ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ HÒA TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CHO HAI ENZYME ENDOGLUCANASE (EGI, EGII) CỦA Trichoderma reesei TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris Chuyênngành: Vi Sinh Vật Học Mãsố: 60-42-40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUỐC BÌNH Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2012 Lời cảm ơn ―Đƣờng gần không không đến, Việc nhỏ không làm chẳng nên.‖ Cảm ơn Ba Mẹ cho sống, tình yêu niềm tin để vững bƣớc đƣờng mà chọn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM nhiệt tình dạy dỗ thổi niềm nhiệt huyết đam mê cho sinh viên suốt thời gian học tập trƣờng Tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quốc Bình dành nhiều thời gian hƣớng dẫn nghiên cứu giúp hoàn thành khóa luận Cảm ơn ThS Hồng Phƣớc Toàn nhiệt tình động viên giúp đỡ thực đề tài Đồng thời xin gởi lời cảm ơn tới anh Cƣờng, chị Thủy, chị Thuần, chị Hoa, hai em Hiếu Nga nhƣ bạn Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM, cảm ơn bạn Minh Phong lớp 05CS chia sẻ giúp đỡ Cảm ơn Ngƣời bạn đồng hành động viên chia sẻ với suốt thời gian qua Đặc biệt, Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Trung tâm CNSH TP HCM đồng ý cho triển khai cấp kinh phí thực nghiên cứu Với tất lòng, Tôi xin chân thành cảm ơn Trần Thị Hòa Luận văn thạc sĩ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm enzyme cellulase T reesei 10 Bảng 2.1 Các mồi sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối DNA plasmid pJET 1.2 33 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc .35 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt enzyme EcoRI NotI 35 Bảng 2.6 Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 43 Bảng 3.1 Kết sàng lọc nấm men tái tổ hợp môi trường YPD chứa kháng sinh G418 63 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải CMC chủng Pichia tái tổ hợp 66 vii Luận văn thạc sĩ DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Nồng độ protein ngoại bào môi trường nuôi cấy P pastoris theo thời gian cảm ứng biểu 67 Đồ thị 3.2 Đường chuẩn thể mối tương quan đường khử glucose độ hấp thụ OD540nm .70 Đồ thị 3.3 Hoạt tính endoglucanase EGI, EGII theo thời gian 71 viii Luận văn thạc sĩ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thành phần cấu trúc lignocelluloses thực vật Hình 1.2 Mô hình hoạt động cellulase Hình 1.3 Mô hình tác động hệ enzyme cellulase cellulose Hình 1.4 T reesei Hình 1.5 Cấu trúc vùng trung tâm xúc tác EGI 11 Hình 1.6 Mô hình cấu trúc CBD EGI T reesei .12 Hình 1.7 Mô hình cấu trúc 3D enzyme EGI EGII 14 Hình 1.8 Cơ chế thủy phân cellulase 16 Hình 1.9 Cơ chế trao đổi chéo vị trí AOX1 18 Hình 1.10 Cơ chế trao đổi chéo vị trí his4 19 Hình 2.1 Thang chuẩn DNA 23 Hình 2.2 Thang chuẩn protein 24 Hình 2.3 Bản đồ plasmid tạo dòng pJET1.2 25 Hình 2.4 Bản đồ plasmid biểu pPIC9K 26 Hình 2.5 Sơ đồ mô tả trình OE-PCR hai gen mã hóa EGI, EGII 31 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon gen egl1 egl2 .44 Hình 3.2 Kết điện di khuếch đại DNA đầy đủ egl1 egl2 45 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm tinh egl1 egl2 45 Hình 3.4 Cấu trúc plasmid pJET1.2-egl1 pJET1.2-egl1 48 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định dòng E coli DH5α mang plasmid pJET1.2-egl1 pJET1.2-egl2 với cặp mồi pJET-F/pJET-R 49 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra dòng E coli DH5α mang plasmid pJET1.2-egl1 pJET1.2-egl2 với cặp mồi 50 Hình 3.7 Điện di phản ứng cắt plasmid pJET1.2-egl1 pJET1.2-egl2 enzyme cắt EcoRI NotI 50 Hình 3.8 Cấu trúc plasmid pPIC9K-egl1 pPIC9K-egl2 58 v Luận văn thạc