TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHOA KHOA HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE VÀ ỨNG DỤNG CHÚNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP PHẠM KHÁNH NGUYÊN HUÂN VIỆN NC & PT CNSH LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K31 MSSV: 3052826 Cần Thơ, Năm 2009 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ Phosphor (P) thành phần cấu trúc acid Nucleic (DNA, RNA), màng phosphorlipid, hợp chất cao (như ATP, NADPH), xương , phosphor nguyên tố có vai trò quan trọng sinh vật Nếu thiếu phosphor, động vật chán ăn dẫn đến gầy còm, còi xương, giảm sinh sản Trong tự nhiên, phosphor tồn chủ yếu hai dạng phosphor vô khó tan nằm quặng thiên nhiên apatit, phosphate sắt, phosphate nhôm, dạng phosphor hữu phức tạp có xác động vật, thực vật chủ yếu acid nucleic, acid phytic, phytate, Cả hai dạng phosphor sinh vật hấp thu mà phải chuyển hóa dạng phosphate tan (PO43-) thể hấp thu Muốn chuyển hóa hợp chất phosphor hữu phải nhờ hệ enzyme phytase có động thực vật vi sinh vật Enzyme phytase có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic – dạng dự trữ phosphor nhiều loại ngũ cốc đậu đậu tương 60%, ngô 72% lúa mì 77% (Phạm Thị Trân Châu, 2007) – tăng khả tiêu hóa phosphor thực vật thức ăn giải phóng số acid amin, tinh bột, calcium nguyên tố vi lượng khác Phytase enzyme tự nhiên sử dụng để làm tăng chất lượng thành phần thức ăn giàu acid phytic, giảm thấp tiết lân vào phân thải từ hạn chế ô nhiễm môi trường Đồng thời, việc bổ sung phytase giúp giảm lượng phosphate vô dễ tiêu bổ sung vào thức ăn gia súc từ giảm chi phí thức ăn cho nhà chăn nuôi Mục tiêu đề tài: phân lập nhận diện số dòng nấm mốc tổng hợp enzyme phytase ứng dụng trực tiếp dòng nấm việc cải thiện phân hữu bột đậu nành Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Acid phytic – phytate Acid phytic (Myo-inositol hexakisphosphat) loại muối phosphor hữu có vai trò quan trọng động vật thực vật, người vi khuẩn Phytate muối acid phytic Acid phytic có nhiều loại hạt ngũ cốc hạt phấn, giải phóng suốt trình nảy mầm hạt Acid phytic thành phần dự trữ phosphor, nguồn inositol nhiều chất khoáng Acid phytic chiếm 75-80% lượng phosphor tổng loại hạt 1-5% trọng lượng loại hạt dùng làm thực phẩm hạt đậu, hạt ngũ cốc, hạt có dầu (Oh et al., 2004; Vohra et al., 2003) Bảng 1: Hàm lượng Phytase Phosphorus phosphor tổng thức ăn thực vật (%) Tên thức ăn Bắp Đại mạch Tiểu ngạch Lúa thóc Khoai mì Cao lương Cám tiểu mạch Lúa mì Cám gạo nhuyễn Bã cám gạo Bã đậu Bã gòn Bã hạt cải Hàm lượng Hàm lượng Phytase Phytase Phosphor tổng (%) Phosphorus (%) Phosphorus tổng (%) 0,26 0,17 65,4 0,31 0,15 48,4 0,31 0,19 58,1 0,09 0,09 10,0 0,28 0,14 56,0 0,26 0,19 73,0 0,92 0,68 73,9 0,48 0,34 70,1 1,77 1,33 75,1 1,82 1,58 86,8 1,40 0,57 40,4 0,97 0,63 64,9 1,01 0,63 62,4 (Viện chăn nuôi Việt Nam 2009) Trong tự nhiên, acid phytic tồn chủ yếu dạng muối phytate dạng phức hợp với cation quan trọng cho dinh dưỡng Ca2+, Zn2+ Fe2+ Vì vậy, nói acid phytic thường dùng thuật ngữ phytate Phytate chứa 14-25% Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ phosphor, 12-2% Canxi, 1-2% kẽm sắt Hổn hợp muối Ca-Mg acid phytic gọi phytin 2.2 Phytase gì? Phytase enzyme giải phóng phytate đính phosphor để sử dụng đường tiêu hoá vật nuôi dày đơn Bổ sung phytase vào thức ăn vật nuôi làm giảm nhu cầu cung cấp lân vô dicalcium phosphate giảm thấp tiết lân vào phân thải, từ hạn chế ô nhiễm lân vào đất nước ngầm Phytase (Myo- Inositol hexakisphosphat phosphorhydrolase) enzyme đặc biệt lớp enzyme phosphatase xúc tác thủy phân nối phosphormonoester acid phytic (Myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen phosphate hay Myo-inositol hexakisphosphate) giải phóng orthophosphate vô dẫn xuất Myo-inositol chứa nhóm phosphate hơn, thành Myo-inositol tự (Oh et al., 2004; Vohra et al., 2003) (Hình 1) Hình Cơ chế thủy phân phosphate hữu phytase Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Nhóm photphate giải phóng gắn với thuốc thử molypdate hình thành phosphormolybdenum màu xanh lam phát phép so màu theo phương pháp Oniani (Vohra et al., 2003) Phytase phân hủy acid phytic phytate để giải phóng acid phosphoride, inositol, nguyên tố khoáng, protein, acid amin, tinh bột liposome Phytase không loại enzyme có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic, tăng khả tiêu hóa phosphor thực vật thức ăn, giải phóng số acid amin, tinh bột, calcium nguyên tố vi lượng khác mà phytase giúp giảm lượng phosphor vô sử dụng giảm chi phí thức ăn 2.3 Nấm mốc sản xuất phytase 2.3.1 Sơ lược đặc điểm hình thái số loại nấm mốc có khả tổng hợp phytase (Cao Ngọc Điệp, 2006) 2.3.1.1 Aspergillus Chi Aspergillus thuộc ngành phụ Nấm Nang (Ascomycotina) Chi có khoảng 200 loài phát tán khắp nơi tự nhiên Khuẩn ty Aspergillus có vách ngăn hoàn chỉnh phân nhánh Nhiều khuẩn ty phát triển bề mặt chất để hấp thu chất dinh dưỡng Khuẩn ty đứt thành khúc khúc hay đoạn phát triển cho khuẩn ty Khuẩn ty hình thành cọng mang túi bào tử (conidiophore) bào tử đính (conidia) với cọng mang túi bào tử không vách ngăn không xuất phát từ tế bào chân (foot cell) Túi hay bọng (vesicle) tế bào đa nhân phát triển bề mặt gắn liền với thể bình (phialide hay sterigmata) (hình 2) Thể bình với bậc hay bậc 2, thể bình cấu trúc đa nhân đầu thể bình tạo thành chuổi bào tử đính, bào tử non xa già; bào tử trưởng thành phóng thích vào không khí nẩy mầm (hình 3) Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ (Cao Ngọc Điệp, 2006) Hình 2: Khuẩn ty, cọng bào tử, túi thể bình Aspergillus (Cao Ngọc Điệp, 2006) Hình 3: Cọng bào tử, túi bào tử đính Aspergillus Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ 2.3.1.2 Penicillium Penicillium thuộc ngành phụ Nấm Nang (ascomycotina) với khoảng 100 loài Khuẩn ty Penicillium phân nhánh, nhiều khuẩn ty có vách ngăn ngang khuẩn ty có khả hấp thu chất dinh dưỡng để tạo cọng bào tử đính bào tử; đoạn khuẩn ty phát triển thành sợi khuẩn ty Penicillium sinh sản vô tính với cọng bào tử đính bào tử, cọng bào tử không phân nhánh, phân nhánh bậc 1, hay tận cọng bào tử thể bình, cọng bào tử không phân nhánh tận thể bình chuỗi đính bào tử giống cọ vẽ hoạ sĩ nên gọi thể bình vẽ (metulae), cán (ramus) cọ vẽ (penicillus) (hình 4) Đính bào tử có dạng tròn có vách láng hay xần xùi, có đơn nhân có chúng có đa nhân Penicillium có đính bào tử mang màu xanh đặc trưng phát tán dể dàng gió (Cao Ngọc Điệp, 2006) Hình 4: Cọng bào tử, đính bào tử cán, thể bình vẽ, thể bình Penicillium Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Bảng 2: Sự khác biệt hai chi Aspergillus Penicillium Chi Aspergillus Chi Penicillium - Cọng bào tử không phân chia - Cọng bào tử phân chia có vách ngăn