10 F6 0,831 0,898 31 F6 F10 0,794 0,754 32 F10 C (+) 2,441 2,4512 C (+) C (-) 0,482 0,437 C (-) Ghi chỳ: C (+) l huyt ca chut 3.1; C (-) l BSA Kt qu bng 4.4 cho thy: 32 ging cú kt qu dng tớnh u cho giỏ tr OD ln hn giỏ tr OD 58 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 ca ging i chng õm Trong 32 ging dng tớnh ú, cỏc ging khỏc cú giỏ tr OD khỏc iu ny chng t mi dũng t bo khỏc thỡ kh nng sinh khỏng th cng khỏc Vỡ vy cú th thy cỏc ging cú t bo lai sinh khỏng th cú cht lng cao ph thuc nhiu vo dũng t bo lympho B cú ỏp ng dch tt vi khỏng nguyờn hay khụng v dũng t bo Myeloma (qua thc nghim ó chng minh dũng t bo Sp2/0 tt hn dũng P3X) Nh vy, dũng t bo lympho B cú ỏp ng dch tt lai vi dũng t bo Sp2/0 s cho cỏc dũng t bo lai sinh khỏng th cú cht lng cao Bc tip theo chỳng tụi tin hnh la chn v nhõn lờn cỏc dũng t bo lai sinh khỏng th cht lng cao t ú thu lng ln khỏng th mong mun T kt qu bng 4.4 chỳng tụi chn dũng t bo sinh khỏng th n dũng khỏng c hiu FSH tt nht tng ng vi ging cú giỏ tr OD cao nht l: Ging B5 a cú giỏ tr OD = 2,431 c t tờn l dũng FSH Ging E7 a cú giỏ tr OD = 2,507 c t tờn l dũng FSH Ging F1 a cú giỏ tr OD = 2,416 c t tờn l dũng FSH Ging A10 a cú giỏ tr OD = 2,725 c t tờn l dũng FSH Ging D2 a cú giỏ tr OD = 2,549 c t tờn l dũng FSH Vi 05 dũng t bo lai ó chn lc FSH 1,2,3,4,5, chỳng tụi tin hnh nhõn nuụi in vitro cú s lng ln t bo quỏ trỡnh nhõn nuụi t kt qu tt, t 05 dũng t bo c chn chỳng tụi a vo chai nuụi cy cho t nng 1x105 t bo/ml Cỏc chai nuụi cy c b sung mụi trng thớch hp cho cỏc t bo lai phỏt trin tt v nuụi t m 370C, 5%CO2 Mụi trng nuụi cy chỳng tụi s dng gm cỏc thnh phn: DMEM b sung FBS 10% 4.4 CHN LC DềNG T BO LAI SINH KHNG TH Cể TNH C HIU CAO khng nh tớnh c hiu ca khỏng th n dũng khỏng FSH cu 59 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 dũng t bo thu c trờn, chỳng tụi tin hnh kim tra bng phng phỏp ELISA Kim tra tớnh c hiu ca khỏng th n dũng sinh l kim tra kh nng kt hp ca khỏng th n dũng vi khỏng nguyờn v cỏc hormone khỏc cú huyt nh: LH, Testosteron, Corticosteron Chỳng tụi dựng khỏng th n dũng mi thu c ln lt th nghim vi i din cỏc nhúm khỏng nguyờn núi trờn v thu c kt qu th hin bng 4.5 Bng 4.5 Kim tra c hiu ca dch ni ca cỏc dũng t bo Khỏng nguyờn Dũng t bo FSH_1 FSH_2 FSH_3 FSH_4 FSH_5 BSA 1% (C õm) LH FSH Testosterone Corticosterone + + + - + + + + + - + + - + + - Kt qu ca bng 4.5 cho thy: Dũng FSH u cho kt qu dng tớnh vi c loi khỏng nguyờn Dũng FSH cho dng tớnh vi FSH nhng cng dng tớnh vi c LH, Corticosterone Dũng FSH v FSH cho kt qu dng tớnh vi c LH v Testosterone Dũng FSH ch cho kt qu dng tớnh vi FSH, õm tớnh vi cỏc khỏng nguyờn cũn li Nh vy, khỏng th dũng t bo 1,2,3,4 sinh cú tớnh c hiu vi khỏng nguyờn gõy dch khụng cao, khụng phõn bit c gia FSH vi cỏc khỏng nguyờn kim tra Ch cú dũng FSH cho kt qu õm tớnh vi LH, Testosterone, Corticosterone v ch dng tớnh vi FSH iu ny chng t