sĩ Hình 3.9 Kết điện di PCR khuẩn lạc xác định dòng E coli DH5α mang pPIC9K-egl1 pPIC9K-egl2 với cặp mồi AOX1F/AOX1R 59 Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt giới hạn plasmid pPIC9K-egl1 pPIC9Kegl2 enzyme EcoRI/NotI BspEI 60 Hình 3.11 Kết biến nạp plasmid pPIC9K-egl1 pPIC9K-egl2 vào P pastoris 62 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra sát nhập plasmid pPIC9K-egl1và pPIC9K-egl2 vào gen P pastoris GS115 64 Hình 3.13 Vòng phân giải CMC dòng P pastoris tái tổ hợp nhuộm với thuốc đỏ Congo 65 Hình 3.14 Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào P pastoris biểu EGI, EGII .68 Hình 3.15 Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào P pastoris tái tổ hợp EGII theo thời gian 69 Hình 3.16 Kết xác định hàm lượng protein EGI, EGII dịch nuôi cấy P pastoris tái tổ hợp thời điểm 96 .70 vi Luận văn thạc sĩ DANH MỤC VIẾT TẮT AOX: Alcohol Oxidase BSA: Bovine Serum Albumin BMGY : Buffered Glycerol-complex BMMY : Buffered Methanol-complex CBD: Cellulose Binding Domain CMC: Carboxylmethyl Cellulose DNS: 3,5-Dinitrosalicylic Acid EC: Enzyme Commission EGI: Enzyme Endoglucanase I EGII: Enzyme Endoglucanase II Kb: Kilobase kDa: Kilodalton LB: Luria Beteri MD: Minimal Dextrose Mut: Methanol Utilisation NCBI: National Center for Biotechnology Information OE-PCR: Overlap Extension PCR PDB RCDB: Protein Data Bank PCR: Polymerase Chain Reaction PDB/PDA: Potato Dextrose Broth / Potato Dextrose Agar SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TE buffer: Tris- EDTA buffer VTCC: Vietnam Type Culture Collection iv Luận văn thạc sĩ ĐẶT VẤN ĐỀ Nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt, vấn đề an ninh lƣợng biến đổi khí hậu… nguyên nhân khiến nƣớc giới tìm cách phát triển nguồn nguyên liệu thay thế, có nhiên liệu sinh học Chiến lƣợc phát triển bioethanol từ vật liệu hữu đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều quốc gia Tổng sản lƣợng bioethanol toàn giới ngày tăng lên, năm 2010 đạt 86,9 tỷ lít, tăng 75% so với năm 2007 (thống kê RFA, 2011) Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol chủ yếu từ tinh bột đƣờng, dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, đồng thời ảnh hƣởng đến vấn đề an ninh lƣơng thực Trong đó, lignocellulose từ rơm rạ, bã mía, vỏ bắp, khô, mùn cƣa,… phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp phổ biến, nguồn nguyên liệu đƣợc tận dụng sản xuất bioethanol mang lại nguồn lợi lớn mặt kinh tế góp phần giảm ô nhiễm môi trƣờng Điều kiện tiên để sử dụng lignocellulose sản xuất ethanol thu nhận hiệu sản phẩm thủy phân glucose từ cellulose, thành phần lignocellulose Tuy nhiên, sử dụng enzyme để thủy phân cellulose chi phí cho giai đoạn chủ yếu khâu sản xuất enzyme cellulase Do đó, nghiên cứu cải thiện hoạt tính phƣơng pháp thu nhận enzyme nhằm giảm chi phí sản xuất điều cần thiết T reesei đƣợc đánh giá sinh vật có khả tổng hợp cellulase với hoạt tính cao [23] Nhƣng công nghệ sản xuất enzyme cellulase nƣớc ta chủ yếu phƣơng pháp nuôi cấy bán rắn nên hiệu không cao khó áp dụng quy mô công nghiệp Ứng dụng tiến kỹ thuật di truyền vào sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp hƣớng nghiên cứu tiềm để thu nhận enzyme với sản lƣợng lớn Trên sở đề tài: ―Tạo dòng biểu gen mã hóa cho hai enzyme endoglucanase (EGI, EGII) Trichoderma reesei hệ thống nấm men Pichia pastoris” đƣợc tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả biểu hai gen egl1 Luận văn thạc sĩ egl2 T reesei hệ thống P pastoris Đây hai enzyme endoglucanase quan trọng hệ enzyme phân hủy cellulose T reesei Kết đề tài tiền đề cho nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ nguồn phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp, từ đó, hƣớng tới việc sản xuất bioethanol Nội dung đề tài bao gồm: - Thu nhận tạo dòng gen mã hóa cho enzyme endoglucanase I (egl1) endoglucanase II (egl2) từ nấm T reesei - Chọn lọc dòng nấm men P pastoris mang nhiều gen mã hóa egl1, egl2 - Kiểm tra khả biểu hoạt tính hai enzyme EGI, EGII dòng P pastoris mang gen tái tổ hợp CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn thạc sĩ Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Thạnh Phong, Hoàng QuốcKhánh cộng sự, H.Q (2007), "Thu nhận Enzyme cellulase Trichoderma reesei môi trƣờng bán rắn", Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 10(7), pp 17-24 Trần Thị Thành Thuần Nguyễn Đức Lƣợng(2010), "Nghiên cứu enzyme cellulase pectinase từ chủng Trichoderma viride Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê", Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 12(13), pp 50-56 Tài liệu tiếng Anh Abe, K and Yano, H (2009), "Comparison of the characteristics of cellulose microfibril aggregates of wood, rice straw and potato tuber", Cellulose, 16(6), pp 1017-1023 Aehle, W (2004), Enzymes in industry: production and applications, Germany: Vch Verlagsgesellschaft Mbh Alam, M., et al (1994), "Production and characterization of thermostable xylanases by Thermomyces lanuginosus and Thermoascus aurantiacus grown on lignocelluloses", Enzyme and Microbial Technology, 16(4), pp 298-302 Atanasova, L., et al (2010), "Clonal species Trichoderma parareesei sp nov likely resembles the ancestor of the cellulase producer Hypocrea jecorina/T reesei", Applied and Environmental Microbiology, 76(21), pp 7259-7267 Balamurugan, V., Reddy, G., and Suryanarayana, V (2007), "Pichia pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign proteins Vaccines", Indian Journal of Biotechnology, 6(2), pp 175186 71 Luận văn thạc sĩ Tài liệu tham khảo Bradford, M.M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Analytical biochemistry, 72(1), pp 248-254 Cereghino, J.L and Cregg, J.M (2000), "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris", FEMS Microbiology Reviews, 24(1), pp 45-66 10 Cline, J., Braman, J.C., and Hogrefe, H.H (1996), "PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases", Nucleic Acids Research, 24(18), pp 3546-3551 11 Delira, R.A., Mendoza, D.G., and Alarcón1, A (2008), "A rapid and versatile method for the isolation of total RNA from the filamentous fungus Trichoderma sp.", Annals of Microbiology, 58 (4), pp 761-763 12 Faber, K.N., et al (1995), "Methylotrophic yeasts as factories for the production of foreign proteins", Yeast, 11(14), pp 1331-1344 13 Ghose, T (1987), "Measurement of cellulase activities", International Union of Pure and Applied Chemistry, 59(2), pp 257-268 14 Harrison, M.D., et al (2011), "Accumulation of recombinant cellobiohydrolase and endoglucanase in the leaves of mature transgenic sugar cane", Plant Biotechnology Journal 15 Hartner, F.S and Glieder, A (2006), "Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts", Microbial Cell Factories, 5(1), pp 39 16 Heckman, K.L and Pease, L.R (2007), "Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension", Nature Protocols, 2(4), pp 924-932 17 Hikaru Nakazawa, et al (2011), "Construction of a recombinant Trichoderma reesei strain expressing Aspergillus aculeatusβ-glucosidase or efficient biomass conversion", Biotechnol Bioeng, (2012;109), pp 92–99 72 Luận văn thạc sĩ 18 Tài liệu tham khảo Hooker, B.S., et al (2001), Production of microbial cellulases in transgenic crop plants, ACS Publications 19 