Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 Phần 1: mở đầu 1.1.đặt vấn đề Cây cà chua (Lycopersici esculentum Mill), thuộc họ cà (Solanaceae) Cã nguån gèc tõ Trung Mü vµ Nam Mü [32] Cây cà chua rau có giá trị dinh dỡng kinh tế cao Có hàm lợng vitamin, khoáng chất, đờng, lipit, protein điển hình cho nhóm rau cao cấp Thành phần hoá học cà chua chín nh sau: - Nớc: 94-95%, vật chất lại chiếm: 5-6 % gồm chất sau: + Đờng : 55% ( Fructozo, glucozo, saccarozo) + Các chất không hoà tan rỵu : 21% (protein, xenllulozo, pectin, polysaccarit) + Axit hữu cơ: 12% ( Xitric, malic, galacturonic, pyrolidon, cacboxilic) + Chất vô : 7% + Các chất khác: 5% ( carotenoit, ascobic axit, chÊt dƠ bay h¬i, aminoaxit) [1] Vì cà chua đợc a chuộng hầu khắp nớc giới Ngoài sử dụng làm thức ăn tơi, cà chua cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp chế biến với loại hình sản phẩm phong phú: nh nớc quả, cà chua cô đặc, tơng cà chua, mứt cà chua Điều kiện khí hậu nớc ta tơng đối thuận lợi cho sinh trởng phát triển cà chua Chính vậy, diện tích trồng cà chua ngày nhiều đợc mở rộng, giống cà chua có phẩm chất tốt, suất cao đợc nhập ngày nhiều số lợng đa dạng chủng loại nh ngn gèc xt xø Theo sè liƯu thèng kª cđa Trung tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu I (TTKDTVSNKI) khối lợng cà chua nhập năm 2002 24 kg, năm 2004 102 kg đến năm 2005 khối lợng nhập đà lên tới 196kg Tuy nhiên, việc nhập giống đem theo nguy tiềm ẩn khó lờng trớc hết hậu quả, dịch hại nguy hiểm mà đặc biệt Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu – Líp CNSH – K1 lµ bƯnh trun qua hạt giống Bệnh truyền qua hạt giống nhập làm giảm chất lợng hạt giống mà đe doạ gây tổn thất nớc, có bệnh hại đặc biệt nghiêm trọng thuộc danh mục đối tợng kiểm dịch thực vật Việt Nam Việc nghiên cứu loại bệnh hại hạt giống điều cần thiết có ý nghĩa làm sở khoa học cho biện pháp xử lý hạt giống, góp phần bảo vệ sản suất đồng thời tăng cờng công tác kiểm dịch thực vật, ngăn ngừa bệnh hại nguy hiểm từ nớc qua đờng nhập giống vào nớc ta góp phần phát triển Nông Nghiệp bền vững Hạt giống mang nguồn bệnh truyền cho vụ sau lây lan từ nơi tới nơi khác qua đờng trao đổi giống Đây phơng thức lan truyền nhanh nhất, xa hiệu dịch hại Ngoài ra, việc nhập giống ửong nguyên nhân lm thay đổi thành phần dịch hại, làm cho thành phần dịch hại ngày trở nên phong phú phức tạp Điều làm nguy thị trờng xuất nông sản nói chung cà chua nói riêng dịch hại xuất gây hại nớc ta dịch hại kiểm dịch thực vật nớc nhập nhiều nớc giới vấn đề kiểm dịch thực vật giống trồng nhập vấn đề quan trọng cần thiết Nó góp phần loại bỏ dịch hại nằm danh sách cấm nớc ®ã, theo Cơc B¶o VƯ Thùc VËt (1997) [2] BƯnh virus gây hại truyền qua hạt giống cà chua làm giảm suất đồng ruộng mà làm giảm chất lợng hạt giống ảnh hởng tới tỷ lệ nảy mầm hạt tích luỹ ngn bƯnh cho vơ sau HiƯn nay, theo sè liƯu thống kê CABI, giới đà phát đợc 44 loài virus gây hại cà chua Trong đó, có 20 loài có khả truyền qua hạt giống nhiều loài số thuộc danh mục kiểm dịch thực vật nớc giới nh: virus Andean potato mottle virus đối tợng kiểm dịch thực vật khối liên minh Châu Âu, Nam Mü, c¸c níc thc khèi COSAVE; Beet curly top virus đối tợng kiểm dịch thực vật Bắc Mỹ, Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu – Líp CNSH – K1 IASPC vµ CPPC; Potato Yellow dwarl virus đối tợng kiểm dịch thực vật nhóm I Châu Âu, Chính vậy, việc tạo nguồn hạt giống, bệnh ngày trở nên quan trọng đóng vai trò then chốt tạo giống Cũng từ đây, khoa học sức khoẻ hạt giống đời, đợc nhiều nhà khoa học giới quan tâm ngày phát triển mạnh mẽ nớc ta, vấn đề sức khoẻ hạt giống đặc biệt bệnh hại hạt giống cà chua vấn đề Mặc dù đà có số chơng trình giúp đỡ tổ chức giới số nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, song nghiên cứu tập trung vào