vách ngăn ngang ngang - Cọng bào tử phát triển từ tế bào - Cọng bào tử phát triển từ vài tế gọi tế bào chân bào khuẩn ty, tế bào chân - Mỗi cọng bào tử mở rộng túi - Túi không hình thành đầu cọng bào tận đầu tử phát triển thành cọ vẽ - Cán không diện bên thể - Cán diện bên thể bình bình - Đính bào tử trưởng thành có màu - Đính bào tử có màu xanh lục vàng, nâu, đen - Vách tử nang cầu dày - Vách tử nang cầu mỏng 2.3.1.3 Rhizopus (Cao Ngọc Điệp, 2006) Hình 5: Các loại khuẩn ty Rhizopus - Khuẩn (rhizoids), khuẩn ngang (stolon) cọng bào tử (sporangiophores) Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Rhizopus thuộc ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina) với khoảng 120 loài Khuẩn ty thường có màu trắng, phân nhánh, đa nhân vách ngăn ngang Khi non khuẩn ty có dạng sợi vải, phát triển sâu vào chất phân chia thành ba dạng khuẩn ty khuẩn căn, khuẩn ngang cọng bào tử (hình 5) Khuẩn khuẩn ty ăn vào chất để hấp thu chất dinh dưỡng Khuẩn ngang khuẩn ty phát triển theo chiều ngang, mặt chất nối nhóm nấm với Cọng mang túi bào tử khuẩn ty mọc thẳng lên không, chúng phát triển từ trung tâm điểm xuất phát khuẩn khuẩn ngang Từ điểm mọc lên nhiều cọng bào tử Đặc tính Aspergillus hình thành cọng mang bọc bào tử (sporangiophores) túi (bọc) bào tử (sporangium) Bào tử roi, gần tròn, đồng nhất, đa nhân nằm túi màu đen gọi túi bào tử Một túi bào tử phát triển đơn độc tận cọng mang bọc bào tử bọc bào tử có màu đen nên gọi mốc đen 2.3.1.4 Mucor Mucor thuộc ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina) Nấm Mucor sinh sản vô tính nấm Rhizopus cách thành lập cọng mang bọc bào tử bào tử vách dày (chlamydospore) Cọng mang bọc bào tử với bào tử bất động hình thành bao hay bọc bào tử (sporangia); bọc bào tử phát triển tận ngọn, không phân nhánh cọng mang bọc bào tử phát triển riêng biệt, không nhóm (hình 6) Một số loài cá biệt mang bọc bào tử phân nhánh Mucor racemosus Mucor plumbeus Trong tế bào chất chứa nhiều nhân bào tử có nhân, túi bào tử đổi sang màu nâu bào tử trưởng thành dễ dàng vỡ để phóng thích bào tử theo gió bám vào chân côn trùng để phát tán Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ (Cao Ngọc Điệp, 2006) Hình 6: Cọng mang bọc bào tử với bọc bào tử Mucor Bảng 3: Sự khác biệt hai chi Rhizopus Mucor Chi Rhizopus Chi Mucor - Có khuẩn - Không có khuẩn - Có khuẩn ngang - Không có khuẩn ngang - Thức ăn hấp thu từ khuẩn - Thức ăn hấp thu từ bề mặt khuẩn ty - Cọng bào tử phát triển riêng - Cọng bào tử phát triển riêng biệt biệt với khuẩn không tập hợp thành nhóm - Bào tử dính cuống bào tử - Bào tử dễ phát tán theo gió khó phân tán Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ 4.2 Định danh dòng nấm mốc Ủ dòng nấm mốc với môi trường đặc tới giai đoạn sinh bào tử đưa mẫu lên kính hiển vi quan sát định danh Kết tám dòng nấm mốc có hai dòng Penicillium, ba dòng Rhizopus, ba dòng lại Aspergillus (bảng 10) Dòng Bảng 10: Các dòng nấm mốc * Quy ước phân biệt dòng nấm mốc giống theo số thứ tự Loại Quy ước Penicillium sp Penicillium sp Rhizopus sp Aspergillus sp Aspergillus sp Rhizopus sp Rhizopus sp Aspergillus sp Penicillium Penicillium Rhizopus Aspergillus Aspergillus Rhizopus Rhizopus Aspergillus Penicillium Chuỗi đính bào tử hình cọ vẽ Cọng bào tử phân chia Vách ngăn cọng bào tử Penicillium Hình 9: Các dòng nấm Penicillium Trang 26 