Huang, X.M., et al (2010), "Cloning and heterologous expression of a novel endoglucanase gene egVIII from Trichoderma viride in Saccharomyces cerevisiae", Applied Biochemistry and Biotechnology, 162(1), pp 103-115 20 Jayashri, T., Anuradha, R., and Punekar, N (2009), "Single-stranded megaprimer splicing through OE-PCR: Construction of full-length Aspergillus niger arginase cDNA", Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 46, pp 266-268 21 Kanokratana, P., et al (2008), "Identification and expression of cellobiohydrolase (CBHI) gene from an endophytic fungus, Fusicoccum sp.(BCC4124) in Pichia pastoris",Protein expression and purification, 58(1), pp 148-153 22 Kleywegt, G.J., et al (1997), "The crystal structure of the catalytic core domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei at 3.6 Å resolution, and a comparison with related enzymes1", Journal of molecular biology, 272(3), pp 383-397 23 Kubicek, C.P., et al (2009), "Metabolic engineering strategies for the improvement of cellulase production by Hypocrea jecorina", Biotechnology Biofuels, 2(1), pp 19-32 24 Kuhad, R.C., Gupta, R., and Singh, A (2011), "Microbial Cellulases and Their Industrial Applications", Enzyme Research, 2011 25 Kwon, I., et al (1999), "Heterologous expression and characterization of endoglucanase I (EGI) from Trichoderma viride HK-75", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 63(10), pp 1714-1720 26 Lee, T.M., et al (2011), "A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A", Protein Science, 20(11), pp 1935-1940 73 Luận văn thạc sĩ 27 Tài liệu tham khảo Li, Y., et al (2010), "An improved RNA isolation method for filamentous fungus Blakeslea trispora rich in polysaccharides", Applied Biochemistry and Biotechnology, 160(2), pp 322-327 28 Linder, M., et al (1995), "The difference in affinity between two fungal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution", FEBS letters, 372(1), pp 96-98 29 Liu, G., et al (2006), "Improvement of the cellulolytic activity of Trichoderma reesei endoglucanase IV with an additional catalytic domain", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22(12), pp 1301-1305 30 Macarron, R., et al (1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei", Biochemical Journal, 289(Pt 3), pp 867 31 Malherbe, S and Cloete, T.E (2002), "Lignocellulose biodegradation: Fundamentals and applications", Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 1(2), pp 105-114 32 Martinez, D., et al (2008), "Genome sequencing and analysis of the biomassdegrading fungus Trichoderma reesei (syn Hypocrea jecorina)", Nature Biotechnology, 26(5), pp 553-560 33 Mattinen, M.L., et al (1997), "Three‐dimensional structures of three engineered cellulose‐binding domains of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei", Protein science, 6(2), pp 294-303 34 Mattinen, M.L., et al (1998), "Solution structure of the cellulose‐binding domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei and its interaction with cellobioligosaccharides", European Journal of Biochemistry, 256(2), pp 279-286 35 McCarter, J.D and Stephen Withers, G (1994), "Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis", Current opinion in structural biology, 4(6), pp 885892 74 Luận văn thạc sĩ 36 Tài liệu tham khảo Miettinen-Oinonen, A and Suominen, P (2002), "Enhanced production of Trichoderma reesei endoglucanases and use of the new cellulase preparations in producing the stonewashed effect on denim fabric", Applied and Environmental Microbiology, 68(8), pp 3956 37 Montenecourt, B.S (1983), "Trichoderma reesei cellulases", Trends