nhóm nấm vi khuẩn, bệnh virus truyền qua hạt giống đợc quan tâm Xuất phát từ vấn đề trên, dới phân công khoa Nông Học trờng Đại Học Nông Nghiệp I Hà Nội dới hớng dẫn GS.TS Vũ Triệu Mân KS Nguyễn Viết Hải TTKDTVSNKI HN thực đề tài: "Nghiên cứu bệnh ToMV, CMV hạt giống cà chua nhập số biện pháp xử lý" 1.2 Mục đích yêu cầu - Điều tra, giám định thành phần bệnh virus gây hại truyền qua hạt giống cà chua nhập khẩu, cà chua giống đà đợc trồng điều kiện bán đồng ruộng nhà lới cách ly TTKDTVSNK I - Khảo sát biện pháp xử lý hạt giống phòng trừ bệnh phơng pháp nhiệt học chế phẩm sinh học 1.2.2 Yêu cầu - Kiểm tra, xác định tình hình bệnh virus hại hạt giống cà chua nhËp khÈu tríc vµ sau gieo trång - ThÝ nghiệm khả chẩn đoán bệnh virus ToMV, CMV phơng pháp ELISA - Bớc đầu nghiên cứu biện pháp xử lý hạt giống cà chua phơng pháp nhiệt học chế phẩm sinh học Báo cáo thực tËp tèt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Những nghiên cứu nớc 2.1.1 Bệnh virus hại trồng trªn thÕ giíi HiƯn nay, trªn thÕ giíi ngêi ta đà phát 650 bệnh hại thực vật virus gây (L Bos., 1993), số tăng lên không ngừng [15,16] Theo Uỷ ban Quốc tế định loại virus (ICTV) thông qua tháng năm 2000 Virus hại thực vật đợc định loại có khoảng 14 họ đó: 13 họ virus đà đợc xác định, họ cha đợc xác định Hầu hết virus thuộc 70 giống khác Virus gây triệu chứng bệnh khảm chiếm khoảng 27% Trên cà chua có tới 40 loại virus phát sinh phát triển gây hại bao gồm nhiều chủng loại khác nh: CMV, TLCV, ToMV, TYLCV, TRCV, virus X, virus Y, … C¸c loại virus biểu triệu chứng khác chủ yếu làm ảnh hởng nghiêm trọng đến suất [3, 15] Theo Thẩm Phúc Lân (1986) có khoảng 170 virus truyền từ vùng sang vùng khác theo đờng nhập từ nớc từ loại con, cành ghép, gốc ghép, cấy mô Khoảng 17 virus tồn hạt giống từ truyền từ vùng sang vùng khác (David G A Walkey, 1985) [4] Với thành phần virus hại thực vật phong phú đa dạng nhiều virus có phủ ký chủ rộng nh việc tiến hành nghiên cứu nói chung virus hại cà chua nói riêng đà trở thành đối tợng nghiên cứu bản, nghiên cứu ứng dụng cần đợc tiến hành thờng xuyên Đặc biệt, cần trọng vùng sinh thái định Những kết nghiên cứu có ý nghĩa góp phần đa chủ trơng hợp lý sản xuất, đạo phòng trừ dịch hại [15] Theo EPPO (Tổ chức Bảo Vệ Thực Vật Châu Âu), có nhiều virus xuất gây hại nghiêm trọng cà chua số trồng khác đối tợng kiểm dịch thực vật cđa nhiỊu níc trªn thÕ giíi Mét sè virus nh: Tomato apical Stunt pospivirade (TASP) (EPPO, 2003); Tomato infections chlorosis virus (TICV) (EPPO, 2005); Pepino mosaic virus B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 (PeMV) (EPPO, 2006) [17,18,19] ChØ tÝnh riªng thiƯt hại kinh tế TICV gây hại cà chua bang Califocnia (Mỹ) lên đến triệu đô la Mỹ mùa vụ [18] TICV đà đợc thông báo phát thấy Nhật, Đài Loan, Indonexia số nớc Châu Âu [20, 21, 21] 2.1.1.1 Những nghiªn cøu vỊ ToMV Tªn thêng gäi: Tomato mosaic virus tên viết tắt ToMV Các tên gọi khác: Lycopersicum virus (Rev appl Mycol 36 : 303) Ngoµi ra, có nhiều tên gọi khác dựa vào chủng ToMV Virus khảm cà chua ToMV đợc phát mô tả lần Clinton (1909) cà chua trồng bang Conecticut (Mỹ) [23,24,25], Wwetrdijk (1910), Allard (1916) (Bang Conecticut, Mü) VÞ trÝ phân loại [23]: ToMV thuộc nhóm Tobamovirrus Nhóm có số đặc điểm nh sau: Hầu hết virus thuộc nhóm có hình gậy thẳng, kích thớc 300x18nm (Chiều dài x đờng kính chiều rộng), hệ số lắng đọng 190S, sợi virus đợc cấu tạo 2000 tiểu đơn vị xếp theo hình sợi xoắn ốc bao quanh genom có chứa phân tử đơn sỵi RNA, chiÕm 5% träng lỵng virus RNA cã träng lợng phân tử x 106Da Các virus thuộc nhóm có ngỡng nhiệt độ hoạt tính (TIP) 900C, nhựa virus tồn nhiều năm liền, mật độ tập trung cao lên tới 10g/l Nhóm virus thờng gây triệu chứng đốm chết khảm lá, đờng lan truyền chủ yếu qua tiếp xúc giọt dịch, tiếp xúc giới khoẻ bệnh, truyền qua hạt giống Sợi virus đợc tìm thấy tế bào chất, lục lạp không bào ToMV đợc phát Đài Loan, có chủng virus gây hại cà chua gồm: ToMV1, ToMV2, ToMV3, (S.K Green, L.H Wang, 1980, 1982), ba chủng mang gen khác nhau, ToMV gây hại hầu hết giống cà chua thơng mại [26] Theo Smith (1975) ToMV có hai chđng quan träng lµ Tomato aucuba mosaic vµ Tomato enation mottle [25] B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 2.1.1.2 TriƯu chøng ToMV gây cà chua Tomato mosaicvirrus gây hại hầu hết họ cà Triệu chứng ToMV gây cà chua chịu ảnh hởng lớn nhiệt độ, độ dài ngày, tuổi cây, độ độc virus phơng thức trồng (Holling S M., Huttingga, 1976) [24] TriÖu chøng xuÊt hiÖn phổ biến cà chua vào vụ hè cà chua đợc trồng nhà kính, cà chua bị nhiễm bệnh xuất đốm quả, tạo vết sọc chết hoại thân , Vào mùa đông, thờng bị thối, mùa hè thờng bị khô giai đoạn phát triển [27,24] Mùa đông ngày ngắn, cờng độ ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp khoảng 200C, thờng còi cọc, dơng xỉ dạng sợi chỉ, có đốm sáng Thiệt hại suất lên tới – 23%, (Broadbent, 1964; Rast, 1975) Theo Simth (1957) [62] cà chua bị nhiễm đồng thời virus ToMV PVX gây lên khảm sọc đôi ToMV gây hại thân cây, làm còi cọc, dơng xỉ hình sợi có kèm theo vết đốm sáng [20] cuống bị bệnh phát triển gây vết lõm sâu khảm dạng sọc đơn (Jarset, 1930) Điểm chung trở nên cỗi kèm theo vặn vẹo méo mó dạng dơng xỉ biểu cây, yếu ớt Virus nguyên nhân gây đốm vằn, đốm sọc hoại tử cà chua Bệnh không làm chết nhng chúng làm chất lợng sản lợng Cây ớt (Capisicum anauum) có sức đề kháng với ToMV Tuy nhiên, điều kiện canh tác chật hẹp, trồng ớt sau trồng cà chua bị nhiễm ớt bị nhiễm Trên thuốc (Nicotiana tabacum) khoai tây (Solanum turberosum) ToMV gây đốm lá, rụng thối thân còi cọc, rau muối (Chenopodium murale) ToMV nguyên nhân rụng lá, còi cọc chết hoại (Bad and Paulus, 1963) [24] Các tác giả phân nhóm: - Nhóm 1: Lá cà chua bị khảm đốm tạo thành vùng xanh nhạt, xanh đậm, gây biến dạng non Đây triệu chứng chung cà chua nhà kính phản ứng lại điều kiện nhiệt độ thấp Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu – Líp CNSH – K1 - Nhãm 2: TriƯu chøng đốm vàng (Bewley, 1923; Smith, 1957) - Nhóm 3: Triệu chứng đốm chết hoại thân lá, cuống Một số chủng virus gây triệu chứng sọc đơn hay sọc nhà kính (Glasshouse Streak) thân cây, cuống lá, gây chết Quả nhiễm bệnh tạo vùng chết hoại cục lõm lại bề mặt Một vài chủng virus gây triệu chứng đốm sọc nhiệt độ 26 0C thấp h¬n (Komuno et al, 1996) Mét sè chđng cđa ToMV kết hợp với PVX lây nhiễm tạo triệu chứng dạng sọc đôi Quả bị nhiễm bệnh bị chết hoại cục bộ, sau lõm lại (Vallean and Jonhon, 1930; Wharton, 1957) số chủng khác gây chết hoại làm vỏ cứng ròn (Rast, 1957) [24] Theo nghiên cứu gần đà đợc công bố ToMV gây hại số loài hoa cảnh Đà có báo có ToMV gây hại hoa Râm Bụt (Hibiscus rosa sinenis): gây khảm hệ thống non gây nhăn biến dạng già gây lùn [28] Theo kết nghiên cứu Kamenova I Addkins S Achors S (2004) ToMV gây hại hoa nhài (Jasmine sp) bang Florida (Mü) [22] TriƯu chøng xt hiƯn hay kh«ng xt hiện, rõ ràng hay không rõ ràng phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh nh: mùa vụ, ánh sáng, nhiệt độ, sinh trởng phát triển cà chua Từ nhận xét trên, thấy: Phải có phơng pháp hỗ trợ cần xác định xác nguyên nhân gây bệnh loại virus hại cà chua nh phơng pháp ELISA, phơng pháp dùng thị, phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 2.1.1.3 Phân bố địa lý phạm vi ký chủ ToMV + Phân bố địa lý: ToMV phân bố toàn giới đặc biệt vùng trồng họ cà + Phạm vi ký chđ: ToMV cã ph¹m vi ký chđ réng, cã tíi 127 loµi thc 23 hä thùc vËt nhiƠm ToMV (Edwards and Christie, 1997) [15] Theo Maitlin (1984) cã trªn họ thực vật mẫn cảm với ToMV [30] Năm 1909, Clinton đà tiến hành lây nhiễm thực nghiệm ToMV nhiều loại xác định