rng khỏng th 60 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 n dũng dũng t bo ny sinh cú tớnh c hiu cao, chỳng ó phõn bit c FSH vi cỏc hormone kim tra Chỳng ta thy rng khỏng th n dũng l khỏng th ch cú kh nng kt hp c hiu vi mt loi khỏng nguyờn nht m khụng kt hp vi cỏc loi khỏng nguyờn khỏc cho dự chỳng cú cu to húa hc gn ging vi khỏng nguyờn ú Hn na, mt dũng t bo cú cht lng cao ngoi kh nng sinh khỏng th cú tớnh c hiu cao cũn cn phi cú sc sng tt, kh nng sinh khỏng th nhiu t ú mi m bo to c mt lng ln khỏng th trờn quy mụ cụng nghip phc v nhu cu sn xut thc t Da trờn kt qu kim tra tớnh c hiu v kh nng phỏt trin ca dũng t bo, chỳng tụi ch chn dũng FSH cú tớnh c hiu cao, tip tc nhõn nuụi thu dch ni, lu gi t bo Nit lng v gõy bỏng cho chut nhm thu c lng ln khỏng th sau ny 61 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 PHN TH NM KT LUN V NGH 5.1 KT LUN Sau quỏ trỡnh lm thớ nghiờm, chỳng tụi rỳt mt s kt lun sau: Liu lng khỏng nguyờn FSH cho ỏp ng dch tt nht l 0,2àg/con/ln tiờm ỏp ng dch ca c th ph thuc vo liu lng khỏng nguyờn gõy dch v chớnh cỏ th ng vt Hiu qu lai gia t bo Myeloma v t bo lympho B thu t lỏch ca hai chut 3.1 v 3.2 t 73,26% (211/288 ging) vi s ging sinh khỏng th mong mun l 68,72% (145/211 ging) Vi hiu qu tỏch dũng t 55,90% thỡ cú 32/161 ging cú phn ng dng tớnh vi khỏng nguyờn FSH Chỳng tụi chn 05 dũng t bo cú kh nng sinh khỏng th n dũng khỏng FSH cao nht nhng ch cú dũng FSH l dũng sinh khỏng th cú c hiu cao nht nờn c chỳng tụi la chn nhõn nuụi lng ln nhm gõy bỏng trờn chut v bo qun lõu di nit lng 5.2 NGH Quy trỡnh sn xut khỏng th n dũng gm nhiu giai on khỏc nhau, ú to v chn c dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng mong mun l bc u tiờn Sau ó chn c dũng t bo sinh khỏng th n dũng cú cht lng cao, vic thu lng ln khỏng th n dũng bng cỏch gõy bỏng cho chut l cụng vic rt quan trng v cn thit phc v cho vic sn xut cỏc b kit nh lng FSH sau ny ng thi, khỏng th thu c cn tinh sch v c cng hp vi enzyme HRP thỡ mi cú th s dng cho vic to kit Vỡ vy, kt qu nghiờn cu t ti ca chỳng tụi mi ch l bc u Chỳng tụi hy vng ti s c tip tc nghiờn cu thi gian ti sm to c sn phm cui cựng l b kớt chun nh lng FSH dch sinh hc (mỏu, nc tiu) phc v cho ngnh chn nuụi nc nh 62 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 TI LIU THAM KHO TI LIU TING VIT V Triu An, Jean Claude Homberg (1997), Min dch hc, NXB Y hc Tr 277 Trn Tin Dng, Dng ỡnh Long, Nguyn Vn Thanh (2002), Sinh sn gia sỳc, NXB Nụng nghip, H Ni Tr 10, 20, 65, 226 227 o Th Thỳy Hng (2009), Xỏc nh hm lng mt s hormone sinh sn bng phng phỏp dch enzym (ELISA = ENZYM LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY) chn oỏn, iu tr hin tng ri lon quỏ trỡnh th tinh bũ sa nguyờn nhõn bnh lý buụng trng, Lun thc s Nụng nghip, i hc Nụng nghip H Ni, H Ni Lờ Vn Hựng (2002), Min dch hc thỳ y, NXB Nụng nghip, Thnh ph H Chớ Minh Nguyn Quyờn (2004), Mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh sn xut khỏng th n dũng, Lun ỏn tin s khoa hc Y dc Nguyn Quang Thch, Nguyn Th Lý Anh, Nguyn Th Phng Tho (2004), Giỏo trỡnh Cụng ngh Sinh hc Nụng nghip, Tr 112 116 Nguyn Nh Thanh (1997), Min dch hc thỳ y, NXB Nụng nghip, H Ni Th Tho, Th Phng, Khc Hiu, H Th Thu, inh Thng Võn, inh Duy Khỏng, Lờ Trn Bỡnh (2008), To dũng t bo lai sn xut khỏng th n dũng khỏng protein v VP28 ca virus gõy bnh m trng trờn tụm sỳ, Tp Cụng ngh Sinh hc 6(2): 203 208 Lờ Vn Th, Lờ Xuõn Cng (1979), Kớch dc t ng dng chn nuụi, NXB Nụng nghip, H Ni 63 Báo cáo tốt nghiệp 10 Nguyễn Thị An TYA K50 Nguyn Xuõn Tnh, Tit Hng Ngõn, Nguyn Bỏ Mựi, Lờ Mng Loan (1996), Sinh lý hc gia sỳc, NXB Nụng nghip, H Ni 11 Lờ c Trỡnh, Nguyn Th H, Nguyn Hu Chn, Nguyn Nghiờm Lut, Hong Th Bớch Ngc, Nguyn Hng Qu, Nguyn Th Kim Xuyn (1991), Húa sinh, NXB Y hc, H Ni, Tr 223 251 12 Lờ c Trỡnh (1998), Hormone, NXB Y hc, H Ni, Tr 45 61 13 Lờ c Trỡnh (2003), Hormone v ni tit hc, NXB Y hc, H Ni, Tr 84, 88 89, 207 14 Kim Tuyờn (1995), Nghiờn cu gõy siờu bi noón bũ bng s dng FSH v Prostaglandin F2, Lun ỏn phú tin s khoa hc Nụng nghip TI LIU TING ANH 15 Christopher Dean, Philip Shepkerd (2000), Monoclonal Antibodies, Cell biology (10 12, 26 28, 118) 16 Gefter.M.L et al (1977), Simple method for PEG promoted hybridization of mouse myeloma cell Somat cell Genet (231 236) 17 J Eryl Liddell and A Cryer (2002), A practical guide to Monoclonal Antibody, pp 25 - 27 18 19 John Wiley and Sons (2000), Immunology (11.4.2 11.8.2) Oliver JP.Leger v Jose.Wsaldanha (2000), Monoclonal Antibodies, Cell Feeder (10 30, 150) 20 Philip Shepker, Chiristopher Dean (2000), Monoclonal Antibodies Cell Obiology, pp 10 12, 26 28, 118 21 http://www.accesseexcellence.org 22 http://www.vi.wikipedia.org/wiki/khangthe 64 trờng đạI học nông nghiệp hà nội khoa thú y Báo cáo tốt nghiệp Tờn ti: To dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng khỏng FSH Ngi thc hin : Lp : Ngi hng dn : B mụn: Ngi hng dn : Nguyn Th An Thỳ y A - Khoỏ 50 PGS.TS Trn Tin Dng Ngoi Sn TS Th Tho Phũng Cụng ngh t bo ng vt hà nội - 2010 Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 LI CAM OAN Tụi xin cam oan rng, s liu v kt qu nghiờn cu khúa lun ny l trung thc v cha h c s dng cỏc cụng b khoa hc no trc õy Tụi xin cam oan rng, mi s giỳp cho vic thc hin khúa lun ny ó c cm n v cỏc thụng tin c trớch dn khúa lun ny ó c ghi rừ ngun gc H Ni, ngy 15 thỏng 05 nm 2010 Sinh viờn Nguyn Th An i Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 LI CM N Li u tiờn tụi xin by t lũng bit n sõu sc ti PGS.TS Trn Tin Dng Ging viờn Khoa Thỳ Y - Trng i hc Nụng nghip H Ni v TS Th Tho trng phũng Cụng ngh t bo ng vt Vin Cụng ngh Sinh hc Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam Nhng ngi thy ó tn tõm hng dn tụi sut quỏ trỡnh thc hin nghiờn cu v hon thnh khúa lun ny ng thi tụi cng xin c