in Biotechnology, 1(5), pp 156-161 38 Mosier, N., et al (1999), "Reaction kinetics, molecular action, and mechanisms of cellulolytic proteins", Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, pp 23-40 39 Nakazawa, H., et al (2008), "Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli", Applied microbiology and biotechnology, 81(4), pp 681-689 40 Penttilä, M., et al (1986), "Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene", Gene, 45(3), pp 253-263 41 Pham, T., et al (2011), "Cloning, Expression, Purification, and Properties of an Endoglucanase Gene (Glycosyl Hydrolase Family 12) from Aspergillus niger VTCC-F021 in Pichia pastoris", Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(10), pp 1012 42 Polaina, J and MacCabe, A.P (2007), Industrial enzymes: structure, function and applications, Netherlands: Springer Verlag 43 Qin, Y., et al (2008), "Purification and characterization of recombinant endoglucanase of Trichoderma reesei expressed in Saccharomyces cerevisiae with higher glycosylation and stability", Protein Expression and Purification, 58(1), pp 162-167 44 Receveur, V., et al (2002), "Dimension, shape, and conformational flexibility of a two domain fungal cellulase in solution probed by small angle 75 Luận văn thạc sĩ Tài liệu tham khảo X-ray scattering", Journal of Biological Chemistry, 277(43), pp 4088740892 45 Romanos, M.A., Scorer, C.A., and Clare, J.J (1992), "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast, 8(6), pp 423-488 46 Rubin, E.M (2008), "Genomics of cellulosic biofuels", Nature, 454(7206), pp 841-845 47 Saloheimo, M., et al (1988), "EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme", Gene, 63(1), pp 11-21 48 Saloheimo, M., et al (1997), "cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast", European Journal of Biochemistry, 249(2), pp 584-591 49 Sandgren, M., Stahlberg, J., and Mitchinson, C (2005), "Structural and biochemical studies of GH family 12 cellulases: improved thermal stability, and ligand complexes", Progress in Biophysics and Molecular Biology, 89(3), pp 246-291 50 Seiboth, B., et al (1997), "Role of four major cellulases in triggering of cellulase gene expression by cellulose in Trichoderma reesei", Journal of Bacteriology, 179(17), pp 5318 51 Seiboth, B., Ivanova, C., and Seidl-Seiboth, V (2011), "Trichoderma reesei: A Fungal Enzyme Producer for Cellulosic Biofuels", Biofuel Production – Recent Developments and Prospects 52 Suominen, P.L., et al (1993), "High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei II Effects of deletions of individual cellulase genes", Molecular and General Genetics MGG, 241(5), pp 523-530 53 Tolan, J and Foody, B (1999), "Cellulase from submerged fermentation", Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, pp 41-67 76 Luận văn thạc sĩ 54 Tài liệu tham khảo Wilson, D and Irwin, D (1999), "Genetics and properties of cellulases", Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, pp 1-21 55 Young, L and Dong, Q (2004), "Two - step total gene synthesis method", Nucleic Acids Research, 32(7), pp e59 56 Zhao, X., et al (2008), "Molecular simulation evidence for processive motion of Trichodermareesei Cel7A during cellulose depolymerization", Chemical Physics Letters, 460(1-3), pp 284-288 77 PHỤ LỤC Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phụ lục I: Hóa chất Hóa chất điện di protein - Tris – HCl 1,5M (pH 8,8 6,8), 30% acrylamide - 0,5% bis acrylamide (giữ 4oC), SDS 1%, ammonium persulfate (APS) 10%, TEMED (N, N, N’, N’ tetramethylethylene diamine) (giữ 4oC) - Dung dịch điện di protein 