nhiều mẫn cảm víi ToMV: - Capsicum annuum, Caosicum frustescens, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium murale, Nicotiana benhamiana Cây ký chủ mẫn cảm ToMV: - Cây cà độc dợc (Solanum giganteum): gây khảm hệ thống - Cây thuốc (Nicotiana tabacum cv White Burley): g©y vÕt chÕt cơc bé - C©y rau mi (Chenopodium murale): Gây rụng lá, còi cọc chết hoại (Bald and Paulus, 1963) [24] Cây ký chủ trì nhân giống: - Cà chua (Lycopersicon esculentum) - Thuốc (Nicotiana tabacum cv Samsun) Cây ký chủ kiÓm tra: - Nicotiana benthamiana, Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum cv Samsun Nhiều tác giả cho rằng: ToMV công nhiều loai ký chủ khác kể cà chua, hồ tiêu, thuốc lá, rau bina, thuốc cảnh cúc vạn thọ Trên cà chua, virus lây nhiễm gây vết đốm sáng xanh tối xen kẽ bề mạt [27,24] 2.1.1.4 Đặc tính virus ToMV + Đặc tính vật lý hoá học: Báo cáo thực tập tốt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 - Điểm đẳng điện (Isoelestric point): pH từ 4,5 4,64 - Nhiệt độ giới hạn hoạt tính TIP (Thermal Inactivaytion Point): Q10= 850C- 900C - Ngìng pha lo·ng (Dilution End Point): DEP 10-5 – 10-7 - Thêi gian sống gây hại dịch (Longetivy In Vitro): LIV 500 ngày Trong tàn d cà chua, ToMV tồn 24 năm, nhiệt độ phòng 200C ToMV có khả sống gây bệnh sau vài tháng nhiệt độ xuống thấp 20C ToMV có khả sống (Rast, 1975) [30, 24] + Hình thái cấu trúc ToMV Hình thái: ToMV có hình gậy, chiều dài 300nm, đờng kính chiều rộng 18nm Bộ genom RNA, sợi đơn, dạng hình xoắn ốc Cấu trúc: Nucleic Acid: 5%, hạt hình virus sợi RNA, thành phần RNA gåm: 23%G, 28%A, 19%C, 305U (Maldeles, 1968) [24] Vá protein (CP): 95%, kÝch cì 17600Da (Fralk Kel and Conrat, 1957), (Wwiltmann and Liebold 1967) 2.1.1.5 Sù trun nhiƠm cđa virus ToMV + Trun lan qua h¹t gièng: Theo David G A Walkey (1985) cã chđng 17 lo¹i virus trun qua hạt giống ToMV loại virus truyền lan qua hạt giống Hạt loại giống khác mức độ xâm nhiễm khác có biến đổi lớn, khoảng 50% số hạt thờng xuyên bị nhiễm có lên tới 94% (Van Winkel, 1965) Nguồn virus tồn hạt giống ngn l©y nhiƠm quan träng cho vơ sau ToMV chđ yếu tồn vỏ hạt, theo Taylor Wind Colaborater (1996), Broadbent (1965) có nội nhủ, ToMV không nằm phôi mầm hạt bị bệnh, ToMV nhiễm nhẹ vài tháng mẫu hạt thu từ mẹ bị nhiễm lan truyền học sang [27, 30, 24] Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Líp CNSH – K1 + Sù lan trun qua vect¬ ToMV không lan truyền qua đờng côn trùng môi giới mà chủ yếu qua đờng tiếp xúc học từ cây, đất, gốc ghép, cành ghép Dụng cụ gieo trồng bị nhiễm ToMV (Broadley, 1972) Virus tồn dịch cây, tàn d thực vật Cây trồng khoẻ bị nhiễm qua vết thơng giíi [20] Ngn níc tíi bÞ nhiƠm ToMV cịng më rộng phạm vi lan truyền Các chủng ToMV truyền nhờ tơ hồng Vào mùa đông chủng "yellow" "green" dễ bị lây nhiễm mùa hè (Schmelzer, 1956) [24] 2.1.1.6 Thiệt hại kinh tế Trên giới thiệt hại ToMV gây cà chua khoảng 20%, sản xuất cà chua nhà kính khoảng 25% sản lợng [31, 24] 2.1.2 Những nghiên cứu virus gây bệnh dơng xØ (Cucumber mosaic virus – CMV) BƯnh cã tªn gäi kh¸c: Cucumis virus 1, Marrow cucumis Blight virus, Tomato Fern leaf virus TriƯu chøng g©y bƯnh: CMV nhiƠm hƯ thèng, gây triệu chứng khảm thờng, khảm biến vàng, cành mọc thành búi rậm rạp, còi cọc, có vết vằn, chét biến dạng cong vặn vẹo, hẹp, kéo dài dạng dơng xỉ (Zitter I A., 1993) [17] Phân bố địa lý: Bệnh phân bố rộng khắp giới, đặc biệt vùng nhiệt đới nãng Èm C¸c chđng cđa ToMV: - Chđng Yellow cđa Price (1934): gây khảm thờng thuốc (Nicotiana spp) chết hoại cục Zinnia elegans - Chđng cđa Y cđa Price (1934): TriƯu chøng trªn thuốc (Nicotiana spp), giống chủng Yellow nhng cờng độ yếu Nhiễm hệ thống Vigna sinensis 10 Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Líp CNSH – K1 87,5 92,5 95 85 97 90 92,5 91 87,5 90 90 93 85 92,5 48 70 