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Rhizopus Túi bào tử giải phóng bào tử Khuẩn từ mọc lên nhiều cọng bào tử Rhizopus Túi bào tử non Khuẩn ngang Khuẩn Cọng bào tử Rhizopus Túi bào tử giải phóng bào tử Điểm khuẩn căn, khuẩn ngang từ mọc lên nhiều cọng bào tử Hình 10: Các dòng nấm Rhizopus Trang 27 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Aspergillus Aspergillus Cọng bảo tử không vách ngăn Bọng Thể bình Aspergillus Bào tử đính non Bào tử đính già Bào tử phát tán Hình 11: Các dòng nấm Aspergillus Trang 28 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ 4.3 Đánh giá khả hòa tan lân hữu Hai dòng nấm mốc (Rhizopus 2) (Rhizopus 3) sau nhân giống môi trường lỏng (hình 10) chủng vào phân hữu đậu nành nghiền (hình 6) tương ứng với nghiệm thức (bảng 11) Bảng 11: Bố trí thí nghiệm với hai dòng Rhizopus Nghiệm thức Diễn giải NT1 (đối chứng 1) Bột đậu nành với nước cất vô trùng NT2 Bột đậu nành với dung dịch chứa Rhizopus theo tỉ lệ 3:1 NT3 Bột đậu nành với dung dịch chứa Rhizopus theo tỉ lệ 3:1 NT4 (đối chứng 2) Phân hữu với nước cất vô trùng NT5 Phân hữu với dung dịch chứa Rhizopus theo tỉ lệ 3:1 NT6 Phân hữu với dung dịch chứa Rhizopus theo tỉ lệ 3:1 Sau thời gian ủ tiến hành phân tích mẫu, kết sau Rhizopus (dòng 6) – dịch đậu nành Rhizopus (dòng 7) – dịch đậu nành Hình 12: Nhân mật số môi trường lỏng Trang 29 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ  Đối với mẫu đậu nành nghiền: (bảng 12, 13, 14) Bảng 12: Hiệu Rhizopus hàm lượng lân hòa tan bột đậu nành sau 15 ngày ủ (% (w/w)) Nghiệm thức Hàm lượng lân hòa tan (%) Tỉ lệ tăng so với đối chứng (*) NT 0,058 NT 0,252 330 % NT 0,263 350 % (*) Tính theo công thức: [(NT i – NT 1)/ NT 1] x 100% i tương ứng Từ bảng 10 ta thấy hai nghiệm thức NT2 NT3 hàm lượng lân hòa tan tăng có ý nghĩa tăng từ 330% đến 350% so với NT1 Chứng tỏ hai dòng nấm mốc Rhizopus Rhizopus có khả tổng hợp phytase tốt hoạt động hiệu tương đương môi trường bột đậu nành Bảng 13: Hiệu Rhizopus hàm lượng protein dễ tiêu bột đậu nành sau 15 ngày ủ (% (w/w)) Nghiệm thức Hàm lượng Protein dễ tiêu (%) Tỉ lệ tăng so với đối chứng (*) NT 2,73 NT 3,68 34,8% NT 3,54 29,7% (*) Tính theo công thức: [(NT i – NT 1)/ NT 1] x 100% i tương ứng Ở hai nghiệm thức NT2 NT3 hàm lượng protein dễ tiêu tăng có ý nghĩa tăng tương đương 29,7% đến 34,8% so với nghiệm thức đối chứng Chứng tỏ enzyme phytase không chuyển lân đậu nành từ dạng phytate khó tan sang dạng dễ Trang 30 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ tan mà tác động phóng thích protein liên kết với phytate (khó tiêu) sang dạng protein tự (dễ tiêu) Từ làm tăng giá trị dinh dưỡng hấp thu cho sản phẩm Bảng 14: Chỉ tiêu calcium bột đậu nành (% (w/w)) Nghiệm thức Hàm lượng calcium (%) NT1 (đối chứng) 0,190 NT2 0,177 NT3 0,180 Từ kết thí nghiệm cho thấy hàm lượng calcium NT2 NT3 so với NT1 không khác biệt mặt thống kê  Đối với mẫu phân hữu cơ: (bảng 15) Từ bảng 13 ta thấy hai nghiệm thức NT5 NT6 lượng lân hòa tan tăng có ý nghĩa so với NT4 Tuy nhiên NT5 tăng nhiều NT6 (tăng 56,6% so với 33,9%) Điều chứng tỏ chất phân hữu dòng Rhizopus hoạt động hiệu dòng Rhizopus Bảng 15: Hiệu Rhizopus hàm lượng lân hòa tan phân hữu sau 20 ngày ủ (mgP2O5/g chất khô) Nghiệm thức Lân hòa tan (mgP2O5/g chất khô) Tỉ lệ tăng so với đối chứng (*) NT4 (đối chứng) 14,54 NT5 22,76 56,5 % NT6 19,47 33,9 % (*) Tính theo công thức: [(NT i – NT 1)/ NT 1] x 100% i tương ứng Trang 31 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Ngày Khuẩn ty non dạng sợi mịn Rhizopus Rhizopus Bột đậu nành Ngày 10 Khuẩn ty phát triển ăn sâu vào chất Rhizopus Rhizopus Hình 13: Ủ bột đậu nành với nấm mốc Trang 32 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Tám dòng nấm mốc phân lập môi trường phytate, có bảy dòng tạo halo môi trường - Trong dòng tạo halo có hai dòng Rhizopus Rhizopus có khả sinh phytase nhiều (tạo halo lớn nhất) 5.2 Đề nghị - Tiếp tục khảo sát sâu hai dòng nấm mốc Rhizopus 3: xác định loài đặc tính sinh lý sinh hóa khác - Xác định hoạt tính enzyme phytase dòng nấm tổng hợp - Ứng dụng sản xuất nông nghiệp quy mô lớn Trang 33 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Cao Ngọc Điệp, (2006), Giáo trình Nấm học Tủ sách Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Hữu Hiệp (2002), Bài giảng Thực tập Vi sinh vật đại cương Viện NC PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ Casey A., G Walh (2002), Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142 Industrial Biochemis Programme, Department of Chemical and Environment Science, university of Limerick, Ireland 86: 183-186 Jane E.H., D Kysela, and M Elimelech (2007) Isolation and assessment of phytase – Hydrolysing bacteria from the Delmarva Peninsula Environment Microbilogy 9: 3100-3107 Kerovuo J., J Rouvinen, F Hatzack (2000), Analysis of myo-inositol hexakisphosphate hydrolysis by Bacillus phytase: Indication of a novel reaction mechanism Biochemical Journal 352(3): 623–628 Nelson, T S (1967), The utilization of phytate phosphorus by poultry A review Poultry Sci 46:862–869 Oh B.C, W.C Choi, S Park, Y Kim, T.K Oh (2004) Biochemical properties and sudstrate specificities of alkaline and histidine acid phytases Korea Research Istitute of Bioscience and Biothnology Korea 63: 362 – 372 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học : Tập Enzyme Ứng dụng NXB Giáo dục, 9/2007 Shieh T.R., J.H Ware (1968), Survey of microorganisms for the production of extracellular phytase Applied Microbiology 16: 1348–1351 Vohra, A., T Satyanarayana (2003) Phytase: microbial Sources, Production, Purification, and potential Biotechnological Applications Department of microbiology, University of Delhi, India 21: 29-60 Wodzinski R., A Ullah (1996) Adv Appl Microbiol 42: 263-302 Trang web http://www.vcn.vnn.vn/ - Viện Chăn nuôi – Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Trang 34 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn cha mẹ gia đình sinh thành dưỡng dục động viên cho đến ngày hôm nay! Xin cảm ơn tất quý thầy cô Khoa Khoa học, quý thầy cô môn Sinh quý thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học truyền đạt cho nhiều kiến thức bổ ích trình theo học trường! Xin chân thành cảm ơn PGs.Ts Cao Ngọc Điệp tận tình hướng dẫn, gợi ý cho lời khuyên bổ ích việc nghiên cứu hoàn thành luận văn này! Cảm ơn thầy Trần Thanh Mến – cố vấn học tập Lớp Công nghệ Sinh học K31 quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập trường thời gian thực đề tài! Cảm ơn anh chị Phòng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đặc biệt anh Quệ, chị Mỵ chị Giang hết lòng giúp đỡ suốt trình tiến hành thí nghiệm! Xin cảm ơn tất bạn Lớp Công nghệ Sinh học K31 cổ vũ, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua! Xin kính chúc cha mẹ, quý thầy cô, anh chị bạn dồi sức khỏe thành công Tp Cần Thơ, ngày 02 tháng 08 năm 2009 Trang Trangii35 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ MỤC LỤC CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Acid phytic – phytate 2.2 Phytase gì? 2.3 Nấm mốc sản xuất phytase 2.3.1 Sơ lược đặc điểm hình thái số loại nấm mốc có khả tổng hợp phytase 2.3.1.1 Aspergillus 2.3.1.2 Penicillium 2.3.1.3 Rhizopus 2.3.1.4 Mucor 2.3.2 Một số nấm mốc tổng hợp phytase 10 * Ảnh hưởng phosphate đến việc sản xuất phytase ngoại bào A ficuum NRRL 3135 12 2.4 Các ứng dụng thực tế enzyme phytase 14 2.4.1 Trong công nghiệp thức ăn gia súc 14 2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm 14 2.4.3 Các ứng dụng khác 15 PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Địa điểm thời gian thực 17 3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 17 3.1.2 Thời gian thực 17 3.2 Phương tiện 17 3.2.1 Thiết bị dụng cụ 17 3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 18 3.2.3 Hóa chất môi trường 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phân lập nấm mốc môi trường có phytate 20 3.3.2 Định danh dòng nấm mốc 20 3.3.3 Thí nghiệm đánh giá khả hòa tan lân hữu 21 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân lập nấm mốc môi trường có phytate 24 4.2 Định danh dòng nấm mốc 26 4.3 Đánh giá khả hòa tan lân hữu 29 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Trang Trangiii36 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hàm lượng Phytase Phosphorus phosphor tổng thức ăn thực vật (%) Bảng 2: Sự khác biệt hai chi Aspergillus Penicillium Bảng 3: Sự khác biệt hai chi Rhizopus Mucor Bảng 4: Những loài Aspergillus phân lập từ đất sản xuất phytase ngoại bào có hoạt tính 10 Bảng 5: Một vài chủng Aspergillus khác có khả sản xuất phytase ngoại bào 11 Bảng 6: Ảnh hưởng hàm lượng phosphate lên tổng hợp phytase Aspergillus ficuum NRRL 3135 12 Bảng 7: Ảnh hưởng tỉ lệ C/Pb lên việc sản xuất phytase Aspergillus ficuum NRRL 3135α+ 13 Bảng 8: Bố trí thí nghiệm 21 Bảng 9: Kết tạo halo môi trường đặc 24 Bảng 10: Các dòng nấm mốc 26 Bảng 11: Bố trí thí nghiệm với hai dòng Rhizopus 29 Bảng 12: Hiệu Rhizopus hàm lượng lân hòa tan bột đậu nành sau 15 ngày ủ 30 Bảng 13: Hiệu Rhizopus hàm lượng protein dễ tiêu bột đậu nành sau 15 ngày ủ 30 Bảng 14: Chỉ tiêu calcium bột đậu nành 31 Bảng 15: Hiệu Rhizopus hàm lượng lân hòa tan phân hữu sau 20 ngày ủ 31 Trang Trangiv37 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế thủy phân phosphate hữu phytase Hình 2: Khuẩn ty, cọng bào tử, túi thể bình Aspergillus Hình 3: Cọng bào tử, túi bào tử đính Aspergillus Hình 4: Cọng bào tử, đính bào tử cán, thể bình vẽ, thể bình Penicillium Hình 5: Các loại khuẩn ty Rhizopus - Khuẩn (rhizoids), khuẩn ngang (stolon) cọng bào tử (sporangiophores) Hình 6: Cọng mang bọc bào tử với bọc bào tử Mucor Hình 7: Phân hữu sử dụng cho thí nghiệm 18 Hình 8: Khả tạo halo môi trường đặc tám dòng nấm mốc 25 Hình 9: Các dòng nấm Penicillium 26 Hình 10: Các dòng nấm Rhizopus 27 Hình 11: Các dòng nấm Aspergillus 28 Hình 12: Nhân mật số môi trường lỏng 29 Hình 13: Ủ bột đậu nành với nấm mốc 32 Trang Trangv38 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Tám dòng nấm mốc phân lập từ mẫu thức ăn, phân gia cầm, đất môi trường