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3) có thành phần: Tris – HCl 15,1g; glycine 94g; SDS 5g; nƣớc cất đủ lít - Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris - HCl pH 6,8 10ml; dithiothreitol 1,54g; SDS 0,4g; glycerol 4ml; bromophenol blue (dạng vết) pha 20ml dung dịch - Dung dịch nhuộm gel: coomassive brilliant blue 0,625g; glacial acetic 25ml; ethanol tuyệt đối 112,5ml pha lít dung dịch - Dung dịch giải nhuộm: methanol tuyệt đối 150ml; glacial acetic 100ml pha lít dung dịch Chuẩn bị thuốc thử DNS Pha dung dịch đệm citrate: - Citric Acid Monohydrate C6H8O7 H2O: 210 g - Nƣớc cất: 750ml - NaOH – chỉnh pH 4.3: 50-60 g Pha thành 1000ml kiểm tra pH đƣợc dung dịch đệm citrate 1M Có thể thêm NaOH pH =4.5 Khi pha loãng thành nồng độ 0.05 M pH 4.8 Pha thuốc thử DNS: Nƣớc cất : 1416ml 3,5-Dinitrosalicylic acid : 10.6 g NaOH : 19,8 g Hòa tan hỗn hợp sau thêm vào : Muối Rochelle (Na-K tartarate) : 306 g Phenol (nóng chảy 50°C) : 7,6ml Sodium metabisulfite : 8,3 g Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phụ lục II: Các quy trình thực Quy trình tách chiết DNA DNeasy mini plant Kit (Qiagen) Các bước ly tâm nhiệt độ 4oC - Cân mẫu thực vật (nấm) ≤ 100 mg, nghiền mẫu nitơ lỏng - Thêm 400µl Buffer AP1 4µl RNase A (100 mg/ml) 100 mg (sinh khối ƣớt) 20 mg (sinh khối khô), vortex nhanh mạnh - Ủ hỗn hợp 10 phút 65°C 2-3 phút đảo trộn lần Bƣớc giúp ly giải bào - Thêm 130µl Buffer AP2 để ly giải, trộn ủ phút đá Ly tâm phút, 14,000 vòng/phút - Hút dịch ly giải vào cột QIAshredder Mini spin, ly tâm 14,000 vòng/phút - Chuyển dịch qua cột sang tube - Thêm 1,5 thể tích Buffer AP3/E, trộn pipet - Hút 650µl hỗn hợp vào cột DNeasy Mini spin ly tâm phút 8000 vòng/phút, loại bỏ dịch qua cột (có thể lặp lại đến hết dịch ly giải) - Thêm 500µl Buffer AW vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm phút 14,000 vòng/phút để làm khô cột - Chuyển cột DNeasy Mini spin sang eppendorf mới, thêm 100µl Buffer AE trực tiếp vào màng cột DNeasy Ủ phút 15–25°C, ly tâm phút 8000 vòng/phút để thu DNA tổng số Cất giữ DNA -20°C Quy trình tinh DNA qua gel QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) Một số ý: - Màu vàng Buffer QG cho biết pH ≤ 7,5 - Thêm ethanol (96–100%) vào Buffer PE trƣớc dùng - Các bƣớc ly tâm 13.000 vòng/phút nhiệt độ phòng Luận văn thạc sĩ Phụ lục Quy trình thực hiện: - Cắt vùng gel agarose chứa đoạn gen mục tiêu dao bén - Cân miếng gel thêm Buffer QG: thể tích buffer thể tích gel (100 mg ~ 100µl) - Ủ 50°C 10 phút gel tan hoàn toàn (2-3 phút vortex lần để giúp gel tan tốt - Kiểm tra màu sắc hỗn hợp Nếu màu cam tím thêm dung dịch sodium acetate 3M pH 5,0 có màu vàng - Thêm thể tích iso-propanol, trộn - Đặt cột QIAquick spin vào tube 2ml Cho dung dịch gel hòa tan vào cột, ly tâm phút Loại bỏ dịch qua cột - Để rửa, thêm 0,5ml Buffer QG vào cột QIAquick, ly tâm phút Loại bỏ dịch qua cột - Thêm 0,75ml Buffer PE vào cột QIAquick để rửa cột, ly tâm phút Loại bỏ dịch qua cột - Ly tâm phút để làm khô cột chuyển cột snag eppendorf - Để ly giải DNA, thêm 30-50µl Buffer EB (10mM Tris·Cl, pH 8.5) nƣớc (pH 7.0–8.5) để ủ phút sau ly tâm phút thu DNA mục tiêu Cất giữ DNA -20oC - Điện di gel agarose để kiểm tra sản phẩm tinh chế qua gel Quy trình tách chiết plasmid DNA-spin™ Plasmid DNA Extraction Kit (Intron) - Lấy khuẩn lạc đơn từ đĩa vi khuẩn nuôi cấy nuôi mội tƣờng LB với kháng sinh phù hợp Nuôi cấy lắc qua đêm - Ly tâm 3-5ml dịch nuôi cấy 13,000 vòng/phút 30 giây nhiệt độ phòng thu sinh khối tế bào - Huyền phù tế bào 250µl Resuspension buffer, vortex dùng pipet không cặn - Ly tâm 13,000vòng/phút 10 4℃ Trong chờ đợi gắn cột vào tube Luận văn