by t lũng bit n ti s giỳp nhit tỡnh, quý bỏu ca cỏc ch ti phũng Cụng ngh t bo ng vt Vin CNSH ó ginh nhiu thi gian v cụng sc giỳp tụi hon thnh phn ln ni dung ca khúa lun Tụi cng xin chõn thnh gi li cm n ti ton th cỏc thy cụ giỏo trng i hc Nụng Nghip H Ni ó truyn t cho tụi nhng kin thc quý bỏu v b ớch sut nm hc va qua Cui cựng tụi xin gi li cm n ti gia ỡnh, bn bố ó ng viờn, khớch l v giỳp tụi hon thnh khúa lun ny H Ni, ngy 15 thỏng 05 nm 2010 Sinh viờn Nguyn Th An ii Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 MC LC PHN TH NHT M U 1.1 T VN 1.2 MC CH CA TI PHN HAI TNG QUAN TI LIU 2.1 GII THIU V HORMONE NểI CHUNG V HORMONE SINH SN FOLLICLE STIMULATING HORMONE (FSH) 2.1.1 S iu hũa hot ng sinh dc ca tuyn ni tit 2.1.2 Hiu bit v hormone peptid 2.1.3 S lc v Follicules Stimulating Hormone FSH 11 2.1.4 Tỡnh hỡnh nghiờn cu v nh lng hormone FSH v ngoi nc .14 2.2 MIN DCH HC V KHNG TH N DềNG 15 2.2.1 Cỏc khỏi nim v dch hc 15 2.2.2 H thng cỏc c quan v t bo tham gia vo ỏp ng dch .18 2.2.3 Gii thiu v khỏng nguyờn (Antigen) 22 2.2.4 Khỏng th v phn ng khỏng nguyờn khỏng th .25 2.2.5 Khỏng th n dũng 32 PHN TH BA I TNG, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 38 3.1 I TNG NGHIấN CU 38 3.1.1 ng vt thớ nghim 38 3.1.2 Dũng t bo ung th ty (Myeloma) 38 3.1.3 Thit b thớ nghim 38 3.1.4 Húa cht thớ nghim 38 3.1.5 Thi gian v a im nghiờn cu 39 3.2 NI DUNG NGHIấN CU .39 3.3 PHNG PHP NGHIấN CU .39 iii Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 3.3.1 Gõy dch cho chut .42 3.3.2 Phng phỏp ly i thc bo .42 3.3.3 Phng phỏp m t bo 43 3.3.4 Phng phỏp ly t bo Lympho B ca chut 43 3.3.5 Nuụi cy t bo Myeloma dũng Sp2/0 v P3X 44 3.3.6 Dung hp t bo v tỏch dũng .45 3.3.7 Phng phỏp ELISA 46 PHN TH T KT QU V THO LUN .47 4.1 NH GI KT QU GY P NG MIN DCH TRấN CHUT BNG KHNG NGUYấN FSH 47 4.2 KT QU DUNG HP TO T BO LAI SINH KHNG TH KHNG FSH 50 4.3 KT QU TO DềNG T BO LAI SINH KHNG TH N DềNG KHNG FSH .55 4.4 CHN LC DềNG T BO LAI SINH KHNG TH Cể TNH C HIU CAO 59 PHN TH NM KT LUN V NGH 62 5.1 KT LUN 62 5.2 NGH 62 TI LIU THAM KHO 63 iv Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 DANH MC VIT TT ATCC American Type Culture Colletion BSA Bovine Serum Albumin DMEM Dulbeccos Modified Eagles Medium MD ỏp ng dch ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCA Freund Complex Adjuvant FIA Freund Incomplex Adjuvant FSH Follicle Stimulating Hormone GnRH Gonadotropin Releasing Hormone HAT Hypoxanthine Aminopterin Thimidine HT Hypoxanthin Thimidine LH Luteinizing Hormone OD Optical density PEG Polyethylen Glycol v Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 DANH MC BNG Bng 4.1 Kt qu gõy ỏp ng dch cho chut .48 Bng 4.2 Kt qu dung hp to t bo lai sinh khỏng th n dũng khỏng FSH trờn dũng t bo myeloma 54 Bng 4.3 Tng hp kt qu tỏch dũng chn dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng khỏng FSH 57 Bng 4.4 Giỏ tr OD ca