có phytate nguồn phosphor (lân) nhất, chúng phát triển tạo halo (vùng môi trường trắng đục) chứng tỏ dòng nấm mốc có khả tổng hợp enzyme phytase (enzyme phân giải phytate thành dạng phosphor dễ tan) Quan sát dòng nấm mốc giai đoạn sinh bào tử kính hiển vi quang học định danh dựa vào đặc điểm hình thái, tám dòng nấm mốc gồm có hai dòng Penicillium, ba dòng Rhizopus ba dòng Aspergillus Dựa kích thước halo lớn, hai dòng nấm mốc có khả sinh phytase nhiều (Rhizopus) nhân giống môi trường lỏng để khảo sát khả phân giải phosphor hữu bột đậu nành phân hữu Cả hai dòng nấm Rhizopus gia tăng hàm lượng lân hòa tan từ 330% đến 350%, hàm lượng protein dễ tiêu từ 29,7% đến 34,8% so với đối chứng bột đậu nành sau 15 ngày ủ hai loài làm gia tăng hàm lượng lân hòa tan từ 33,9% (Rhizopus 3) đến 56,5% (Rhizopus 2) phân hữu sau 20 ngày ủ Từ khóa: phosphor hữu cơ, phytase, nấm mốc, lân hòa tan, protein hữu dụng Trang Trangvi39 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Isolation of phytase-synthesizing molds and their applications in agricultural production ABSTRACT Eight mold strains were isolated from samples of cattle feed, poultry manure, soil on glucose-phytate agar medium, these molds can grow and create halo in this medium because they can synthesize phytase From the morphology and ansexual reproduction, eight fungi strains are two strains of Penicillium, three strains of Rhizopus and orthers of Aspergillus Based on the large size of halo, two mold strains having good phytase synthesis were cultivated in soy-flour solution in order to test phosphate-solubilizing ability on soy-flour and compost Both Rhizopus strains increased soluble phosphorus concentration from 330% to 350%, digestible protein from 29.7% to 34.8% in compared with control experiment in soy-flour after 15-day incubation, and they also increased dissovled phosphorus level from 33.9% (with Rhizopus 3) to 56.5% (with Rhizopus 2) in compost after 20day incubation Key words: organic phosphorous, phytase, mold, resolvable phosphorus, digestible protein Trang Trangvii 40 [...]... CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập nấm mốc trên môi trường có phytate Kết quả phân lập được tám dòng nấm mốc có khả năng phát triển trên môi trường phytate Trong số tám dòng nấm mốc này có bảy dòng tạo halo (bảng 9) Bảng 9: Kết quả tạo halo trên môi trường đặc Dòng Halo 1 Có 2 Có 3 Có 4 Có 5 Có 6 Có 7 Có 8 Không Bảy dòng nấm mốc (từ 1 tới 7) có khả năng tạo halo trên môi trường... tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ 2.3.2 Một số nấm mốc tổng hợp phytase Một số nhóm Aspergillus niger sản xuất phytase ngoại bào có thể cắt phosphor từ Calcium phytate trong môi trường axit Được phân lập từ đất A ficuum NRRL 3135 sản xuất hầu hết phytase có hoạt tính trong môi trường tinh bột ngô Việc sản xuất phytase bị ức chế một cách... chứng tỏ chúng có khả năng sản sinh enzyme phytase Hai dòng 6 và 7 tạo halo lớn nhất chứng tỏ chúng có khả năng sản xuất phytase nhiều nhất sẽ được chọn để nhân giống trong môi trường lỏng dùng cho các thí nghiệm tiếp theo Trang 24 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31 Đại học Cần Thơ Hình 8: Khả năng tạo halo trên môi trường đặc của tám dòng nấm. .. CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Tám dòng nấm mốc đã được phân lập trên môi trường