thạc sĩ - Phụ lục Sau ly tâm chuyển dịch vào cột ( xác bã tế bào, protein, DNA gen nằm phần tủa) Tránh phần tủa trắng - Ly tâm 13,000 vòng/phút 60 giây Chuyển cột sang tube - Thêm 700µl Washing buffer B, ly tâm 13,000 vòng/phút 60 giây - Loại bỏ dịch qua cột Ly tâm 13,000 vòng/phút 60 giây để làm khô màng - Đặt cột vào tube vô trùng 50µl Elution buffer nƣớc cất để yên phút sau ly tâm 13,000 vòng/phút 60 giây Luận văn thạc sĩ Phụ lục Phụ lục III: Các bảng biểu Bảng 1: Chiều dài sản phẩm PCR STT Tên cặp mồi Chiều dài trình Ta tự (bp) (oC) CEL1F/ RX1E1 722 60,0 FX2E1/ RX23E1 630 60,0 CEL1F/ RX23E1 1332 60,0 CEL2F/RX1E2 298 55,0 FX2E2/CEL2R 948 60,0 CEL2F/CEL2R 1212 60,0 E1-623F/CEL1R 692 60,0 CEL2F/E2-460R 468 55,0 pJET-F/pJET-R (egl1) 1451 60,0 10 pJET-F/pJET-R (egl2) 1331 60,0 11 AOX1F/ AOX1R (egl1) 1801 54,0 12 AOX1F/ AOX1R (egl2) 1681 54,0 Luận văn thạc sĩ Phụ lục Bảng Độ hấp thu 595nm nồng độ BSA khác Nồng độ BSA 10 20 30 40 60 80 (µg/ml) OD595nm 0.033 0.067 0.96 0.174 0.255 0.344 0.394 0.457 ±0.002 ±0.008 ±0.001 ±0.012 ±0.013 ±0.024 ±0.028 ±0.001 Bảng Nồng độ protein tổng số dòng nấm men tái tổ hợp sau 96 nuôi cấy (µg/ml) Thời gian 24 48 72h 96 0,00 29,88 108,29 123,42 139,95 ± 23,47 ± 11,65 ± 19,58 ± 8,46 ± 41,79 0,00 9,83 40,27 71,64 118,38 ± 10,62 ±19,79 ± 16,96 ± 27,36 ± 42,57 0,00 64,96 117,43 124,40 171,85 ± 5,06 ±25,63 ±26,68 ± 31,81 ±41,34 0,00 107,37 133,81 164,76 222,16 ± 10,15 ± 14,66 ± 9,56 ± 8,92 ± 27,36 0,00 0,00 27,13 23,63 29,75 ± 12,20 ± 9,09 ± 5,98 ± 8,12 ± 11,03 Mẫu E1.45 E1.100 E2.76 E2.83 NC Trong NC đối chứng âm (nấm men mang vector pPIC9K không tái tổ hợp) Luận văn thạc sĩ Phụ lục Bảng Độ hấp thu 540 nm nồng độ D-glucose khác Dglucose 0,063 0,125 0,200 0,333 0,400 0,500 0,667 1,000 0,018 0,041 0,102 0,201 0,201 0,289 0,361 0,533 (mg) OD540nm ±0,004 ±0,004 ± 0,006 ± 0,023 ±0,019 ±0,003 ±0,003 ±0,003 Bảng Hoạt tính endoglucanase phương pháp DNS (UI/ml) Thời gian 24 48 72 96 0,00 0,14 0,18 0,22 0,22 ± 0,02 ± 0,04 ± 0,07 ± 0,08 ± 0,15 0,00 0,13 0,16 0,20 0,18 ± 0,03 ± 0,07 ± 0,06 ± 0,09 ± 0,10 0,00 0,69 0,82 0,91 1,04 ± 0,03 ± 0,02 ± 0,05 ± 0,11 ± 0,10 0,00 0,70 0,81 0,83 0,99 ± 0,04 ± 0,06 ± 0,08 ± 0,04 ± 0,10 0,00 0,01 0,03 0,04 0,04 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,03 ± 0,01 ± 0,02 Mẫu E11.45 E11.100 E23.76 E23.83 Đối chứng [...]... thời kì chiến tranh thế giới thứ hai [32] Hiện nay bộ gen của T reesei đã đƣợc giải mã với kích thƣớc 34Mbp và 9129 gen mã hóa [32] Các thông tin từ bộ gen đƣợc giải mã của T reesei tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu chuyên sâu về loài nấm này 1.4.2 Hệ enzyme cellulase của T reesei T reesei là loài nấm sợi quan trọng trong sản xuất enzyme cellulase Nhiều nghiên cứu cho thấy đây là sinh vật có khả... năng biểu hiện các trung tâm hoạt động EGI, EGII, EGIII của T reesei trong E coli [39] Tuy nhiên, do không có khả năng biến đổi cấu trúc protein sau dịch mã nên hoạt tính enzyme của nấm mốc giảm khi biểu hiện trong hệ thống này Nhiều nhóm tác giả đã thành công trong nghiên cứu tạo dòng biểu hiện endoglucanase của Trichoderma trong nấm men nhƣ: egl4 [48], egVIII [19] Ganiger và cộng sự (2008) đã tạo dòng. .. cộng sự (2011) đã tạo dòng biểu hiện endoglucanase (EglA) của Aspergillus niger VTCC-F021 trên hệ thống P pastoris, hoạt tính đạt 16.24 UI/mg cao hơn so với EglA hoang dại là 14.1 UI/mg [41] Dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về khả năng sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp cũng nhƣ khả năng duy trì hoạt tính enzyme của nấm Trichoderma cho thấy P pastoris là một hệ thống biểu hiện tiềm năng để... dòng biểu