77,5 66,5 70 77,5 57 60,5 62, 52,5 60 67 33,5 70 61,5 52,5 57,5 55 71,5 74 75 33,5 44,5 54 19,5 53,5 15 600C 10 15 500C 10 15 550C 10 15 600C 10 15 35 95 89 90 85,5 91 92 91,5 94 90 92,5 91 92,5 89,5 68,5 67,5 65 88 90 85 76,5 77,5 80 90 92,5 94,5 82,5 80 84,5 96 94,5 97,5 67 69 68,5 65 67,5 64,5 100 94,5 90 B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Ngun Thị Thu Lớp CNSH K1 Chúng rút mét sè kÕt luËn nh sau: Nh vËy sau xử lý điều kiện nhiệt độ không khí nóng, nớc nóng không ảnh hởng đến tỷ lệ nảy mầm hạt giống Các mẫu hạt giống có tỷ lệ nảy mầm cao với tỷ lệ nảy mầm hạt giống ghi bao bì Có số thí nghiệm nh điều kiện không khÝ nãng ®èi víi gièng HT7 ë 600C 10 phút tỷ lệ nảy mầm sau lần nhắc lại trung bình 44%, tỷ lệ nảy mầm thấp điều giải thích trình bảo quản hạt giống không đợc tốt (Do giống mua cửa hàng bán hạt giống rau gần Trờng Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội) Bên cạnh theo dõi tỷ lệ nảy mầm mẫu hạt giống bị bệnh tiến hành thí nghiệm theo dõi số giống không bị bệnh thấy: Mẫu hạt giống không nhiễm bệnh nảy mầm nhanh hạt bị nhiễm bệnh virus ToMV, CMV điều phù hợp với kết nghiên cứu Maicias (1980) Các mẫu hạt giống khác tỷ lệ nảy mầm hạt giống khác Chế phẩm sinh học EM 4% (Chúng tiến hành pha loÃng theo khuyến cáo ngêi híng dÉn lµ 3ml EM 4% : 7ml níc cất) Ngâm hạt dung dịch EM 4% sau 20 phút Các mẫu hạt có tỷ lệ nảy mầm cao Ngoài làm thêm thí nghiệm để tính tỷ lệ nảy mầm mẫu hạt giống sau xử lý điều kiện không khí nóng 70 0C ngày thấy giống BM 199 F1 tỷ lệ nảy mầm 90%, DVS 79 83,5% Nh biện pháp xử lý thí nghiệm không ảnh hởng tới chất lợng hạt Tuy nhiên để phòng trừ đợc virus ToMV, CMV có thí nghiệm xử lý hạt giống nhiệt độ 700C xử lý hạt dung dịch EM 4% có ý nghĩa Bảng 4.7 : Tỷ lệ nảy mầm hạt giống sau xử lý chÕ phÈm sinh häc EM 4% 36 B¸o c¸o thực tập tốt nghiệp Giống Hạt thí nghiệm Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 Hạt nảy mầm TLNM(%) 200 189 94,5 BM199F1 200 190 95 200 185 92,5 200 165 82,5 Savior 200 170 85 200 175 87,5 200 169 84,5 DVS79 200 170 85 200 185 92,5 IV: Kết nghiên cứu xử lý hạt giống phơng pháp nhiệt học chế phẩm sinh học 4.1 Kết nghiên cứu xử lý hạt giống phơng pháp nhiệt học Sau chạy ELISA 35 mẫu hạt giống xác định đợc giống bị nhiễm loại virus, chọn lựa giống tổng số giống bị nhiễm bệnh Cân giống 1g với số lần lặp lại 12 lần nh sau: 500C thêi gian lµ 1g 500C thêi gian 10 lµ 1g 500C thêi gian 15 lµ 1g 550C thêi gian lµ 1g 550C thêi gian 10 lµ 1g 550C thêi gian 15 lµ 1g 600C thêi gian lµ 1g 600C thêi gian 10 lµ 1g 600C thêi gian 15 phút 1g Cho khối lợng mẫu hạt đà cân vào túi nghiền mẫu, cân tiếp lần lặp lại với khối lợng 1g cho vào túi đánh số thứ tự mẫu túi Chúng xử lý mẫu hạt điều kiện nhiệt học với ngỡng nhiệt độ 500C, 550C, 600C ngỡng nhiệt độ tơng ứng với thời gian phót, 10 phót, 15 37 B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 phút Tiếp theo sau tiếp tục chia 1g thí nghiệm làm phần với phần 0,25g phần làm thí nghiệm: 0,25g phần 1: Chạy ELISA kiểm tra virus ToMV 0,25g phần 2: Chạy ELISA kiểm tra virus CMV 0,25g phần 3: Làm thí nghiệm để tính tỷ lệ nảy mầm hạt 0,25g phần4: Tiến hành gieo hạt chậu để theo dõi 4.1.1 Kết nghiên cứu xử lý hạt giống phơng pháp không khí nóng 38 Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 Bảng 4.8: Kết kiểm tra tồn virus CMV sau đà xử lý điều kiện không khí nóng Giống Nhiệt độ (0C) Thời gian Trị số ELISA BM 199 F1 500C 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 0,392 0,366 0,339 0,369 0,415 0,324 0,393 0,379 0,359 0,382 0,350 0,382 0,190 0,341 0,397 0,382 0,355 0,345 0,175 0,351 0,331 0,252 0,387 0,188 0,165 0,176 0,172 550C 600C HT7 500C 550C 600C Ên §é 500C 550C 600C §èi chøng 0,305 0,270 0,261 KÕt luËn + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Sau c¸c mẫu hạt giống bị nhiễm hai loại virus đợc xử lý điều kiện nhiệt độ không khí nóng rút đợc số kết luận nh sau: Trị số ELISA thu đợc xử lý nhiệt độ với trị số ELISA thu đợc không xử lý hầu nh khác Đa số mẫu hạt bị nhiễm 39 Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Líp CNSH – K1 bƯnh ë mét sè thÝ ghiƯm có phản ứng (-) với kháng huyết CMV có lẽ ta lấy ngẫu nhiên mẫu hạt đem làm thí nghiệm (trong giống lô hạt có hạt bị nhiễm virus có hạt không bị nhiễm bệnh) Trị số ELISA thu đợc thời gian khác ngỡng nhiệt độ không cã sù chªnh lƯch thËm chÝ ë thêi gian 15 phút trị số ELISA thu đợc cao trÞ sè ELISA ë phót, 10 Nh vËy việc xử lý hạt thời gian khác ý nghĩa việc làm giảm nồng độ virus Tơng tự nh trị số ELISA thu đợc ngỡng nhiệt độ khác khác biệt Virus ToMV bị hoạt tính 95 0C ë 500C, 550C, 600C nhiƯt ®é cha ®đ nóng để làm hoạt tính virus Do việc xử lý hạt với điều kiện không khí nóng ngỡng nhiệt độ khác nhau, tơng ứng với ngỡng nhiệt độ thời gian khác không làm giảm khả gây bệnh virus Không cã ý nghÜa viƯc phßng chèng bƯnh virus ToMV, CMV lây lan qua đờng hạt giống cà chua 40 Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 Bảng 4.9: Kết kiểm tra tồn virus ToMV sai xử lý mẫu hạt điều kiện không khí nóng Giống Nhiệt độ (0C) Thời gian Trị số ELISA §èi chøng KÕt luËn 0,525 + 10 0,501 + BM 199 0,405 15 0,695 + F1 0,532 + 550C 10 0,480 + 15 0,474 + 0,502 + 10 0,614 + 600C 15 0,474 + 0,408 500C 10 0,519 + HT7 0,504 15 0,620 + 0,524 + 550C 10 0,537 + 15 0,632 + 0,589 + 60 C 10 0,509 15 0,491 0,583 + 500C 10 0,530 + 0,486 Ên §é 15 0,401 0,543 + 550C 10 0,531 + 15 0,487 + 0,522 + 10 0,508 + 600C 15 0,622 + Bảng 4.10: Kết kiểm tra tồn virus CMV sau ®· xư lý 500C ®iỊu kiƯn níc nãng Gièng NhiƯt ®é (0C) 50 C BM 199 F1 550C Thêi gian TrÞ sè ELISA 10 15 0,616 0,501 0,658 0,638 41 §èi chøng 0,575 KÕt luËn + + + B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 10 0,523 + 15 0,489 60 C 0,662 + 10 0,640 + 15 0,609 + HT7 50 C 0,535 0,499 + 10 0,641 + 15 0,583 + 55 C 0,653 + 10 0,508 + 15 0,536 + 60 C 0,663 + 10 0,411 15 0,595 + 0,489 500C 10 0,496 + 0,486 Ên §é 15 0,593 + 0,683 + 55 C 10 0,342 15 0,557 + 0,506 + 10 0,601 + 60 C 15 0,611 + B¶ng 4.11: Kết kiểm tra tồn virus ToMV sai xử lý mẫu hạt điều kiện níc nãng Gièng NhiƯt ®é (0C) 50 C BM 199 F1 550C 600C 500C HT7 550C Thêi gian TrÞ sè ELISA 10 15 10 15 10 15 10 15 0,454 0,300 0,486 0,535 0,340 0,334 0,507 0,487 0,413 0,334 0,289 0,354 0,314 42 §èi chøng 0,305 0,276 KÕt luËn + + + + + + + + B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 10 0,298 + 15 0,308 + 60 C 0,378 + 10 0,301 + 15 0,298 + 50 C 0,412 0,261 + Ên §é 10 0,567 + 15 0,408 + 0,289 550C 10 0,325 15 0,366 + 0,389 + 60 C 10 0,308 15 0,354 + T¬ng tự nh phơng pháp xử lý không khí nóng, phơng pháp xử lý nớc nóng ý nghĩa việc phòng bệnh virus truyền qua hạt trị số ELISA thu đợc sau xử lý có phản ứng dơng với kháng huyết Trị số ELISA thu đợc ngỡng nhiệt độ khác nhau, mức độ thời gian khác chệnh lệch Chúng tiến hành gieo trồng tiếp phần lại 0,25g hạt đà đợc xử lý điều kiện nhiệt nóng không khí nóng để tiến hành theo dõi Hầu hết giống sau có từ 10 thật bắt đầu có biểu triệu chứng bệnh Tỷ lệ bị bệnh chênh lệch so với trồng không xử lý Bảng 4.12: Số bị bệnh ToMV, CMV sau xử lý điều kiện không khí nóng nớc nóng Giống NhiƯt ®é BM 199 50 C F1 550C 600C Thêi gian 10 15 10 15 10 Níc nãng ToMV% 26,6 16,6 20 30 26,6 33,3 13,3 46,6 43 CMV% 10 3,3 10 13,3 13,3 16,6 10 16,6 Kh«ng khÝ nãng ToMV% CMV% 23,3 10 10 3,3 13,3 3,3 16,6 6,6 3,3 10 6,6 36,6 13,3 13,3 B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp 15 HT7 §/C 500C 550C 600C §/C 10 15 10 15 10 15 Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 20 13,3 3,3 30 23,3 16,6 40 20 13,3 30 33,3 20 10 6,6 3,3 13,3 16,6 20 10 20 3,3 6,6 13,3 16,6 13,3 10 