dch ni cỏc ging cú dũng t bo dng tớnh vi khỏng nguyờn FSH (32/161/288) 57 Bng 4.5 Kim tra c hiu ca dch ni ca cỏc dũng t bo 60 vi Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị An TYA K50 DANH MC HèNH Hỡnh 2.1 C ch thn kinh th dch iu ho hot ng sinh dc ca gia sỳc cỏi .7 Hỡnh 2.2 Khỏi nim v thụng tin th hai 11 Hỡnh 2.3 S cu trỳc ca hormone Glycoprotein FSH 12 Hỡnh 2.4 Cu trỳc ca mt phõn t khỏng th 27 Hỡnh 2.5 S cỏc chui ca mt khỏng th 28 Hỡnh 2.6 Cỏc c t ca vi khun bờn cnh mt t bo c th 29 Hỡnh 2.7 Cỏc c t trờn b trung hũa bi khỏng th 30 Hỡnh 2.8 Khỏng th a dũng, mi khỏng th liờn kt vi mt epitop khỏc .34 Hỡnh 2.9 Khỏng th n dũng liờn kt vi mt epitop c hiu .35 Hỡnh 4.1 T bo feeder, phúng i 10ì20 51 Hỡnh 4.2 T bo Sp2/0, phúng i 10ì20 .52 Hỡnh 4.3 T bo Lympho B v t bo Sp2/0 dung hp v phỏt trin trờn nn t bo feeder, phúng i 10ì20 .53 Hỡnh 4.4 Cỏc cm t bo lai (clone t bo) ang phỏt trin, phúng i 10ì20 56 - vii [...]... cơ thể sinh ra kháng thể 2.2.3.2 Những đặc tính của kháng nguyên • Tính sinh kháng thể (tính sinh miễn dịch) Tính sinh kháng thể là khả năng của một kháng nguyên tạo ra một đáp ứng miễn dịch Đáp ứng này có thể là tế bào hay dịch thể, có thể là dương tính (cơ thể mẫn cảm sinh kháng thể) hoặc âm tính (cơ thể dung nạp và không sinh kháng thể) (Vũ Triệu An, 1997) [1] • Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của kháng. .. (1958) về thuyết chọn lọc đơn dòng (một tế bào –một kháng thể) , của Okada dùng virus Sendai để lai các tế bào (1958) và Barski (1960) vì sự liên hợp ngẫu nhiên của các tế bào Năm 1975, Kohler và Milstein cho là có thể thu được kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao từ các dòng tế bào thường trực bằng cách lai tế bào u tủy với tế bào sản xuất kháng thể Các ông đã dùng tế bào lách của chuột đã được... đại thực bào đưa thông tin kháng nguyên đến, các lympho T tiếp nhận rồi biệt hóa trở thành nguyên bào Lympho T rồi tiếp tục trở thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chứa kháng thể đặc hiệu trên màng tế bào, gọi đó là kháng thể tế bào Quá trình ĐƯMD tế bào do quần thể lympho T phụ trách, thể hiện khả năng tự bảo vệ của cơ thể 21 B¸o c¸o tèt nghiÖp NguyÔn ThÞ An – TYA – K50 Kháng thể tế bào thường... NguyÔn ThÞ An – TYA – K50 định kháng nguyên” sau khi nhận diện đều có thể kích thích tế bào lympho tăng sinh và biệt hóa thành dòng tế bào lympho có khả năng sinh ra kháng thể chống lại quyết định kháng nguyên tương ứng (hay kháng thể đơn đặc hiệu tương ứng) Như vậy, kháng thể đơn là loại kháng thể do một “clon” tế bào lympho sản xuất và tiết ra để chống lại một loại quyết định kháng nguyên nhất định (Lê... và lai với tế bào u tủy của chuột dòng P3- X63- Ag8 và dùng virus Sendai là chất tạo liên hợp Tế bào lai thu được có khả năng sản xuất kháng thể chống hồng cầu cừu và có thể nuôi cấy dài ngày in vitro Trong hơn 30 năm