hiện β-1, 6 endoglucanase của T harzianum ở S cerevisiae Quin và cộng sự (2007) đã biểu hiện egl2 của T reesei trên Saccharomyces cerevisiae; EGII thu đƣợc có trọng lƣợng phân tử 54kDa cao hơn EGII tạo bởi T reesei 48kDa và còn 88% hoạt tính endoglucanase [43] Đối với hệ thống P pastoris, trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã gặt hái nhiều thành công trong việc biểu hiện các enzyme hệ. .. CL-847 [37] Với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền, vi sinh vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất các enzyme tái tổ hợp nhằm sản xuất ở quy mô lớn Enzyme cellulase từ nấm mốc đã đƣợc tạo dòng biểu hiện trên nhiều hệ thống tế bào khác nhau nhƣ: vi khuẩn E coli, nấm men S cerevisae, nấm men P pastoris Kwon (1999) đã tạo dòng biểu hiện egl 1của T viride HK-75 vào E coli với kết quả protein thu... Trichoderma reesei Hình 1.4 Trichoderma reesei a: Nấm T reesei sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA [6]; b: sợi nấm T reesei T reesei (dạng teleomorph Hypocrea jecorina) thuộc ngành nấm túi (Ascomycota) Nấm T reesei đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme công nghiệp nhƣ cellulase và hemicellulase nhằm phân hủy các polysaccharide của vách tế bào thực vật T reesei đƣợc Reese và Mandel phát hiện. .. trình phân hủy cellulose [51] Nhƣ các sinh vật khác, các enzyme cellulase của T reesei cũng đƣợc điều hòa ở nhiều cấp độ khác nhau nhƣng hầu hết vẫn ở mức phiên mã Theo Ilmen (1997) và Foreman (2003), các gen mã hóa các enzyme cellulase khác nhau đƣợc đồng điều hòa biểu hiện, nghĩa là ở tất cả các môi trƣờng chúng đều biểu hiện với tỉ lệ tƣơng đối nhƣ nhau Sự điều hòa biểu hiện cellulase theo nguồn carbon... vùng liên kết đã làm giảm mạnh hoạt tính của Cel7A [44, 56]  Endoglucanase I Endoglucanase I (EGI/Cel7B) của T reesei thuộc họ enzyme glycoside hydrolase 7 (GH7) Trình tự gen mã hóa enzyme EGI của T reesei VTT-D-80133 công bố trên ngân hàng gen (NCBI) với mã số M15665.1 [40] có kích thƣớc gen 1527bp với 3 exon và 2 intron và mRNA là 1380 nucleotide EGI của T reesei có chiều dài 437 amino acid (aa)... ứng biểu hiện trên hệ thống nấm men P pastoris bằng methanol thì cần đảm bảo các điều kiện an toàn vì methanol là một độc tố và có thể gây cháy nổ 1.6 Tình hình nghiên cứu thu nhận enzyme cellulase tái tổ hợp trong và ngoài nƣớc 1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Khởi đầu cho nghiên cứu về cellulases của Trichoderma là Reese và Mandel trong thời kỳ chiến tranh thế giới thứ hai Nhóm nghiên cứu của. .. trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của P pastoris - Có trình tự promoter AOX1 tƣơng đồng với trình tự của AOX1 trong bộ gen của Pichia giúp chuyển trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào - Có trình tự gen kháng Ampicillin dùng để sàng lọc tế bào E.coli tái tổ hợp - Có gen Tn903 giúp Pichia kháng lại Genticin dùng để chọn lọc tế bào Pichia tái tổ hợp đồng thời xác định tƣơng đối số bản sao của gen đƣợc ... Thu nhận tạo dòng gen mã hóa cho enzyme endoglucanase I (egl1) endoglucanase II (egl2) từ nấm T reesei - Chọn lọc dòng nấm men P pastoris mang nhiều gen mã hóa egl1, egl2 - Kiểm tra khả biểu hoạt... truyền vào sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp hƣớng nghiên cứu tiềm để thu nhận enzyme với sản lƣợng lớn Trên sở đề tài: Tạo dòng biểu gen mã hóa cho hai enzyme endoglucanase (EGI, EGII) Trichoderma. .. Trichoderma reesei hệ thống nấm men Pichia pastoris đƣợc tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả biểu hai gen egl1 Luận văn thạc sĩ egl2 T reesei hệ thống P pastoris Đây hai enzyme endoglucanase