20 23,3 10 6,6 10 26,6 6.6 6,6 3,3 6,6 6,6 6,6 10 3,3 3,3 3,3 6,6 Nh qua phơng pháp kiểm tra virus Bằng ELISA gieo trồng để theo dõi tỷ lệ bệnh mẫu hạt thấy rằng: Hầu hết mẫu hạt giống thí nghiệm có phản ứng dơng với kháng huyết cho trị số ELISA kh¸ cao Sau gieo trång c¸c gièng theo dâi tû lƯ bƯnh ë tõng thÝ nghiƯm th× tû lệ mẫu bị nhiễm bệnh cao Khi kiểm tra mẫu bị bệnh ELISA thấy mẫu bệnh có phản ứng dơng với kháng huyết nh BM 199 F1 có trị số 0,560; HT7 0,437 ấn Độ 0,489 Ngoài tiến hành chạy ELISA cđa mÉu h¹t gièng sau xư lý ë 700C ngày giống Savior BM 199 F Sau ch¹y ELISA mÉu h¹t giống két mẫu hạt giống bÞ nhiƠm ToMV, CMV nhng víi trÞ sè ELISA thÊp nhiều so với không xử lý: BM 199 F 0,239; Savior 0,308 Sau tiếp tục gieo trồng kết theo dõi thật bất ngờ Tỷ lệ bị bệnh giảm đáng kể BM 199 F với 30 có nhiễm ToMV, Savior 30 có nhiễm ToMV, CMV Vì virus ToMV, CMV c trú bên vỏ hạt nội nhủ hạt nên sau xử lý 700C thời gian dài ngày đà làm giảm làm hoạt tính virus gây bệnh kháng nguyên vần tồn Phơng pháp xử 44 Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu – Líp CNSH – K1 lý nhiƯt häc ë 700C ngµy cã ý nghÜa quan träng viƯc hạn chế đợc virus gây bệnh 4.2 Kết nghiên cøu xư lý h¹t gièng b»ng chÕ phÈm sinh häc 4.2.1 Thí nghiệm Chúng tiến hành cân giống giống 0,25g với lần nhắc lại gièng thÝ nghiƯm lµ BM 199 F1, Pefect 89, TM2 Dung dịch EM 4% pha theo tỷ lệ 3ml EM 4% : 7ml níc cÊt Cho c¸c mÉu hạt vào dung dịch EM 4% sau pha loÃng với thời gian 20 phút Sau tiến hành gieo mẫu hạt giống Khi giai đoạn thật kh«ng thÊy cã biĨu hiƯn cđa triƯu chøng bƯnh Nhng vào giai đoạn 11 thật thấy có số có triệu chứng bệnh xuất vết đốm sáng vàng Tuy nhiên số bị bệnh lần nhắc lại chênh lệch Giống BM 199 F1 30 lần có bị nhiễm ToMV, lần thí nghiệm với 30 có có bị nhiễm ToMV, CMV lần ToMV Bảng 4.13: Tỷ lệ số bị nhiễm ToMV, CMV gièng sau xư lý dung dÞch EM 4% Giống BM 199 F1 Perfect 89 TM2 Lần nhắc lại §/C §/C §/C Trång – Ra hoa ToMV% CMV% 3 13,3 3,3 0 6 3 10 3,3 3 13,3 6,6 45 Ra hoa – Qu¶ non ToMV% CMV% 6 13,3 3,3 3 13,3 3,3 3 13,3 6,6 B¸o c¸o thùc tËp tèt nghiƯp Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 Qua bảng số liệu tỷ lệ bệnh vào giai đoạn non cđa gièng BM 199 F1 trung b×nh qua lần nhắc lại 9%, giống Perfect 89 từ – 9%, gièng TM2 tõ – 6% Tû lÖ bị bệnh giảm đáng kể so với tỷ lệ cđa gièng trång kh«ng xư lý gièng BM 199 F1 lµ 16,6%; Perfect 89 lµ 16,6%; TM2 lµ 19,9% Phơng pháp xử lý dung dịch EM 4% (sau pha loÃng) 20 phút đà hạn chế đợc lây lan virus từ hạt tới Do virus ToMV, CMV tồn vỏ hạt nên trình ngâm hạt đà làm hoạt tính virus gây hại Đặc biệt phơng pháp xử lý có ý nghĩa lớn việc giảm bớt nồng độ virus ToMV Tuy nhiên, phơng pháp làm số thí nghiệm nên muốn kiểm chứng lại mức độ tin cậy cần phải có thời gian làm thật nhiều thí nghiệm Bảng 4.14: Kết kiểm tra tồn virus ToMV, CMV cđa gièng sau xư lý dung dịch EM 4% ToMV OD Kết luận nhắc lại 0,341 + BM 199 F1 0,201 0,299 §/C 0,478 + 0,252 Perfect 89 0,389 + 0,109 §/C 0,399 + 0,243 TM2 0,187 0,543 + Đ/C 0,613 + Đối chứng ToMV: (+) 0,329 Giống Số lần (-) 0,189 CMV: (+) 0,311 (-) lµ 0,187 4.2.2 ThÝ nghiƯm 46 OD 0,029 0,357 0,298 0,357 0,274 0,128 0,278 0,412 0,128 0,33 0,189 0,354 CMV KÕt luËn + + + + + Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu Lớp CNSH K1 Chúng tiến hành gieo trồng gièng cµ chua BM 199 F 1, Perfect 89, HT7 Sau mọc đợc 15 ngày, giai đoạn con, sinh trởng bình thờng xanh tốt, có thật Lúc cha có biểu triệu chứng bệnh Chúng tiến hành tới dung dịch EM 4% (sau pha lo·ng) Sau tíi theo dâi th× thÊy bình thờng, cha có biểu bệnh Đến ngày 30 giống đà thấy có mét sè c©y xt hiƯn triƯu chøng cđa bƯnh ToMV Chúng tiến hành tới dung dịch EM 4% lần thứ Sau lần tới thứ vào giai đoạn 10 thật Tỷ lệ bị bệnh xuất tăng dần sau 45 ngày trồng Tỷ lệ bị bệnh ToMV chiếm đa