phytate, trong đó có bảy dòng tạo được halo trên môi trường này - Trong các dòng tạo halo có hai dòng là Rhizopus 2 và Rhizopus 3 có khả năng sinh phytase nhiều nhất (tạo halo lớn nhất) 5.2 Đề nghị - Tiếp tục khảo sát sâu hơn về hai dòng nấm mốc Rhizopus 2 và 3: như xác định loài và những đặc tính sinh... thức đối chứng (NT3 và NT4) chứng tỏ các dòng nấm mốc có khả năng hòa tan lân hữu cơ hay có khả năng tổng hợp enzyme phytase  Đối với mẫu phân hữu cơ Khảo sát chỉ tiêu lân hòa tan bằng phương pháp Oniani Phương pháp này dựa trên nguyên lý hòa tan các dạng chất photpho trong phân hữu cơ bằng dung dịch H2SO4 0.1N với tỉ lệ 1:25 (1 phân hữu cơ : 25 dung môi), lắc trong 3 phút Hàm lượng photpho trong dung... và tỉ lệ C/P trong môi trường (Shieh và Ware, 1968) Hơn 2000 loài được phân lập từ 68 mẫu đất trong môi trường giàu dinh dưỡng Hoạt tính của phytase ngoại bào được tìm thấy trong một vài nấm mốc khác nhau đã được kiểm tra trên môi trường (Shieh và Ware, 1968) Bảng 4: Những loài Aspergillus phân lập từ đất sản xuất phytase ngoại bào có hoạt tính Loài Số lượng test trên môi trường Số lượng sản phẩm Phytase. .. là 18 loài Tuy nhiên, có nhiều loài sản xuất enzyme nội bào có hoạt tính Trong số 30 loài nấm mốc có khả năng cắt calcium phytate có 28 loài là Aspergillus Nhóm hoạt động mạnh nhất là A niger (Shieh và Ware, 1968) (bảng 4) Bảng 5: Một vài chủng Aspergillus khác có khả năng sản xuất phytase ngoại bào Loài khác của Aspergillus A niger ATCC 9142 A niger... các dòng nấm mốc sinh phytase từ các mẫu thức ăn, phân gia cầm, đất thu thập được Phương pháp phân lập: Ủ các mẫu thu thập trên môi trường M2 M2 là môi trường dinh dưỡng có bổ sung phytase như là nguồn phosphor duy nhất Vì phytate không tan nên làm cho môi trường M2 có màu trắng đục Chỉ những dòng nấm mốc nào có khả năng sử dụng phytate trong môi trường tức là có thể tổng hợp phytase mới có thể phát... này Khi tổng hợp phytase hòa tan phytate nên làm cho một vùng môi trường trở nên trong, vùng đó gọi là halo Những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase sẽ tạo ra halo lớn, phytase sinh ra càng nhiều thì vùng halo càng lớn Căn cứ vào kích thước halo này để chọn những dòng nấm mốc sinh nhiều phytase cho các thí nghiệm về sau Cấy chuyển từ 3 đến 4 lần trên môi trường M2 nhằm làm cho các dòng nấm mốc đạt... vì có những nơi acid phytic và các dẫn xuất của nó chiếm đến 50% tổng lượng phosphor hữu cơ trong đất Việc bổ sung phytase vào đất làm tăng làm hàm lượng phosphor vô cơ trong đất giúp cây tăng trưởng nhanh hơn và giảm chi phí dùng phân bón phosphor cho nhà nông (Vohra et al., 2003) Các phytase vi sinh vật là loại phytase tốt nhất cho các ứng dụng công nghiệp (Kerovuo, 2000) Khi ứng dụng phytase trong ... dòng nấm mốc có khả phát triển môi trường phytate Trong số tám dòng nấm mốc có bảy dòng tạo halo (bảng 9) Bảng 9: Kết tạo halo môi trường đặc Dòng Halo Có Có Có Có Có Có Có Không Bảy dòng nấm mốc. .. nấm mốc (từ tới 7) có khả tạo halo môi trường với phytate nguồn phosphor chứng tỏ chúng có khả sản sinh enzyme phytase Hai dòng tạo halo lớn chứng tỏ chúng có khả sản xuất phytase nhiều chọn... chăn nuôi Mục tiêu đề tài: phân lập nhận diện số dòng nấm mốc tổng hợp enzyme phytase ứng dụng trực tiếp dòng nấm việc cải thiện phân hữu bột đậu nành Trang Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31