qua, kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng đã ảnh hưởng nhiều tới các lĩnh vực nghiên cứu khác của miễn dịch học, vi sinh vật học, ký sinh trùng, sinh hóa, sinh lý, và sinh học tế bào. .. chia thành tế bào sản xuất kháng thể, lúc đó mới có kháng thể xuất hiện, sớm nhất là IgM, tiếp sau đó là IgG Nếu đưa kháng nguyên thêm một lần nữa vào cơ thể có tính chất nhắc nhở, thì thời gian xuất hiện kháng thể sẽ sớm hơn và kháng thể sinh ra cũng nhiều hơn, bởi vì khi bị kháng nguyên lần đầu kích thích một số tế bào có thẩm quyền miễn dịch đã biệt hóa trở thành tế bào tiếp nhận thông tin kháng nguyên,... nhất định (Lê Văn Hùng, 2002) [4] ` Hình 2.9 Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitop đặc hiệu (Nguồn: http//vi.wikipedia.org.wiki/AntibodyChains.svg) 2.2.5.3 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng Hiện nay, ứng dụng của kháng thể đơn dòng (KTĐD) rất đa dạng So với kháng thể đa dòng thì KTĐD có tính đặc hiệu (quyết định sự chọn lọc) và ái lực kháng nguyên – kháng thể (quyết định độ nhậy) rất cao Vì thế, khả... (Fab), kháng thể có thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở vùng hằng định (Fc) Những tương tác này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch Như vậy, các kháng thể gắn với một vi khuẩn có thể liên kết với một đại thực bào và khởi động hiện tượng thực bào Các tế bào Lympho NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi các kháng thể 2.2.4.4... cơ thể, đáp ứng miễn dịch của cơ thể sẽ sản xuất ra nhiều loại kháng thể khác nhau, được gọi là kháng thể đa dòng hay một họ kháng thể Hình 2.8 Kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitop khác nhau (Nguồn:http//vi.wikipedia.org.wiki/AntibodyChains.svg) Theo học thuyết “clon” thì mỗi một tế bào lympho trong cơ thể có khả năng nhận diện một loại “quyết định kháng nguyên” và mỗi một loại “quyết... hình thành tế bào lympho B ĐƯMD dịch thể do lympho B đảm nhận, khi bị kích thích bởi kháng nguyên các tế bào này sẽ phát triển thành các dòng Lympho B khác nhau, các dòng này sản sinh ra kháng thể tuần hoàn trong máu, khi kháng thể gặp kháng nguyên nó sẽ kết hợp với cấu trúc đặc thù trên bề mặt kháng nguyên, làm kháng nguyên mất hoạt tính bằng cách kết tủa hoặc hình thành một đám ngưng kết tạo cơ hội ... chỳng tụi tin hnh ti: To dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng khỏng FSH 1.2 MC CH CA TI To c dũng t bo lai sinh khỏng th n dũng (mAb) khỏng c hiu hormone sinh sn FSH Báo cáo tốt nghiệp Nguyễn Thị... trỡnh sinh lý quan trng nh sinh trng, phỏt dc, sinh sn ( Lờ c Trỡnh, 1991) [11] 2.1.1 S iu hũa hot ng sinh dc ca tuyn ni tit Sinh sn ú l mt quỏ trỡnh sinh hc ht sc phc ca c th ng vt Hot ng sinh. .. cỏi 2.1.3.4 ng dng ca FSH FSH l hormone quan trng quỏ trỡnh sinh sn ca ng vt, vỡ th FSH cú nhiu ng dng thc t nh: - Xỏc nh hm lng FSH, LH chn oỏn nguyờn nhõn gõy ri lon sinh sn bũ sa t ú cú