số, bị nhiễm CMV Bên cạnh giống ®èi chøng (kh«ng xư lý) cịng xt hiƯn triƯu chøng bệnh nhiên tỷ lệ bị bệnh không cã sù chƯnh lƯch so víi gièng ®· xư lý Khi đợc 60 ngày, cà chua vào giai đoạn hoa hình thành tỷ lệ bị bệnh tăng lên cao Tỷ lệ bị bệnh lần nhắc lại giống giao động không đáng kể BM 199 F dao động 19,97% - 20,3%; Perfect 89 13,3 19,97%; HT 16,6 20,67% Tỷ lệ bị bệnh ToMV lớn nhiều so với bị bệnh CMV Tỷ lệ bị bệnh sau xử lý so với công thức đối chứng sai khác Bảng 4.15: Tỷ lệ bị nhiƠm bƯnh cđa gièng sau tíi dung dÞch EM 4% Sè lÇn Trång – Ra hoa Ra hoa Quả non nhắc lại ToMV% CMV% ToMV% CMV% 13,3 3,3 20 3,3 BM 199 F1 10 6,67 13,3 6,67 10 20 3,3 §/C 10 6,67 13,3 6,67 6,67 3,3 10 3,3 Perfect 89 13,3 3,3 13,3 3,3 6,67 10 3,3 §/C 10 6,67 13,3 6,67 20 6,67 20 6,67 TM2 13,3 6,67 20 6,67 10 3,3 13,3 3,3 Đ/C 13,3 3,3 20 6,67 4.3 Biện pháp phòng trừ bệnh virus ToMV, CMV gây cà chua Giống 47 Báo cáo thực tập tốt nghiệp Nguyễn Thị Thu – Líp CNSH – K1 Qua c¸c thÝ nghiƯm nghiên cứu tìm hiểu thông tin nghiên cứu tác giả nớc nớc Chúng tiến hành tập hợp số biện pháp phòng trừ bệnh virus ToMV CMV gây cà chua nh sau: - Sử dụng giống mang gen kháng mạnh, chọn hạt giống từ khoẻ, bÖnh Ba gen chÝnh (Tm – 1, Tm – , Tm 2) đà đợc dùng cho chơng trình nhân giống cà chua Sử dụng giống chứa gen Tm – vµ Tm – cã hiƯu cao phòng trừ virus ToMV - Các mô hình sản xuất cà chua trớc triển khai trồng cần phải kiểm tra ELISA hạt giống để loại bỏ lô hạt giống nhiễm virus ToMV, CMV - Virus trú bên nội nhủ thờng đợc hạn chế xử lý nhiệt cho hạt ngày 80 0C ngµy ë 700C (Broadbent, 1965; Laterrot vµ Decaunt, 1965) Xư lý nhiệt với nhiệt độ 780C ngày hạn chế đợc virus ToMV Việc xử lý không hởng đến chất lợng hạt - Xử lý hoá chất: Nhúng hạt vào dung dịch trisodium phosphat 20 theo tû lƯ 10% (w/v) (Alexander, 1960; Fry vµ Mccallum, 1960; Broadbent 1965b) Nhóng h¹t Sodium orthphosphate (10% giê) hc HCL 0,2N giê - Không sử dụng nguồn nớc bẩn, đặc biệt vùng nớc tới vùng sản xuất cà chua đại trà, có nguồn nớc tới chung Điều hạn chế đợc nhiều lan truyền virus từ bệnh sang khoẻ, từ ruộng nhiễm bệnh sang ruộng cha nhiễm bệnh - Phá huỷ tàn d thuộc họ cà, trồng mẫm cảm với ToMV Trớc trồng phải vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ cỏ dại, họ rau muối Tránh tiếp xúc với bị nhiễm bệnh Các bớc phòng trừ ToMV CMV nh sau: Kiểm tra virus ToMV CMV phơng pháp ELISA hạt giống 48 Báo cáo thực tập tốt nghiƯp Ngun ThÞ Thu – Líp CNSH – K1 Sản xuất trồng khu vờn cách ly, tốt nhà lới ngăn côn trùng động vật khác Giá thể treo giống nên xử lý nhiệt, giống đợc gieo khay giá thể để thuận tiện cho việc chăm sóc, vận chuyển hạn chế tối đa đợc vết thơng học Làm đất trồng bên đồng ruộng thật kỹ, thu gom kỹ bệnh đặc biệt nhổ bỏ cỏ dại trớc đem cà chua trồng Thờng xuyên làm cỏ tốt trình chăm sóc Trong trình chăm sóc cần hạn chế để dụng cụ lao động, quần áo tay chân nhiễm dịch bƯnh Sư dơng ngn níc tíi s¹ch, chđ u nớc tới từ nguồn nớc tự nhiên qua bể lọc, để hạn chế nguồn bệnh virus bệnh khác có nớc tới áp dụng hiệu biện pháp phòng trừ loại côn trùng gây hại cà chua, đặc biệt côn trùng gây vết thơng giới côn trùng c¸c vecto trun bƯnh cđa virus nãi chung 49 ... "Nghiên cứu bệnh ToMV, CMV hạt giống cà chua nhập số biện pháp xử lý" 1.2 Mục đích yêu cầu - Điều tra, giám định thành phần bệnh virus gây hại truyền qua hạt giống cà chua nhập khẩu, cà chua giống. .. liệu, nội dung phƯơng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tợng nghiên cứu - Hạt 35 loại giống cà chua - Bệnh virus khảm cà chua (Tomato mosaic virus ToMV) - Bệnh virus khảm dơng xỉ cà chua (Cucumber mosaic... đợc số ký chủ ToMV cà chua, cà pháo, cà độc dợc, cà bát, cà dại [6] - Ngô Bích Hảo (2003) kiểm tra 10/15 mẫu hạt giống cà chua thu thËp ë mét sè tØnh phÝa b¾c nhiƠm ToMV, giống Xanhpie (Pháp) ,